CN104830716A - 微杆菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株微杆菌及其在丹参毛状根培养体系中的应用。具体而言：本发明公开了一种微杆菌，为Microbacterium arborescens LG2，其保藏号为：CCTCC NO:M 2015083。该微杆菌的用途是：促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B的积累；以及促进丹参毛状根增重。

Description

微杆菌及其用途
技术领域
本发明涉及一株微杆菌及其在丹参毛状根培养体系中的应用。
背景技术
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)又名赤参，紫丹参，红根等，为唇形科植物，其干燥根和根茎可入药。其作为药材使用的记录，最早见于《神农本草经》，而后在梁朝、唐朝、五代以及明朝的中医药著作中也都有对丹参入药的记载。分布在我们的河北、山西、陕西、山东、河南、江苏、浙江、安徽、江西及湖南等地，在日本也有丹参的分布。丹参具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神等作用。丹参根主要含脂溶性的二萜类成分和水溶性的酚酸成分，还含黄酮类，三萜类，甾醇等其他活性成分。起初人们对脂溶性丹参酮类物质的药理研究相对较多，但现在水溶性的酚酸类成分也越来越受到人们的重视。水溶性的酚酸类物质主要有咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B、肉桂酸、丹参素等。研究表明水溶性成分具有不同于脂溶性成分的活性(包括抗氧化、神经保护、保护心脏、保护血管、治疗二型糖尿病及抗细胞凋亡等)。因此丹参的市场需求日益增大，而丹参约80％为野生资源，且有效活性成分不稳定，生长周期长，远远不能满足市场的需求。又由于人们长期过度采挖导致资源日渐萎缩；人工栽培又面临无良种、品质退化、生产周期长、种子带病与农药残留超标，在不同环境下生长，其药效成分组成和含量有很大差异、临床治疗上不稳定等问题。毛状根的培养技术可以大量生产丹参药材资源、改良丹参品质、并大幅提高丹参药效成分产量、质量及稳定性。但目前所建立起来的丹参毛状根培养系统仍存在着活性产量低的问题，从而影响培养的进一步放大和工业化。
因此，筛选能够更有效提高丹参毛状根活性成分含量的诱导子具有非常重要的意义。能够诱导植物产生次生代谢物的物质叫做诱导子(Elicitor)，如酵母提取物等生物诱导因子和金属离子等非生物诱导因子。在生物或者非生物因子的诱导下，植物的抗逆性会增强，同时促进植物次生代谢物质的积累。将微生物诱导子接入毛状根，是提高并获得丹参毛状根有效成分含量的崭新途径，从而解决当前丹参的质量控制问题和丹参栽培中面临的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种微杆菌，该菌株可促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B的积累。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种微杆菌，为Microbacterium arborescens LG2，其保藏号为：CCTCC NO:M 2015083。
本发明还提供了上述微杆菌的用途：促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B的积累。
作为本发明的微杆菌的用途的改进：促进丹参毛状根增重。
该微杆菌Microbacterium arborescens LG2是发明人从丹参植株中采用平板稀释法分离得到的一株内生细菌，经鉴定其发酵液和菌体具有促进丹参毛状根迷迭香酸和丹酚酸B成分积累的作用。
分离方法为：
1)、将丹参的根经表面消毒处理后，加入无菌水进行研磨稀释，涂布于营养琼脂上，于28～32℃培养1～3天；
营养琼脂配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂18g和蒸馏水1000mL，pH＝7.2～7.4。
2)、挑取单菌落于相同的营养琼脂平板划线纯化，于28～32℃培养1～3天；
3)、重复步骤2)，直至获得纯培养物。
本发明的微杆菌的保藏信息具体如下：Microbacterium arborescens LG2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2015083，保藏时间2015年3月4日。
本发明的微杆菌--Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M 2015083)在营养琼脂培养24h后菌落呈圆形，表明光滑，菌落较小，边缘整齐，产橙黄色色素。
该菌株革兰氏染色阳性，好氧，细杆状，不产芽胞；过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性；在生长温度为20～40℃、pH值为6.0～8.0的环境中生长良好；能代谢葡萄糖产酸；产生硫化氢，能水解明胶，不能水解淀粉。
该Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M 2015083)的16S rDNA序列分析表明，与Genbank国际数据库中记录的菌株Microbacterium arborescens的相似性为99％。
Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M 2015083)在丹参毛状根培养体系中作为诱导子促进迷迭香酸和丹酚酸B积累的作用。
本发明的Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M 2015083)，其菌体诱导子可促进毛状根迷迭香酸含量提高183％,丹酚酸B含量提高69％；菌液诱导子可促进毛状根迷迭香酸含量提高7％,丹酚酸B含量提高105％，而鲜重增加20％。对人畜无毒无害，对环境不造成污染。可在丹参毛状根培养中得到应用，产生一定的经济效益。
本发明的微杆菌在用于促进丹参毛状根酚酸类物质积累时，只需将Microbacteriumarborescens LG2(CCTCC NO:M 2015083)在营养肉汤培养基中培养后，离心收集的上清液及菌体可分别作为诱导子接于丹参毛状根培养基中，即可促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B含量的增加。
本发明的有益效果主要体现在：利用本发明提供的Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M 2015083)发酵上清液和菌体的诱导子，添加到丹参毛状根培养体系中即可提高迷迭香酸和丹酚酸B的含量，进而提高总酚酸类的含量，所诱导的丹参毛状根能用于迷迭香酸和丹酚酸B单品的提取。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M 2015083)分离培养方法如下：
1、于四川中江采集野生丹参植株，根部洗净后25KHz超声波处理5分钟；
2、在无菌条件下，对步骤1所得的材料用灭菌去离子水冲洗3次，并分别用75％(v/v)的酒精和3％(m/V)次氯酸钠溶液表面消毒，从而杀灭供试材料表面微生物；
3、在无菌环境中，将步骤2所得的供试材料用无菌水冲洗3次，取100μl最后1次冲洗的无菌水冲洗液涂布接种于营养琼脂培养基上，30℃培养24h后，进行无菌验证。
如无菌落产生，则继续后续的步骤4；如有菌落产生，则返回步骤2继续表面消毒处理。
营养琼脂培养基为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂18g和蒸馏水1000mL，pH＝7.2～7.4。
4、在超净台中，取处理好的丹参根样品1～2g，在无菌研钵中充分研磨，并加入5mL无菌水，混匀，静置15min，取100μl上清稀释涂布于营养琼脂培养基中，置28～32℃(较佳30℃)培养1～3天；
5、挑取步骤4中所产的单菌种于相同培养基(营养琼脂培养基)划线纯化分离，置于28～32℃(较佳30℃)培养1～3天，继续挑取单菌落；
重复上述操作直至得到纯培养为止。
6、将步骤5中所得到的单菌落进行16s rDNA序列测定，经序列比对，确定菌株，并保藏。得Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M 2015083)。
实施例2、Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M 2015083)诱导子制备方法，依次进行以下步骤：
1、Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M 2015083)转接于营养琼脂斜面，30℃培养2天；
营养琼脂斜面为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂18g和蒸馏水1000mL，pH＝7.2～7.4。
2、用接种环挑取一环步骤1所得的斜面菌种，接种于含50ml营养肉汤培养基的250ml三角瓶中，于28℃以220rpm培养72h，得Microbacterium arborescens LG2CCTCC M 2015083发酵原液；
营养肉汤培养基为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g和蒸馏水1000mL，pH＝7.2～7.4。
上述步骤1和步骤2均在自然光条件下培养。
3、取步骤2所得发酵原液，于4℃，12000rpm，离心2min，取上清过0.22μm微孔滤膜，所得滤液为Microbacterium arborescens LG2 CCTCC M 2015083的上清液诱导子(亦称菌液诱导子)。
上述离心所得的菌体沉淀去离子水清洗3次，重悬于50mL去离子水，121℃，高压灭菌20min。灭菌后的菌体悬浮液用三层0.22μm滤膜进行真空抽滤，所得滤液为菌体诱导子。
实施例3、Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M 2015083)对丹参毛状根迷迭香酸积累的促进实验：
1、将丹参毛状根(母根)0.3g接种于含100ml 6.7-V培养基中的250ml三角瓶中，25℃，100rpm避光培养18天；作为基础物；
实验组1：在每瓶基础物中加入1.5ml的Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M2015083)上清液诱导子(实施例2所得，菌液诱导子)，继续相同条件(于25℃，100rpm避光培养)培养6天；作为实验组1；
实验组2：在每瓶基础物中加入1.5ml的Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M2015083)菌体诱导子(实施例2所得)，继续相同条件(25℃，100rpm避光培养)培养6天；作为实验组2；
阴性对照：在每瓶基础物中加入1.5ml的无菌营养肉汤培养基，继续相同条件(25℃，100rpm避光培养)培养6天；作为阴性对照。
上述每种实验组和阴性对照分别设置5个重复；
将每种实验组和阴性对照所得的丹参毛状根分别进行如下操作：
2、培养结束后用蒸馏水将步骤1得到的毛状根清洗三遍，用吸水纸吸干水分中，称鲜重(fresh weight，FW)；后将已称鲜重的毛状根放入烘箱，55℃干燥至恒重，测定干重(dry weight，DW)。
3、取适量烘至恒重的丹参根，研磨成粉末。取0.5g干粉加入2.5mL的70％(v/v)甲醇，120W超声波清洗机中超声萃取60min(超声过程中水温不可过高，可适当加入冰块，即，控制温度≤20℃)，萃取液过0.45μm微孔滤膜，用高效液相色谱(HPLC)的方法进行迷迭香酸和丹酚酸B含量的测定。
测定结果如下：
实验组中加入Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M 2015083)菌体诱导子可促进毛状根迷迭香酸含量提高183％，丹酚酸B含量提高69％；加入菌液诱导子可促进毛状根迷迭香酸含量提高7％，丹酚酸B含量提高105％，鲜重增加20％。具体如表1所述。
对比例、分别选用以下Microbacterium arborescens菌株及本属相近种的菌株作为对比例，具体菌株如下：
A、德国微生物菌种保藏中心DSMZ保藏的代码编号为DSM 20754的Microbacteriumarborescens；
B、中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC保藏的代码编号CICC 23772的Microbacterium arborescens；
C、中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC保藏的代码编号CICC 22616的Microbacterium arborescens；
D、中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC保藏的代码编号CICC 20196的Microbacterium arborescens；
E、德国微生物菌种保藏中心DSMZ保藏的代码编号为DSM 8607的Microbacteriumdextranolyticum；
将上述菌株替代实施例2中的Microbacterium arborescens LG2(CCTCC NO:M 2015083)进行诱导子制备，所得的菌液、菌体诱导子按照实施例3进行检测，所得结果如表1所述。
表1.Microbacterium arborescens LG2CCTCC M 2015083及对比例对丹参毛状根酚酸类物质积累的影响
表中为实验平均值±标准偏差。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.微杆菌，其特征是：为Microbacterium arborescens LG2，其保藏号为：CCTCC NO:M2015083。
2.如权利要求1所述的微杆菌的用途，其特征是：促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B的积累。
3.根据权利要求2所述的微杆菌的用途，其特征是：促进丹参毛状根增重。
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