CN104830829A - 一种新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术的构建及其应用 - Google Patents

Abstract

一种新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术主要包括基于显色法的产糖醇菌株高通量筛选和基于双荧光染色的融合细胞高效流式分选。该技术可以实现产糖醇酵母的高效基因组重排与筛选，具有简便，低成本，高效，实用等特点。应用该技术成功实现了对天然产糖醇异常毕赤酵母高效快速地改造，糖醇产量提高34%以上。

Description

一种新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术的构建及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术和该技术在产糖醇异常毕赤酵母 (Pichia anomala) 基因组改造中的应用。

背景技术

糖醇是指糖类的醛、酮羰基被还原为羟基后生成的多元醇，通式 H(CHOH)_n+1H，由于加氢作用而失去了还原性，每个碳原子上会连有一个羟基。它们具有很多独特的性质，例如在机体内的代谢能量较低，可防治牙齿龋变，与低胰岛素代谢响应，因此，是一类重要的功能性食品原料。此外，糖醇在医药领域，化工领域以及动物营养等方面也具有更多的应用。在医药领域，它们是药物合成的重要中间体，广泛用于阿糖胞苷、阿拉阿糖腺苷、D-核糖、L-核糖、去氧核糖、L-阿拉伯糖等的合成原料。如D-阿拉伯糖醇的衍生物1，4-二脱氧-1，4-亚胺基-D-阿拉伯糖醇是α-葡萄糖苷酶的抑制剂，可防治艾滋病。糖醇还可以作为运输介质，以通过血脑屏障。另外，在化工方面，可以有机合成制取醇酸树脂和表面活性剂，糖醇是高分子发泡材料合成的激活剂，可用做显影材料的稳定剂，还可增强铝电容器在高温下的可靠性以及提高电解质溶液的黏度等。因而，糖醇作为一类高附加值产品已广泛应用于食品、医药、化工、皮革、涂料以及国防等行业。其中，D-阿拉伯糖醇与木糖醇是研究较多的一类多功能五碳糖醇，2004年被美国能源部（DOE）列为12类高附加值生物基化学品之一。

目前糖醇的主要生产方法有：自然提取法、化学合成法及生物合成法。糖醇广泛存在于自然界植物中，但含量很少，提取困难，直接提取不经济。化学合成法在高温高压条件下催化加氢得到糖醇，该方法过程较复杂、设备投资大、安全要求高、操作费用高、污染较严重、底物要求高等。生物合成方法具有安全、高效、绿色等潜在优势，其反应条件温和，并显示出严格的对映选择性或区域选择性，还避免了化学合成法所需高温高压反应条件和昂贵的催化剂，节省能源消耗。作为一种重要催化载体，微生物在化学品生物合成中的应用越来越广泛。糖醇生物合成主要是利用产糖醇的微生物发酵或转化葡萄糖、木糖以及木糖母液等生物质原料，关于微生物制造多功能糖醇的研究已经广泛开展，主要包括产糖醇代谢工程菌株的构建以及天然产糖醇微生物的筛选与改造。随着生物技术的不断发展与成熟，微生物发酵工业得到快速发展，其中工业菌种性能的改良是重要推动力。然而，工业菌株的高产、高耐性等优良特性是由大量基因共同决定的，而大多数工业微生物菌株改良所面临的问题。虽然理化诱变等传统育种手段在工业微生物菌种改良中发挥了重要作用，但它们需要与现代育种手段相结合才能发挥更高的育种工作效率。

基因组改组技术(Genome shuffling)是一种典型的全面组合技术手段，是全基因组代谢工程的延伸，可以快速、高效地筛选出优良菌株，作为的重要基因组工程技术在进化工程得到广泛的应用。Stemmer等提出了全基因组改组技术，它是一种建立在传统诱变育种、细胞融合与高通量筛选基础之上的体内分子育种新技术，使诱变过程中产生的丰富的基因组（多种突变表型），由原生质体融合而发生大片段改组。随后，经过选择，使多种正向突变在融合菌株中积累，加速获得目的性状的突变菌株，消除传统诱变步步积累的繁琐、低效以及积累大量有害突变的缺点。

发明内容

本发明属生物技术领域，构建了一种新型高效的产糖醇酵母基因组重排技术，并成功应用于产糖醇酵母的菌种改造，提高了重组与筛选效率。

在前期研究中，我们获得一株产糖醇Pichia anomala TIB-x229（CGMCC No. 5482），可以高效利用不同糖底物生产D-阿拉伯糖醇，木糖醇和核糖醇。为了进一步提高该菌株的糖醇生产性能，首先构建了基于高通量的高碘酸盐-糖醇比色法筛选技术和荧光染料标记的酵母原生质体融合子筛选技术的高效基因组重排技术，将其应用于对产糖醇异常毕赤酵母的改造，极大地提高了基因组重排效率，加速了菌株性能的改良，获得一株高产糖醇异常毕赤酵母重组菌株 (Pichia anomala TIBG2-3)，其糖醇产量提高34%，已于2014年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC），保藏号为CGMCC No. 10260，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明与现有技术比，有如下特点：

1. 构建优化了糖醇比色检测方法，实现了高通量筛选。糖醇检测浓度在0-16 g/L时具有良好的线性关系，并且残余底物和副产品如葡萄糖，乙醇对糖醇检测无干扰。此外，显色法与高效液相色谱法一致性较好，适合于产糖醇菌株的高效准确筛选。因此，该显色方法具有操作简单，高效筛选，安全系数高，成本低等优点，在多羟基醇的高效筛选中具有实际应用价值。

2. 构建优化了荧光染料标记的酵母原生质体融合子筛选策略，实现酵母融合子的高效融合筛选，为缺少遗传标记的天然酵母原生质体融合提供高效方法。

3. 整合上述构建的两种方法，构建高效的产糖醇酵母基因组重排技术，并在天然异常毕赤酵母中得到成功的应用，短时间内提高糖醇产量34%以上。

附图说明

附图1：高碘酸盐-糖醇比色法标准曲线及干扰实验结果  A. 比色法糖醇筛选流程图；B. 比色法标准曲线；C. 不同浓度底物与代谢产物对糖醇检测的干扰；D. 比色法与高效液相色谱法在糖醇检测中的比较

附图2：基于荧光染料标记的原生质体融合流式分析分选。A. 空白酵母原生质体；B. 红色荧光核酸染料标记的原生质体；C.绿色荧光核酸染料标记的原生质体；D. 双荧光染料标记的原生质体。R表示不同激发光与发射光的筛选通道

附图3：一种新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术流程图

附图4：野生型，突变体与重组异常毕赤酵母菌产糖醇性能评价

        具体实施

以下为列举的实施例，以便于更好地理解本发明。

        实施例        1        ：

高效糖醇比色筛选方法的构建与优化：

分别配制4, 6, 8, 10, 12, 14, 16（g/ L）D-阿拉伯糖醇标准溶液，分别取20μl标准溶液加入深孔板，然后加入500μl高碘酸钾溶液。混合后室温放置10分钟，然后加入400μl 1% L-鼠李糖溶液，中和多余的高碘酸盐离子。经过进一步混合后，加入600μl Nash试剂，在63℃条件下反应20分钟。冷却后，转移200μl反应液至浅孔板，检测其在412nm处的吸光值，制作标准曲线。根据上述方法，取20μl待测样品进行检测，可根据OD₄₁₂判断糖醇积累。

多元糖醇在酸性条件下(pH1.0)被高碘酸盐氧化生成甲醛，残余高碘酸被L-鼠李糖中和。然后Nash试剂与甲醛反应，产生黄色3，5-二乙酰-1，4-脱氢二甲基吡啶，其最大在吸收峰值在412nm处（图1a）。结果表明，当D-阿拉伯糖醇浓度在0-16 g/L时，标准曲线具有良好的线性关系（图1b）。而当D-阿拉伯糖醇浓度达到20 g/L时，糖醇线性关系有一定影响，但是仍存在正相关性，因此，该比色法糖醇筛选浓度范围为0-20 g/L，极大的拓展了显色法筛选的应用范围。

为了分析底物与副产物对糖醇筛选的影响，我们进行了对不同浓度葡萄糖和乙醇的干扰实验。结果表明：不同浓度的葡萄糖和乙醇 (1-30 g/L)对检测值并没有干扰。此外，为了进一步评估显色法在生物转化检测中的应用，将该方法和高效液相色谱法进行了比较。结果表明，两种检测方法的一致性较好，从而进一步证明了优化后的比色法是适合于产糖醇菌株的高效筛选。由于在96深孔培养板的条件限制，糖醇产量整体偏低，浓度范围低于10 g/L，因此，优化后比色法可用于高效的高产糖醇菌株筛选。

接下来，通过高效的显色法筛选到一株产D-阿拉伯糖醇菌株TIB-x229，其菌落具有以下特征：圆形凸起，边缘整齐，表面光滑湿润，较粘稠，呈不透明乳白色，菌落颜色和质地均一，可形成子囊孢子。光学显微镜下观察发现：细胞呈球形或椭球形，体积较小，出现类似于液泡组织，具有典型的酵母菌特征。

将筛选得到的高产糖醇酵母菌TIB-x229进行进一步地18S rDNA分子生物学鉴定，与NCBI数据库中Pichia anomala KCTC7104 (登录号AY251638) 序列相似性达到了99%。菌落外观、细胞形态及其分子生物学特征均表明，菌株TIB-x229的分类应属于异常毕赤酵母Pichia anomala，并保存于中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC5482。

        实施例        2

构建基于双荧光染料标记的酵母原生质体融合筛选方法：

在酵母原生质体融合中，当两个含有互补遗传标记的酵母菌株融合后，它们的融合子可以在选择性培养基上生长。然而，许多工业酵母菌株，由于缺乏选择性遗传标记，不能实现遗传标记的互补筛选[12]。为了解决这个问题，荧光激活细胞分选 (fluorescence activated cell sorting, FACS)作为一种有效的方法被应用于融合细胞筛选。在这种方法中，亲本菌株被不同荧光染料标记，然后利用流式细胞仪筛选含有重叠荧光染色的融合子。该技术目前得到一些应用，但尚未形成系统性的方法 [13 -15]。

在本发明中，首先制备不同亲本酵母原生质体各1.0ml，分别利用0.25μM Nuclear Green和0.1μM Nuclear Red进行染色，室温放置15min，然后使用高渗缓冲液洗涤两次，然后混合于无菌离心管中，1500rpm/min离心10min，弃去上清液，用高渗缓冲液离心洗涤二次，除酶。向菌体沉淀中加入0.2m1原生质体稳定液，混合后加入1.8m1 40% PEG，轻轻摇匀，30℃水浴保温5-15min，离心去除上清PEG，用原生质体稳定液稀释后迅速通过流式细胞仪，利用488蓝激光器与FL1，641红激光器与FL8进行双阳性分析并分选，结果如图 (图2)。将获得双阳性细胞分选后混合涂布于固体再生基本培养基，30℃培养96h后，挑选单菌落进行显色法糖醇初步筛选。

菌株目标表型是通过递归原生质体融合获得的，而原生质体高效融合是整个过程的关键步骤。为了简化融合子的筛选，营养缺陷型，耐药性等遗传标记在构建融合子库的过程中往往是必要的[24，25，21]。但是营养缺陷型等遗传标记又会影响菌株生理和新陈代谢，造成在生产过程中菌株性能的下降。在本发明中，荧光激活细胞流式分选发展为一个重要的方法，实现了无遗传标记条件下的基因组重排。此外，该方法还可用于其它微生物的基因组改组。特别是在遗传背景不清楚和缺少成熟遗传操作的非传统菌株。

        实施例        3

一种新型基因组重排技术在产糖醇菌株异常毕赤酵母改良中的应用：

为了进一步有效提高酵母糖醇生产性能，以传统诱变育种方法获得的菌株（U-7，9与A-1，4）为出发菌，利用构建的新型基因组重排技术，将不同高产糖醇菌株进行组合重排，筛选优良性能菌株，具体流程如图3。首先，菌种在YPD 液体培养基活化培养12h至对数生长期后，进行去除细胞壁，选择2.5%的蜗牛酶溶液30℃处理3h后，通过镜检和涂板观察，此时具有较好的原生质体形成率与再生率。接下来，将制备好的原生质体细胞进行了不同荧光染料标记（Nuclear Green 与Nuclear Red），使双亲原生质体分别带上不同的荧光色素，以 PEG6000为促融剂条件下，进行原生质体融合。融合完成后，利用流式细胞仪快速筛选，筛选进行到双阳性融合子涂板培养。通过高效的显色法糖醇初筛和高效液相法复筛，获得高糖醇产量菌株，进行下一轮融合筛选，最终获得优良性状的目标菌株。

本发明中，我们通过构建高效的糖醇显色筛选与荧光标记融合子筛选方法，发展了新型的高效基因组重排技术。以传统诱变育种筛选到的4株菌株为出发菌，通过两轮重组后，共得到6株糖醇产量明显提升的菌株，对其进行了综合评价。结果显示：第一轮原生质体融合后，通过筛选，获得糖醇产量提高的3株重组菌，其中最大产量达到43.7g/l，较野生型菌株提高24.9%，较出发菌株提高10.8%；通过第二轮重组后，糖醇产量提高到47.1g/l，较野生型提高34.6%，较第一轮重组菌株也有7.8%的提高（图4）。因此，相比较传统诱变育种方法，本发明中的基因组改组技术实现了更为快速高效的菌株进化。

Claims (9)

1. 一种新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术及其应用，其特征为构建了基于高通量糖醇比色筛选与荧光标记流式分选技术，实现天然产糖醇酵母的高效基因组重排，获得高效菌种，提高糖醇生产能力和效率。

2. 如权利要求1所述的新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术，其特征在于可以用于产糖醇酵母的优化选育，并且也可以应用于其它产多元醇微生物的优化选育。

3. 如权利要求1所述的新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术，其特征在于首先通过传统的紫外照射和低温等离子体诱变方法，处理野生型产糖醇酵母，构建突变体库。

4. 如权利要求1所述的新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术，其特征在于分别利用高碘酸盐-糖醇比色法和高效液相色谱法对产糖醇酵母突变体库进行高通量初筛和复筛，筛选构建高产糖醇亲本库。

5. 如权利要求4所述的高碘酸盐-糖醇比色筛选方法，其特征在于高碘酸盐与多羟基醇室温条件下反应10-20min生成甲醛，甲醛与Nash试剂在50-55℃条件下发生显色反应，利用酶标仪测定其多羟基醇含量，整个过程均在微孔板内进行，操作简便快速。

6. 如权利要求1所述的新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术，其特征在于以亲本库酵母为出发菌株，制备原生质体，利用不同核荧光染料分别进行染色标记处理，将标记后的原生质体进行诱导融合，通过流式细胞仪实现融合子高效筛选，利用糖醇比色法对融合子进行筛选。

7. 如权利要求6所述的产糖醇酵母菌株荧光标记流式融合分选技术，其特征在于荧光标记流式分选技术中所用为微量活细胞核染料，并且可以应用于其它天然无遗传筛选标记酵母的原生质体融合与筛选。

8. 如权利要求1所述，应用构建的新型产糖醇酵母菌株基因组重排技术，通过多轮递归重组，获得一株高产糖醇重组菌株Pichia anomala TIBG2-3，糖醇产量提高32%以上，其特征在于所用含糖底物为葡萄糖，木糖，混合糖或玉米芯水解液。

9.其中生物转化条件为：反应温度为18-45℃，最适温度为25-40℃；反应时间为12-200小时，最适时间为18-120小时。