CN104829684B - 含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物、其制备方法及应用 - Google Patents

含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物、含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物、其制备方法及应用，所述含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物的结构如式VIII所示，其中，R1选自H、CH3；R2选自H、CH3；R3选自H、F；R4选自H、CH3。本发明对人乳腺癌细胞(MCF‑7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)和肝癌细胞(HepG2)有明显的抑制作用，同时对人肾上皮细胞(293T)表现出了相当或者优于阳性对照药物Celecoxib的细胞毒性，可以应用于制备抗肿瘤药物。同时，本发明具有更好的生物活性、更高的选择性、更低的毒性以及更短的残效期等优点。

Description

含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物、其制备 方法及应用
技术领域
本发明属于医药化学领域，尤其是一种含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物、其制备方法及应用。
背景技术
C21甾体皂苷，是从中药通关藤中经过提取分离纯化得到的甾体皂苷类成分，其苷元是由21个C原子构成的独特甾体皂苷结构，因此称其为C21甾体皂苷。具有C21甾体皂苷母核的化合物具有免疫调节、平喘等药理活性，在临床上已经作为药物的指标性活性成分在临床上已经得到了较广泛的应用。
经申请人深入研究发现，具有C21甾体皂苷母核的化合物可能具有良好的抗肿瘤的活性。当前对此类C21甾体皂苷的研究内容主要有：根据其理化性质对其进行分离纯化和分析检测研究、针对其母核进行结构修饰研究、针对其结构特征进行药理活性研究等等。
但是，现有的产物还存在生物活性和选择性较低、毒性较高等缺点。
发明内容
发明目的：一个目的是提供一种含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物，以解决现有技术存在的上述问题。进一步的目的是提供一种制备所述含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物的方法。更进一步的目的是提供一种上述含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物在制备抗癌药物中的应用。
技术方案：一种含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物，结构如式VIII所示，
其中，R1选自H、CH3；R2选自H、CH3；R3选自H、F；R4选自H、CH3。
一种制备含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物的方法，所述含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物的结构如式VIII所示，
其中，R1选自H、CH3；R2选自H、CH3；R3选自H、F；R4选自H、CH3；
所述方法包括如下步骤：
步骤1：依次向反应容器中加入结构如式I所示的化合物、盐酸水溶液和无水乙醇，充分反应后，提取结构如式II所示的产物；
步骤2：在冰水浴作用下，依次向反应容器中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物，及结构如式II所示的化合物，制取结构如式III所示的化合物；
步骤3：在室温搅拌下，依次向反应容器中加入结构如式III所示的化合物、KOH水溶液、结构如式IV所示的化合物，以及乙醇，充分反应后提取结构如式V所示的化合物；
步骤4：依次将结构如式V所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯，及冰醋酸加入到反应容器中，待反应完成后，提取结构如式VI所示的化合物；
步骤5：将结构如式VI所示的化合物加入到活化羟胺溶液中，充分反应，过滤并提纯结构如式VII所示的化合物；
步骤6：在-20±5℃搅拌下，依次向反应容器中加入结构如式VII所示的化合物和二氯甲烷，并滴加三溴化硼，充分反应，提取目标化合物；
在式IV～式VII中，R1选自H、CH3；R2选自H、CH3；R3选自H、F；R4选自H、CH3。
优选的，所述步骤1进一步为：依次向反应容器中加入结构如式I所示的化合物、盐酸水溶液和无水乙醇，搅拌2-3h，回流反应7-9h，TLC跟踪反应，待反应结束后过滤，并将得到的固体产物依次用盐酸水溶液、蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤，并将产物溶于无水乙醇，重结晶提纯。
进一步优选的，搅拌2.2、2.6、3.0h，回流反应7.5、8.0、8.9h。更优选的，将I10mmol溶于无水乙醇50ml.滴加1mol/L的盐酸5ml。
优选的，所述步骤2进一步为：在冰水浴作用下，依次向反应容器中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物，及结构如式II所示的化合物，反应20-40min，回流反应5-7h，TLC跟踪反应，在反应结束后，过滤并将所得的固体产物依次用盐酸水溶液、蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤，再将固体产物溶于无水乙醇，重结晶提纯。
进一步优选的，反应20、32、40min，回流反应5、5.8、6.8h，反应物的摩尔比例为：II：重氮甲烷：三溴化硼为1:1.2～1.5:1.6～2.0，更进一步优选为：1：1.25:1.8，1:1.5:1.8。
优选的，所述步骤3进一步为：在室温搅拌下，依次向反应容器中加入结构如式III所示的化合物、KOH水溶液、结构如式IV所示的化合物，以及乙醇，搅拌反应3-6h，用盐酸调节pH，过滤并将得到的固体依次用蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤。
进一步优选的，搅拌反应3、4.5、5.5h，反应物的摩尔比为：IV：III：乙醇为1:1:1～1.6。
优选的，所述步骤4进一步为：依次将结构如式V所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯，及冰醋酸加入到反应容器中，在室温搅拌下，反应20-40min，回流反应5-8h，TLC跟踪反应，反应结束后过滤并将所得的固体产物依次用盐酸水溶液、蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤，再将其溶于无水乙醇，重结晶提纯。
进一步优选的，搅拌反应22、30、38min，回流反应5.2、6.5、7.8h，反应物的摩尔比为V：对肼基苯磺酰胺:乙酸＝1：1.2～1.8：0.5，更进一步的优选为：1:1.2:0.5、1:1.8:0.5。
优选的，所述步骤5进一步为：将等摩尔的盐酸羟按、甲醇钠加入无水甲醇中，加热搅拌20-40min后，过滤掉固体，得到活化的羟胺溶液，在向其中加入结构如式VI所示的化合物，回流反应3-5h，TLC跟踪反应，反应结束后过滤并将得到的固体用蒸馏水洗涤，再将固体产物溶于无水乙醇，重结晶提纯。
进一步优选的，搅拌20、30、40min，回流反应3.2、4.2、4.8h，反应物的摩尔比为：VI：盐酸羟按：甲醇钠＝1:4～5:4～5。
优选的，所述步骤6进一步为：在-20±5℃搅拌下，依次向反应容器中加入结构如式VII所示的化合物和二氯甲烷，并滴加三溴化硼，搅拌反应20-40min，在室温条件下反应8-12h，TLC跟踪反应，反应结束后过滤并将得到的固体用蒸馏水洗涤，再溶于无水乙醇，重结晶提纯。
进一步优选的，搅拌反应22、30、40min，室温条件下反应8、10、12h，反应物的摩尔比为：VII：三溴化硼＝1:0.5。
本发明的实验方法具有的优点包括：实验可重复性强，稳定性好，实验反应所需条件较简单，且实验环境温和，产率较好，可在较小投入情况下进行大量生产。
一种含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物在制备抗癌药物中的应用，所述含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物的结构如式VIII所示，
其中，R1选自H、CH3；R2选自H、CH3；R3选自H、F；R4选自H、CH3。
一种抗癌药物，包括结构如式VIII所示的化合物及医学上可接受的载体，
其中，R1选自H、CH3；R2选自H、CH3；R3选自H、F；R4选自H、CH3。
有益效果：本发明对人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)和肝癌细胞(HepG2)有明显的抑制作用，同时对人肾上皮细胞(293T)表现出了相当或者优于阳性对照药物Celecoxib的细胞毒性，可以应用于制备抗肿瘤药物。同时，本发明具有更好的生物活性、更高的选择性、更低的毒性以及更短的残效期等优点。
具体实施方式
在本发明某个实施例中，含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸C21甾体皂苷苷元衍生物的具有如下通式：
其制备过程如下：
步骤1.在0±5℃下，依次向圆底烧瓶中加入无水甲醇、氯化亚砜、对肼基苯甲酸1，搅拌1h左右后，常温继续搅拌3-5h，过滤，得到的固体依次用蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到酯化物对肼基苯甲酸甲酯2。
步骤2.在室温(在本发明中室温或常温指20±5℃)搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入Tenacissoside A(一种C21甾体皂苷)3、稀盐酸、无水乙醇，搅拌1h后，回流反应7-9h。TLC跟踪反应(展开剂VAcOEt:VPE＝1:2)，反应结束后，过滤，得到的固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到部分还原化的晶体状C21甾体皂苷苷元4。
步骤3.在冰水浴搅拌作用下，依次向圆底烧瓶中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物、C21甾体皂苷苷元4，反应0.5h左右后，再回流反应5-7h。TLC跟踪反应(展开剂VAcOEt:VPE＝1:2)，反应结束后，过滤，得到固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到晶体状中间物5。
步骤4.在室温搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入中间物5、KOH水溶液、不同取代基的吲哚-3-甲醛、乙醇，继续搅拌反应4h后，稀盐酸酸化调节pH，过滤，得到的固体依次用蒸馏水(3×100mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥得中间体6-10。
步骤5.依次将不同的化合物6-10、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯2、冰醋酸加入到圆底烧瓶中，室温搅拌反应1h后，仍有部分固体不溶；接着回流反应5h，TLC跟踪反应(展开剂VAcOEt:VPE＝1:2)，反应结束后，过滤，固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到晶体状中间物11-15。
步骤6.将等摩尔的盐酸羟按、甲醇钠加入无水甲醇中，加热搅拌0.5h后，过滤掉固体，得到活化的羟胺溶液，在向其中加入对应的晶体中间物11-15，回流反应3-5h。TLC跟踪反应(展开剂VAcOEt:VPE＝1:2)，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状目标化合物16-20。
步骤7.在-20±5℃搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入对应的中间物16-20、二氯甲烷，并逐步滴加三溴化硼，搅拌1h左右后，室温继续反应12h左右。TLC跟踪反应(展开剂VAcOEt:V正己烷＝1:2)，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状目标化合物21-25。
实施例一：
4-(5-(3-吲哚)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物21)的制备
在-20℃搅拌下，依次向50mL的圆底烧瓶中加入步骤6得到的相应中间物16(10.0mmol)、二氯甲烷(25mL)，并逐步滴加三溴化硼(5mmol)继续搅拌反应1h后，将反应烧瓶转移至室温，继续反应12h。TLC跟踪反应(展开剂VAcOEt:V正己烷＝1:2)，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇重结晶提纯得到晶体状目标化合物。
得白色晶体，产率43.9％。m.p.215～217℃；1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:10.79(s,1H,NH),10.51(s,1H,OH),7.93(dd,J1＝7.1,J2＝7.2Hz,4H,ArH),7.75(s,1H,NH),7.58(d,J＝5.8Hz,1H,ArH),7.34(d,J＝5.5Hz,1H,ArH),7.18(s,1H,CH),7.10～6.95(m,2H,ArH),5.36(s,2H,OH),5.19(t,J＝7.3Hz,1H,CH),4.49(s,1H,OH),3.54(dd,J1＝4.7,J2＝4.8Hz,1H,CH),3.44(t,J＝8.1Hz,1H,CH),3.36(d,J＝6.8Hz,1H,CH),3.34～3.01(m,2H,CH2),2.01(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.79～1.21(m,15H,CH and CH2),1.14(dd,J1＝7.2Hz,J2＝7.1Hz,1H,CH),0.89(s,3H,CH3),0.84(s,3H,CH3).ESI-MS:641.8[M+H]+.Anal.Calcd forC37H44N4O6:C,H,N.
实施例二：
4-(5-(3-(7-甲基-吲哚))-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物22)的制备
制备方法参考实施例一。得白色晶体，产率45.3％。m.p.224～226℃；1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:10.79(s,1H,NH),10.44(s,1H,OH),8.00(d,J＝8.4Hz,2H,ArH),7.72(d,J＝6.9Hz,2H,ArH),7.70(s,1H,NH),7.48(d,J＝5.8Hz,1H,ArH),7.21(d,J＝5.5Hz,1H,ArH),7.18(s,1H,CH),7.06(t,J＝7.3Hz,1H,CH),5.35(s,2H,OH),5.19(t,J＝7.3Hz,1H,CH),4.49(s,1H,OH),3.54(dd,J1＝4.7,J2＝4.8Hz,1H,CH),3.44(t,J＝8.1Hz,1H,CH),3.36(d,J＝6.8Hz,1H,CH),3.32～3.13(m,2H,CH2),2.68(s,3H,CH3),2.01(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.74～1.21(m,15H,CH and CH2),1.14(dd,J1＝7.2Hz,J2＝7.1Hz,1H,CH),0.89(s,3H,CH3),0.84(s,3H,CH3).ESI-MS:655.8[M+H]+.Anal.Calcd for C38H46N4O6:C,H,N.
实施例三：
4-(5-(3-(6-甲基-吲哚))-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物23)的制备
制备方法参考实施例一。得白色晶体，产率42.3％。m.p.212～214℃；1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:10.78(s,1H,NH),10.53(s,1H,OH),7.93(dd,J1＝7.1,J2＝7.3Hz,4H,ArH),7.69(s,1H,NH),7.55(d,J＝5.8Hz,1H,ArH),7.21(d,J＝5.5Hz,1H,ArH),7.18(s,1H,CH),7.06(s,1H,ArH),5.37(s,2H,OH),5.19(t,J＝7.3Hz,1H,CH),4.49(s,1H,OH),3.54(dd,J1＝4.7,J2＝4.8Hz,1H,CH),3.44(t,J＝8.1Hz,1H,CH),3.36(d,J＝6.8Hz,1H,CH),3.34～3.01(m,2H,CH2),2.44(s,3H,CH3),2.01(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.79～1.21(m,15H,CHand CH2),1.14(dd,J1＝7.2Hz,J2＝7.1Hz,1H,CH),0.88(s,3H,CH3),0.85(s,3H,CH3).ESI-MS:655.8[M+H]+.Anal.Calcd for C38H46N4O6:C,H,N.
实施例四：
4-(5-(3-(6-甲基-吲哚))-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物24)的制备
制备方法参考实施例一。得白色晶体，产率37.3％。m.p.236～237℃；1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:10.84(s,1H,NH),10.47(s,1H,OH),7.93(dd,J1＝7.1,J2＝7.3Hz,4H,ArH),7.72(s,1H,NH),7.55(d,J＝5.8Hz,1H,ArH),7.21(d,J＝5.5Hz,1H,ArH),7.18(s,1H,CH),7.06(s,1H,ArH),5.32(s,2H,OH),5.19(t,J＝7.3Hz,1H,CH),4.49(s,1H,OH),3.55(dd,J1＝4.4,J2＝4.3Hz,1H,CH),3.42(t,J＝8.1Hz,1H,CH),3.36(d,J＝6.8Hz,1H,CH),3.31～3.14(m,2H,CH2),2.55(s,3H,CH3),2.01(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.79～1.21(m,15H,CHand CH2),1.14(dd,J1＝7.2Hz,J2＝7.1Hz,1H,CH),0.90(s,3H,CH3),0.85(s,3H,CH3).ESI-MS:655.8[M+H]+.Anal.Calcd for C38H46N4O6:C,H,N.
实施例五：
4-(5-(3-(6-氟-吲哚))-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物25)的制备
制备方法参考实施例一。得白色晶体，产率68.2％。m.p.213～215℃；1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:10.72(s,1H,NH),10.49(s,1H,OH),7.98(dd,J1＝7.0,J2＝7.6Hz,2H,ArH),7.69(s,1H,NH),7.66(d,J＝5.4Hz,2H,ArH),7.24(d,J＝3.7Hz,1H,ArH),7.18(s,1H,CH),6.89(s,2H,ArH),5.38(s,2H,OH),5.19(t,J＝7.3Hz,1H,CH),4.47(s,1H,OH),3.58(dd,J1＝4.4,J2＝4.9Hz,1H,CH),3.43(t,J＝8.5Hz,1H,CH),3.34(d,J＝6.8Hz,1H,CH),3.14～2.55(m,2H,CH2),2.01(t,J＝5.5Hz,1H,CH),1.84～1.16(m,15H,CH and CH2),1.14(dd,J1＝7.2Hz,J2＝7.1Hz,1H,CH),0.86(s,3H,CH3),0.78(s,3H,CH3).ESI-MS:659.8[M+H]+.Anal.Calcd for C37H43FN4O6:C,H,N.
实施例六：
含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸C21甾体皂苷苷元衍生物体外抗肿瘤活性关于抗肿瘤细胞增殖的研究
采用MTT[3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸C21甾体皂苷苷元衍生物对人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)及肝癌细胞(HepG2)的半数抑制浓度(IC50)。
(1)培养液(/L)的配制：①悬浮细胞：DMEM培养粉一袋(10.4g)，新生牛血清100mL，青霉素溶液(2×10-5U/mL)0.5mL，链霉素溶液(2×10-5U/mL)0.5mL，加三蒸水溶解后，用5.6％的NaHCO3溶液调pH值至7.2-7.4，最后定容至1000mL。过滤灭菌。②贴壁细胞：同上，再加入NaHCO32.00g，HEPES 2.38g。
(2)D-Hanks缓冲液(每升)的配制：NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na2HPO4·12H2O0.06g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g。高压灭菌。
(3)胰蛋白酶液的配制：利用D-Hanks缓冲液配成浓度为0.5％胰蛋白酶液。过滤除菌。
(4)实验药液的配制：将测试样品用少量的三蒸水溶解配成储备液，即按实验最高浓度的10倍配制储备液。根据化合物溶解性不同，可用三蒸水直接溶解，或用少量DMSO助溶，再加三蒸水溶解。储备液保存于-20℃冰箱中备用。
(5)人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)以及肝癌细胞(HepG2)的培养：为贴壁生长细胞，常规培养于DMEM培养液内(含10％小牛血清、100U/mL链霉素)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔3-4d传代一次。传代时将原瓶中培养液转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃去原培养液，加入等量新鲜培养液，吹打均匀，移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原体积(培养液体积约为培养瓶容量的1/10)。
(6)细胞孵育：取对数生长期的肿瘤细胞，调细胞悬液浓度为1-1.5×105个/mL。在96孔培养板中每孔加细胞悬液100μL，置37℃，5％CO2培养箱中培养24h。培养24h后，分别按设计加入药液。
(7)加药：将测试药液按照最终浓度的浓度梯度分别加入到各个孔中，每个浓度设6个平行孔。实验分为药物试验组(分别加入不同浓度的测试药)、对照组(只加培养液和细胞，不加测试药)和空白组(只加培养液，不加细胞和测试药)。将加药后的96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h。阳性对照药物的活性按照测试样品的方法测定。
(8)存活细胞的测定：在培养了48h后的96孔板中，每孔加MTT 40μL(用D-Hanks缓冲液配成4mg/mL)。在37℃放置4h后，移去上清液。每孔加150μL DMSO，振荡5min，使formazan结晶溶解。最后，利用自动酶标仪在570nm波长处检测各孔的光密度(OD值)。
半数抑制浓度(IC50)定义为当50％的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测定的光密度(OD值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。
测得的IC50见表1所示。
表1本发明所列含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸C21甾体皂苷苷元衍生物对肿瘤细胞的抑制IC50值(μmol/mL)
a6次平行试验，实验结果取平均值，误差在5-10％之间
由上可知：本发明对人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)以及肝癌细胞(HepG2)有明显的抑制作用。本发明的抑制活性有明显提高，对比阳性对照药则表现出了相当或者优于阳性对照药物的抑制活性。
实施例七：
含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸C21甾体皂苷苷元衍生物体外抗肿瘤活性关于细胞毒性的研究
本发明测试了新合成化合物21-25对人肾上皮细胞(293T)的细胞毒性，细胞毒性结果如表2，以Celecoxib作为阳性对照。每个化合物的毒性用抑制T细胞存活率到50％时的浓度(CC50)来表示。
实验方法：
(1)培养人肾上皮细胞(293T)直至达到其对数生长期末细胞趋于融合，用细胞消化液消化分散细胞，用细胞培养液配制成1×104个/mL的细胞悬液。取96孔培养板，每孔中加入100μL的细胞悬液。轻轻水平转动培养板使细胞均匀地分散在皿孔的表面。
(2)置于含5％CO2细胞培养箱中，在37±2℃温度下培养24h。弃去原培养液，每孔加入100μL的空白对照液，阴性对照液，阳性对照液，100％和50％浓度的试验样品浸提液。每组至少设8孔。注：浸提原液或以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。采用0.9％氯化钠注射液浸提时，在稀释浸提时使用浓缩的2倍培养基。
(3)置于含5％CO2培养箱中，在37±2℃温度下进行培养。培养48h。
(4)每个培养间期后，每孔加入MTT溶液20μL，置于含5％CO2培养箱中，在37±2℃温度下培养5h。
(5)弃去孔内液体，每孔分别加入200μL DMSO，将培养板放置10min，水平摇晃使孔内溶液颜色均匀。
(6)用酶标仪测定吸光度，波长采用570nm。
测得的CC50见表2所示。
表2本发明所列含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸C21甾体皂苷苷元衍生物对293T细胞的抑制CC50值(μmol/mL)
a6次平行试验，实验结果取平均值，误差在5-10％之间
由上可知：本发明对人肾上皮细胞(293T)表现出了相当或者优于阳性对照药物的细胞毒性，同Tenacissoside A相比，细胞毒性也几乎持平。
总之，申请人经研究发现：吲哚类化合物是一类重要的杂环衍生物生物碱，推测其具有抗肿瘤活性。
氧肟酸也称异羟肟酸，具有两种互变异构体，即羟肟酸和异羟肟酸，并且以异羟肟酸为主要成分。氧肟酸结构式为R-CO-NHOH，是一种有机螯合剂，能与Cu2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Fe3+离子等形成稳定的金属螯合物，其显著的络合能力不仅使之构成现代冶金学上广泛使用的一大类浮选剂，而且在新药物的研制方面存在着可喜的应用前景，是值得深入研究和开发的一类新药。
吡唑是一类重要的杂环化合物，广泛分布在自然界中，该类化合物因其具有高效、低毒，以及其环上取代基的多方位变换的性质，而在药物领域中得到广泛应用。
二氢吡唑是极为重要的含氮的五元杂环化合物，它具有很多优异的生物活性，是一个具有各种药理特性的结构性存在亚基，存在普遍药用生物活性的活性化合物先导。除此之外，由于二氢吡唑多是手性的，可以导致环上的取代及分子的构象具有更大的多变性，因而，具有更好的生物活性潜质。
基于此，本发明将具有优秀生物活性的吲哚骨架以及氧肟酸基团引入到二氢吡唑衍生物中，同时结合了具有很好活性的C21甾体皂苷苷元骨架，设计合成了一系列含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸C21甾体皂苷苷元衍生物，实验发现具有更好的生物活性、更高的选择性、更低的毒性以及更短的残效期等。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (7)

1.一种制备含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于，所述含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物的结构如式VIII所示，
其中，R1选自H、CH3；R2选自H、CH3；R3选自H、F；R4选自H、CH3；
所述方法包括如下步骤：
步骤1：依次向反应容器中加入结构如式I所示的化合物、盐酸水溶液和无水乙醇，充分反应后，提取结构如式II所示的产物；
步骤2：在冰水浴作用下，依次向反应容器中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物，及结构如式II所示的化合物，制取结构如式III所示的化合物；
步骤3：在室温搅拌下，依次向反应容器中加入结构如式III所示的化合物、KOH水溶液、结构如式IV所示的化合物，以及乙醇，充分反应后提取结构如式V所示的化合物；
步骤4：依次将结构如式V所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯，及冰醋
酸加入到反应容器中，待反应完成后，提取结构如式VI所示的化合物；
步骤5：将结构如式VI所示的化合物加入到活化羟胺溶液中，充分反应，过滤并提纯结构如式VII所示的化合物；
步骤6：在-20±5℃搅拌下，依次向反应容器中加入结构如式VII所示的化合物和二氯甲烷，并滴加三溴化硼，充分反应，提取目标化合物；
在式IV～式VII中，R1选自H、CH3；R2选自H、CH3；R3选自H、F；R4选自H、CH3。
2.如权利要求1所述的制备含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于，所述步骤1进一步为：依次向反应容器中加入结构如式I所示的化 合物、盐酸水溶液和无水乙醇，搅拌2-3h，回流反应7-9h，TLC跟踪反应，待反应结束后过滤，并将得到的固体产物依次用盐酸水溶液、蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤，并将产物溶于无水乙醇，重结晶提纯。
3.如权利要求1所述的制备含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于，所述步骤2进一步为：在冰水浴作用下，依次向反应容器中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物，及结构如式II所示的化合物，反应20-40min，回流反应5-7h，TLC跟踪反应，在反应结束后，过滤并将所得的固体产物依次用盐酸水溶液、蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤，再将固体产物溶于无水乙醇，重结晶提纯。
4.如权利要求1所述的制备含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于，所述步骤3进一步为：在室温搅拌下，依次向反应容器中加入结构如式III所示的化合物、KOH水溶液、结构如式IV所示的化合物，以及乙醇，搅拌反应3-6h，用盐酸调节pH，过滤并将得到的固体依次用蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤。
5.如权利要求1所述的制备含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于，所述步骤4进一步为：依次将结构如式V所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯，及冰醋酸加入到反应容器中，在室温搅拌下，反应20-40min，回流反应5-8h，TLC跟踪反应，反应结束后过滤并将所得的固体产物依次用盐酸水溶液、蒸馏水、乙醇和蒸馏水洗涤，再将其溶于无水乙醇，重结晶提纯。
6.如权利要求1所述的制备含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于，所述步骤5进一步为：将等摩尔的盐酸羟按、甲醇钠加入无水甲醇中，加热搅拌20-40min后，过滤掉固体，得到活化的羟胺溶液，再向其中加入结构如式VI所示的化合物，回流反应3-5h，TLC跟踪反应，反应结束后过滤并将得到的固体用蒸馏水洗涤，再将固体产物溶于无水乙醇，重结晶提纯。
7.如权利要求1所述的制备含吲哚骨架的二氢吡唑氧肟酸甾体皂苷苷元衍生物的方法，其特征在于，所述步骤6进一步为：在-20±5℃搅拌下，依次向反应容器中加入结构如式VII所示的化合物和二氯甲烷，并滴加三溴化硼，搅拌反应20-40min，在室温条件下反应8-12h，TLC跟踪反应，反应结束后过滤并将得到的固体用蒸馏水洗涤，再溶于无水乙醇，重结晶提纯。
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