CN104804064A - 含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸c21甾体皂苷苷元衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物及其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用，所述C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的结构如式IX所示，本发明具有更好的生物活性、更高的选择性以及更低的毒性等优点。对人乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞有明显的抑制作用，其中R₁选自H或CH₃；R₂选自H或CH₃；R₃选自H或CH₃；R₄选自H或CH₃。

Description

含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C21甾体皂苷苷元衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，涉及含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物及其制备方法与应用。

背景技术

从中药通关藤中经过提取分离纯化可以得到甾体皂苷类成分，其苷元是由21个C原子构成的独特甾体皂苷结构，因此称为C₂₁甾体皂苷。现有研究表明，具有C₂₁甾体皂苷母核的化合物具有免疫调节、平喘等药理活性，在临床上已经作为药物的指标性活性成分在临床上已经得到了较广泛的应用。

发明人经研究发现：具有C₂₁甾体皂苷母核的化合物具有良好的抗肿瘤的活性，对多种肿瘤具有较好的抑制作用，如对肝癌、肺癌、食道癌等均具有较好的抑制活性。目前对此类C₂₁甾体皂苷的研究还不深入，主要是根据其理化性质对其进行分离纯化和分析检测研究、针对其母核进行结构修饰研究、以及针对其结构特征进行药理活性研究。

如何使其具有更好的生物活性、更高的选择性、更低的毒性是当前的重要研究内容。

发明内容

发明目的：一个目的是提供一种抗肿瘤化合物，以解决现有技术存在的问题。进一步的目的是提供一种抗肿瘤化合物的制备方法。更进一步的目的是提供一种抗肿瘤化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术方案：一种C₂₁甾体皂苷苷元衍生物，结构如式IX所示，

其中R₁选自H或CH₃；R₂选自H或CH₃；R₃选自H或CH₃；R₄选自H或CH₃。

一种C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，

所述C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的结构如式IX所示，

其中R₁选自H或CH₃；R₂选自H或CH₃；R₃选自H或CH₃；R₄选自H或CH₃；

包括以下步骤：

步骤1，在-5～5℃下，向反应器中加入无水甲醇、氯化亚砜、结构式如I所示的化合物，反应后得到结构式如II所示的化合物。

步骤2，在室温搅拌下，向反应器中加入结构式如III所示的化合物、稀盐酸、无水乙醇，反应结束后，得到结构式如IV所示的化合物。

步骤3，在冰水浴搅拌作用下，向反应器中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物、如IV所示的化合物，反应结束后，得到结构式如V所示的化合物。

步骤4，在室温搅拌下，向反应器中加入结构式如V所示的化合物、KOH水溶液、不同取代基的萘甲醛、乙醇，反应结束后得到结构式如VI所示的化合物。

步骤5，将结构式如VI所示的化合物、无水乙醇、结构式如II所示的化合物、冰醋酸加入到反应器中，反应后得到结构式如VII所示的化合物。

步骤6，将盐酸羟胺、甲醇钠加入无水甲醇中，向其中加入结构式如VII所示的化合物，反应结束后，得到结构式如VIII所示的化合物。

步骤7，在-25～-15℃搅拌下，向反应器中加入结构式如VIII所示的化合物、二氯甲烷、三溴化硼，反应结束后，得到结构式如IX所示的化合物。

式VI到IX中，R₁选自H或CH₃；R₂选自H或CH₃；R₃选自H或CH₃；R₄选自H或CH₃。

在优选实施例中，所述步骤1进一步为：

在-5～5℃下，依次向反应器中加入无水甲醇、氯化亚砜、对肼基苯甲酸，搅拌30～60min后，常温继续搅拌3～5h，过滤，得到的固体依次用蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体产物溶于无水乙醇，重结晶，得到酯化物对肼基苯甲酸甲酯。

在优选实施例中，所述步骤2进一步为：

在室温搅拌下，依次向反应器中加入结构式如III所示的化合物、稀盐酸、无水乙醇，搅拌0.5～1.5h后，回流反应7～9h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，得到的固体依次用稀盐酸、蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇，重结晶，得到结构式如IV所示的化合物。

进一步优选的，各反应物的摩尔比为：结构式如III所示的化合物：稀盐酸＝1:8～11。更优选的摩尔比为1:9.3。

在优选实施例中，所述步骤3进一步为：

在冰水浴搅拌作用下，依次向反应器中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物、结构式如IV所示的化合物，反应20～40min后，再回流反应5～7h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，得到固体依次用稀盐酸、蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体产物溶于无水乙醇，重结晶，得到结构式如V所示的化合物。

进一步优选的，各反应物的摩尔比为：结构式如IV所示的化合物：重氮甲烷：三氟化硼＝1：(1.2～1.3)：(1.2～1.3)。更优选的摩尔比为：1:1.25:1.25。

在优选实施例中，所述步骤4进一步为：

在室温搅拌下，依次向反应器中加入结构式如V所示的化合物、KOH水溶液、不同取代基的萘甲醛、乙醇，继续搅拌反应3～6h后，稀盐酸酸化调节pH至中性，过滤，得到的固体依次用蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥得到结构式如VI所示的化合物。

进一步优选的，各反应物的摩尔比为：结构式如V所示的化合物：不同取代基的萘甲醛＝1:1。

在优选实施例中，所述步骤5进一步为：

依次将结构式如VI所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯、冰醋酸加入到反应器中，室温搅拌反应40～80min后，有部分固体不溶；接着回流反应5～7h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体依次用稀盐酸、蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体产物溶于无水乙醇，重结晶，得到结构式如VII所示的化合物。

进一步优选的，各反应物的摩尔比为：结构式如VI所示的化合物：对肼基苯甲酸甲酯：冰醋酸＝1：(1.1～1.3)：(0.8～1)。更优选的摩尔比为：1:1.2:0.88。

在优选实施例中，其特征在于，所述步骤6进一步为：

将盐酸羟胺、甲醇钠加入无水甲醇中，加热搅拌20～40min后，过滤掉固体，得到活化的羟胺溶液，在向其中加入结构式如VII所示的化合物，回流反应3～5h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到结构式为VII所示的化合物。

在优选实施例中，其特征在于，所述步骤7进一步为：

在-25～-15℃搅拌下，依次向反应器中加入结构式如VII所示的化合物、二氯甲烷，并逐步滴加三溴化硼，搅拌40～80min后，室温继续反应10～14h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到结构式如VIII所示的化合物，即目标产物。

进一步优选的，各反应物的摩尔比为：结构式如VII所示的化合物：三溴化硼＝1:2～3。更优选的摩尔比为1:2。

有益效果：本发明具有更好的生物活性、更高的选择性以及更低的毒性等优点。对人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)和肝癌细胞(HepG2)有明显的抑制作用，同时对人肾上皮细胞(293T)表现出了相当或者优于阳性对照药物Celecoxib的细胞毒性。

具体实施方式：

本发明的技术方案如下：一类新颖的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的合成，其特征是它有如下通式

该类物质的合成线路如下：

上述的含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的合成，它由下列步骤组成：

步骤1.在0±5℃下，依次向圆底烧瓶中加入无水甲醇、氯化亚砜、对肼基苯甲酸1，搅拌1h左右后，常温继续搅拌3-5h，过滤，得到的固体依次用蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到酯化物对肼基苯甲酸甲酯2。

步骤2.在室温搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入Tenacissoside A(一种C₂₁甾体皂苷)3、稀盐酸、无水乙醇，搅拌1h后，回流反应7-9h。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2)，反应结束后，过滤，得到的固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到部分还原化的晶体状C₂₁甾体皂苷苷元4。

步骤3.在冰水浴搅拌作用下，依次向圆底烧瓶中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物、C₂₁甾体皂苷苷元4，反应0.5h左右后，再回流反应5-7h。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2)，反应结束后，过滤，得到固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到晶体状中间物5。

步骤4.在室温搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入中间物5、KOH水溶液、不同取代基的萘甲醛、乙醇，继续搅拌反应4h后，稀盐酸酸化调节pH，过滤，得到的固体依次用蒸馏水(3×100mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥得中间体6-15。

步骤5.依次将不同的化合物6-15、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯2、冰醋酸加入到圆底烧瓶中，室温搅拌反应1h后，仍有部分固体不溶；接着回流反应5h，TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2)，反应结束后，过滤，固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到晶体状中间物16-25。

步骤6.将等摩尔的盐酸羟胺、甲醇钠加入无水甲醇中，加热搅拌0.5h后，过滤掉固体，得到活化的羟胺溶液，在向其中加入对应的晶体中间物16-25，回流反应3-5h。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2)，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状目标化合物26-35。

步骤7.在-20±5℃搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入对应的中间物26-35、二氯甲烷，并逐步滴加三溴化硼，搅拌1h左右后，室温继续反应12h左右。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_正己烷＝1:2)，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状目标化合物36-45。

实施例一：4-(5-(α-萘基)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物36)的制备

在-20℃搅拌下，依次向50mL的圆底烧瓶中加入步骤6得到的相应中间物26(10.0mmol)、二氯甲烷(25mL)，并逐步滴加三溴化硼(5mmol)继续搅拌反应1h后，将反应烧瓶转移至室温，继续反应12h。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_正己烷＝1:2)，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇重结晶提纯得到晶体状目标化合物。

得白色晶体，产率51.2％。m.p.203～204℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.53(s,1H,OH),8.11～7.92(m,5H,ArH),7.75(d,J＝8.1Hz,2H,ArH),7.71(s,1H,NH),7.62～7.46(m,2H,ArH),7.28(t,J＝6.4Hz,1H,ArH),6.99(d,J＝7.6Hz,1H,ArH),5.33(s,2H,OH),5.19(t,J＝7.3Hz,1H,CH),4.49(s,1H,OH),3.54(dd,J₁＝4.7,J₂＝4.8Hz,1H,CH),3.44(t,J＝8.1Hz,1H,CH),3.36(d,J＝6.8Hz,1H,CH),3.34～3.01(m,2H,CH₂),2.01(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.79～1.21(m,15H,CH and CH₂),1.14(dd,J₁＝7.2Hz,J₂＝7.4Hz,1H,CH),0.89(s,3H,CH₃),0.84(s,3H,CH₃).ESI-MS:652.8[M+H]⁺.Anal.Calcd forC₃₉H₄₅N₃O₆:C,H,N.

实施例二：4-(5-(5-甲基-α-萘基)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物37)的制备

制备方法同实施例一。得白色晶体，产率53.7％。m.p.212～213℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.50(s,1H,OH),8.2(d,J＝8.3Hz,2H,ArH),7.84～7.68(m,5H,ArH and NH),7.56～7.45(m,2H,ArH),6.96(d,J＝7.3Hz,1H,ArH),6.86(s,1H,ArH),5.37(s,2H,OH),5.18(t,J＝7.4Hz,1H,CH),4.45(s,1H,OH),3.54(dd,J₁＝4.6,J₂＝4.7Hz,1H,CH),3.43(t,J＝7.8Hz,1H,CH),3.34(d,J＝6.9Hz,1H,CH),3.28～3.15(m,2H,CH₂),2.62(s,3H,CH₃),2.01(t,J＝7.4Hz,1H,CH),1.75～1.21(m,15H,CH and CH₂),1.10(dd,J₁＝6.4Hz,J₂＝6.1Hz,1H,CH),0.88(s,3H,CH₃),0.82(s,3H,CH₃).ESI-MS:666.8[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₄₀H₄₇N₃O₆:C,H,N.

实施例三：4-(5-(6-甲基-α-萘基)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物38)的制备

制备方法同实施例一。得白色晶体，产率52.3％。m.p.252～254℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.49(s,1H,OH),8.01～7.90(m,4H,ArH),7.75(d,J＝6.1Hz,2H,ArH),7.64(s,1H,NH),7.43(t,J＝7.4Hz,1H,ArH),7.10(d,J＝7.2Hz,1H,ArH),6.92(d,J＝6.6Hz,1H,ArH),5.42(s,2H,OH),5.16(t,J＝7.5Hz,1H,CH),4.48(s,1H,OH),3.55(dd,J₁＝4.6,J₂＝4.6Hz,1H,CH),3.41(t,J＝7.8Hz,1H,CH),3.35(d,J＝6.6Hz,1H,CH),3.27～3.15(m,2H,CH₂),2.66(s,3H,CH₃),2.01(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.79～1.21(m,15H,CH and CH₂),1.11(dd,J₁＝6.8Hz,J₂＝7.1Hz,1H,CH),0.88(s,3H,CH₃),0.81(s,3H,CH₃).ESI-MS:666.8[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₄₀H₄₇N₃O₆:C,H,N.

实施例四：4-(5-(7-甲基-α-萘基)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物39)的制备

制备方法同实施例一。得白色晶体，产率39.5％。m.p.232～234℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.53(s,1H,OH),8.05(s,1H,ArH),8.0(d,J＝6.1Hz,2H,ArH),7.88(d,J＝7.4Hz,2H,ArH),7.75(d,J＝7.1Hz,2H,ArH),7.67(s,1H,NH),7.46(t,J＝5.3Hz,1H,CH),7.06(d,J＝5.6Hz,1H,ArH),6.90(s,1H,ArH),5.36(s,2H,OH),5.16(t,J＝7.5Hz,1H,CH),4.48(s,1H,OH),3.55(dd,J₁＝4.6Hz,J₂＝4.6Hz,1H,CH),3.45(t,J＝7.7Hz,1H,CH),3.39(d,J＝6.6Hz,1H,CH),3.28～3.12(m,2H,CH₂),2.66(s,3H,CH₃),2.01(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.78～1.24(m,15H,CH and CH₂),1.11(dd,J₁＝6.8Hz,J₂＝7.1Hz,1H,CH),0.87(s,3H,CH₃),0.82(s,3H,CH₃).ESI-MS:666.8[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₄₀H₄₇N₃O₆:C,H,N.

实施例五：4-(5-(8-甲基-α-萘基)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a，12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物40)的制备

制备方法同实施例一。得白色晶体，产率44.8％。m.p.210～211℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.58(s,1H,OH),8.01～7.92(m,4H,ArH),7.76(d,J＝7.1Hz,2H,ArH),7.71(s,1H,NH),7.50～7.41(m,2H,ArH),6.99(d,J＝5.4Hz,1H,ArH),6.90(s,1H,ArH),5.32(s,2H,OH),5.15(t,J＝7.5Hz,1H,CH),4.43(s,1H,OH),3.56(dd,J₁＝4.3Hz,J₂＝4.8Hz,1H,CH),3.46(t,J＝7.5Hz,1H,CH),3.34(d,J＝6.1Hz,1H,CH),3.28～3.15(m,2H,CH₂),2.90(s,3H,CH₃),2.01(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.79～1.21(m,15H,CH and CH₂),1.11(dd,J₁＝6.8Hz,J₂＝7.2Hz,1H,CH),0.89(s,3H,CH₃),0.84(s,3H,CH₃).ESI-MS:666.8[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₄₀H₄₇N₃O₆:C,H,N.

实施例六：4-(5-(β-萘基)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物41)的制备

制备方法同实施例一。在步骤4中以β-萘甲醛代替α-萘甲醛依次反应，得白色晶体，产率56.3％。m.p.226～227℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.47(s,1H,OH),8.01～7.91(m,4H,ArH),7.84(d,J＝7.6Hz,1H,ArH),7.75(d,J＝7.1Hz,2H,ArH),7.70(s,1H,NH),7.62(s,1H,ArH),7.58～7.40(m,3H,ArH),5.37(s,2H,OH),5.16(t,J＝7.5Hz,1H,CH),4.48(s,1H,OH),3.55(dd,J₁＝4.5,J₂＝4.6Hz,1H,CH),3.46(t,J＝7.5Hz,1H,CH),3.34(d,J＝6.1Hz,1H,CH),3.29～3.14(m,2H,CH₂),2.01(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.83～1.21(m,15H,CH and CH₂),1.14(dd,J₁＝4.1Hz,J₂＝4.3Hz,1H,CH),0.89(s,3H,CH₃),0.84(s,3H,CH₃).ESI-MS:652.8[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₃₉H₄₅N₃O₆:C,H,N.

实施例七：4-(5-(5-甲基-β-萘基)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物42)的制备

制备方法同实施例一。在步骤4中以β-萘甲醛代替α-萘甲醛依次反应，得白色晶体，产率53.2％。m.p.196～197℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.44(s,1H,OH),8.10(d,J＝4.9Hz,1H,ArH),8.03(d,J＝7.1Hz,2H,ArH),7.94(s,1H,ArH),7.92(s,1H,ArH),7.75(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.69(s,1H,NH),7.43(t,J＝5.1,1H,CH),7.13(d,J＝5.9Hz,1H,ArH),6.88(d,J＝5.7Hz,1H,ArH),5.37(s,2H,OH),5.16(t,J＝7.5Hz,1H,CH),4.48(s,1H,OH),3.55(dd,J₁＝3.9,J₂＝4.1Hz,1H,CH),3.46(t,J＝7.5Hz,1H,CH),3.38(d,J＝6.1Hz,1H,CH),3.35～3.18(m,2H,CH₂),2.62(s,3H,CH₃),2.00(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.79～1.21(m,15H,CH and CH₂),1.14(dd,J₁＝4.5Hz,J₂＝4.5Hz,1H,CH),0.91(s,3H,CH₃),0.85(s,3H,CH₃).ESI-MS:ESI-MS:666.8[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₄₀H₄₇N₃O₆:C,H,N.

实施例八：4-(5-(6-甲基-β-萘基)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物43)的制备

制备方法同实施例一。在步骤4中以β-萘甲醛代替α-萘甲醛依次反应，得白色晶体，产率55.7％。m.p.218～219℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.46(s,1H,OH),8.03(d,J＝7.9Hz,2H,ArH),7.80～7.72(m,4H,ArH),7.66(s,1H,NH),7.52(s,2H,ArH),7.40(d,J＝5.6Hz,2H,ArH),5.37(s,2H,OH),5.16(t,J＝7.5Hz,1H,CH),4.48(s,1H,OH),3.55(dd,J₁＝4.5Hz,J₂＝4.8Hz,1H,CH),3.46(t,J＝7.5Hz,1H,CH),3.34(d,J＝6.1Hz,1H,CH),3.30～3.11(m,2H,CH₂),2.66(s,3H,CH₃),2.00(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.79～1.21(m,15H,CH and CH₂),1.14(dd,J₁＝4.1Hz,J₂＝4.2Hz,1H,CH),0.89(s,3H,CH₃),0.84(s,3H,CH₃).ESI-MS:ESI-MS:666.8[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₄₀H₄₇N₃O₆:C,H,N.

实施例九：4-(5-(7-甲基-β-萘基)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物44)的制备

制备方法同实施例一。在步骤4中以β-萘甲醛代替α-萘甲醛依次反应，得白色晶体，产率62.7％。m.p.225～226℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.51(s,1H,OH),8.00(d,J＝7.9Hz,2H,ArH),7.76～7.69(m,5H,ArH and NH),7.55(d,J＝5.3Hz,2H,ArH),7.42(d,J＝5.9Hz,2H,ArH),5.31(s,2H,OH),5.18(t,J＝7.5Hz,1H,CH),4.48(s,1H,OH),3.55(dd,J₁＝4.5,J₂＝5.2Hz,1H,CH),3.46(t,J＝7.5Hz,1H,CH),3.33(d,J＝6.1Hz,1H,CH),3.31～3.18(m,2H,CH₂),2.65(s,3H,CH₃),1.98(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.79～1.21(m,15H,CH and CH₂),1.13(dd,J₁＝4.1Hz,J₂＝4.3Hz,1H,CH),0.90(s,3H,CH₃),0.76(s,3H,CH₃).ESI-MS:666.8[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₄₀H₄₇N₃O₆:C,H,N.

实施例十：4-(5-(8-甲基-β-萘基)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰氧肟酸(化合物45)的制备

制备方法同实施例一。在步骤4中以β-萘甲醛代替α-萘甲醛依次反应，得白色晶体，产率55.3％。m.p.238～239℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.53(s,1H,OH),8.09(s,1H,ArH),8.01～7.89(m,4H,ArH),7.75(d,J＝5.8Hz,2H,ArH),7.69(s,1H,NH),7.46(t,J＝7.1Hz,1H,ArH),7.10(d,J＝5.1Hz,1H,ArH),6.85(d,J＝5.5Hz,1H,ArH),5.37(s,2H,OH),5.16(t,J＝7.5Hz,1H,CH),4.48(s,1H,OH),3.55(dd,J₁＝4.5Hz,J₂＝5.2Hz,1H,CH),3.46(t,J＝7.4Hz,1H,CH),3.37(d,J＝6.1Hz,1H,CH),3.36～3.12(m,2H,CH₂),2.62(s,3H,CH₃),2.00(t,J＝4.7Hz,1H,CH),1.79～1.21(m,15H,CH and CH₂),1.13(dd,J₁＝4.4Hz,J₂＝4.6Hz,1H,CH),0.94(s,3H,CH₃),0.81(s,3H,CH₃).ESI-MS:666.8[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₄₀H₄₇N₃O₆:C,H,N.

实施例十一：含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物体外抗肿瘤活性关于抗肿瘤细胞增殖的研究

采用MTT[3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物体对人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)及肝癌细胞(HepG2)的半数抑制浓度(IC₅₀)。

(1)培养液(/L)的配制：①悬浮细胞：DMEM培养粉一袋(10.4g)，新生牛血清100mL，青霉素溶液(2×10^-5U/mL)0.5mL，链霉素溶液(2×10^-5U/mL)0.5mL，加三蒸水溶解后，用5.6％的NaHCO₃溶液调pH值至7.2-7.4，最后定容至1000mL。过滤灭菌。②贴壁细胞：同上，再加入NaHCO₃2.00g，HEPES 2.38g。

(2)D-Hanks缓冲液(每升)的配制：NaCl 8.00g，KCl 0.40g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.06g，KH₂PO₄0.06g，NaHCO₃0.35g。高压灭菌。

(3)胰蛋白酶液的配制：利用D-Hanks缓冲液配成浓度为0.5％胰蛋白酶液。过滤除菌。

(4)实验药液的配制：将测试样品用少量的三蒸水溶解配成储备液，即按实验最高浓度的10倍配制储备液。根据化合物溶解性不同，可用三蒸水直接溶解，或用少量DMSO助溶，再加三蒸水溶解。储备液保存于-20℃冰箱中备用。

(5)人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)以及肝癌细胞(HepG2)的培养：为贴壁生长细胞，常规培养于DMEM培养液内(含10％小牛血清、100U/mL链霉素)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔3-4d传代一次。传代时将原瓶中培养液转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃去原培养液，加入等量新鲜培养液，吹打均匀，移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原体积(培养液体积约为培养瓶容量的1/10)。

(6)细胞孵育：取对数生长期的肿瘤细胞，调细胞悬液浓度为1-1.5×10⁵个/mL。在96孔培养板中每孔加细胞悬液100μL，置37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。培养24h后，分别按设计加入药液。

(7)加药：将测试药液按照最终浓度的浓度梯度分别加入到各个孔中，每个浓度设6个平行孔。实验分为药物试验组(分别加入不同浓度的测试药)、对照组(只加培养液和细胞，不加测试药)和空白组(只加培养液，不加细胞和测试药)。将加药后的96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。阳性对照药物的活性按照测试样品的方法测定。

(8)存活细胞的测定：在培养了48h后的96孔板中，每孔加MTT 40μL(用D-Hanks缓冲液配成4mg/mL)。在37℃放置4h后，移去上清液。每孔加150μL DMSO，振荡5min，使formazan结晶溶解。最后，利用自动酶标仪在570nm波长处检测各孔的光密度(OD值)。

半数抑制浓度(IC₅₀)定义为当50％的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测定的光密度(OD值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。

测得的IC₅₀见表1所示。

表1本发明所列含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物对肿瘤细胞的抑制IC₅₀值(μmol/mL)

^a6次平行试验，实验结果取平均值，误差在5-10％之间

从上可知：本发明的含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物对人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)和肝癌细胞(HepG2)有明显的抑制作用，尤其是对A549细胞最好，对比Tenacissoside A的抑制活性有明显提高，对比阳性对照药则表现出了相当或者优于阳性对照药物的抑制活性。因此本发明的含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物可以应用于制备抗肿瘤药物。

实施例十二：含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物体外抗肿瘤活性关于细胞毒性的研究

本发明测试了新合成化合物36-45对人肾上皮细胞(293T)的细胞毒性，细胞毒性结果如表2，以Celecoxib和Tenacissoside A作为阳性对照。每个化合物的毒性用抑制T细胞存活率到50％时的浓度(CC₅₀)来表示。

实验方法：

(1)培养人肾上皮细胞(293T)直至达到其对数生长期末细胞趋于融合，用细胞消化液消化分散细胞，用细胞培养液配制成1×10⁴个/mL的细胞悬液。取96孔培养板，每孔中加入100μL的细胞悬液。轻轻水平转动培养板使细胞均匀地分散在皿孔的表面。

(2)置于含5％CO₂细胞培养箱中，在37±2℃温度下培养24h。弃去原培养液，每孔加入100μL的空白对照液，阴性对照液，阳性对照液，100％和50％浓度的试验样品浸提液。每组至少设8孔。注：浸提原液或以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。采用0.9％氯化钠注射液浸提时，在稀释浸提时使用浓缩的2倍培养基。

(3)置于含5％CO₂培养箱中，在37±2℃温度下进行培养。培养48h。

(4)每个培养间期后，每孔加入MTT溶液20μL，置于含5％CO₂培养箱中，在37±2℃温度下培养5h。

(5)弃去孔内液体，每孔分别加入200μL DMSO，将培养板放置10min，水平摇晃使孔内溶液颜色均匀。

(6)用酶标仪测定吸光度，波长采用570nm。

测得的CC₅₀见表2所示。

表2本发明所列含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C21甾体皂苷苷元衍生物对293T细胞的抑制CC₅₀值(μmol/mL)

^a6次平行试验，实验结果取平均值，误差在5-10％之间

本发明的含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物对人肾上皮细胞(293T)表现出了相当或者优于阳性对照药物的细胞毒性，同Tenacissoside A相比，细胞毒性也几乎持平。因此本发明的含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物可以应用于制备抗肿瘤药物。

发明人认为：氧肟酸结构式为R-CO-NHOH，是一种有机螯合剂，能与Cu²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺离子等形成稳定的金属螯合物，其具有显著的络合能力。二氢吡唑是极为重要的含氮的五元杂环化合物，它具有优异的抗肿瘤活性。萘环骨架除了具有优秀的抗菌活性，而且也具有优秀的抗肿瘤活性。

总之，本发明将具有优秀生物活性的萘环骨架以及氧肟酸基团引入到二氢吡唑衍生物中，同时结合了具有很好活性的C₂₁甾体皂苷苷元骨架，设计合成了一系列含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物，期望具有更好的生物活性、更高的选择性、更低的毒性以及更短的残效期等。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物，其特征在于，结构如式IX所示，

其中R₁选自H或CH₃；R₂选自H或CH₃；R₃选自H或CH₃；R₄选自H或CH₃。

2.一种结构如式IX所示的含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，

其中R₁选自H或CH₃；R₂选自H或CH₃；R₃选自H或CH₃；R₄选自H或CH₃；

其特征在于，包括以下步骤：

步骤1在-5～5℃下，向反应器中加入无水甲醇、氯化亚砜、结构式如I所示的化合物，反应后得到结构式如II所示的化合物；

步骤2在室温搅拌下，向反应器中加入结构式如III所示的化合物、稀盐酸、无水乙醇，反应结束后，得到结构式如IV所示的化合物；

步骤3在冰水浴搅拌作用下，向反应器中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物、如IV所示的化合物，反应结束后，得到结构式如V所示的化合物；

步骤4在室温搅拌下，向反应器中加入结构式如V所示的化合物、KOH水溶液、不同取代基的萘甲醛、乙醇，反应结束后得到结构式如VI所示的化合物；

步骤5将结构式如VI所示的化合物、无水乙醇、结构式如II所示的化合物、冰醋酸加入到反应器中，反应后得到结构式如VII所示的化合物；

步骤6将盐酸羟胺、甲醇钠加入无水甲醇中，向其中加入结构式如VII所示的化合物，反应结束后，得到结构式如VIII所示的化合物；

步骤7在-25～-15℃搅拌下，向反应器中加入结构式如VIII所示的化合物、二氯甲烷、三溴化硼，反应结束后，得到结构式如IX所示的化合物；

式VI到IX中，R₁选自H或CH₃；R₂选自H或CH₃；R₃选自H或CH₃；R₄选自H或CH₃。

3.如权利要求2所述的含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤1进一步为：

在-5～5℃下，依次向反应器中加入无水甲醇、氯化亚砜、对肼基苯甲酸，搅拌30～60min后，常温继续搅拌3～5h，过滤，得到的固体依次用蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体产物溶于无水乙醇，重结晶，得到酯化物对肼基苯甲酸甲酯。

4.如权利要求2所述的含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤2进一步为：

在室温搅拌下，依次向反应器中加入结构式如III所示的化合物、稀盐酸、无水乙醇，搅拌0.5～1.5h后，回流反应7～9h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，得到的固体依次用稀盐酸、蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇，重结晶，得到结构式如IV所示的化合物。

5.如权利要求2所述的含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤3进一步为：

在冰水浴搅拌作用下，依次向反应器中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物、结构式如IV所示的化合物，反应20～40min后，再回流反应5～7h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，得到固体依次用稀盐酸、蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体产物溶于无水乙醇，重结晶，得到结构式如V所示的化合物。

6.如权利要求2所述的含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤4进一步为：

在室温搅拌下，依次向反应器中加入结构式如V所示的化合物、KOH水溶液、不同取代基的萘甲醛、乙醇，继续搅拌反应3～6h后，稀盐酸酸化调节pH至中性，过滤，得到的固体依次用蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥得到结构式如VI所示的化合物。

7.如权利要求2所述的含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤5进一步为：

依次将结构式如VI所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯、冰醋酸加入到反应器中，室温搅拌反应40～80min后，有部分固体不溶；接着回流反应5～7h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体依次用稀盐酸、蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤，干燥，将得到的固体产物溶于无水乙醇，重结晶，得到结构式如VII所示的化合物。

8.如权利要求2所述的含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤6进一步为：

将盐酸羟胺、甲醇钠加入无水甲醇中，加热搅拌20～40min后，过滤掉固体，得到活化的羟胺溶液，在向其中加入结构式如VII所示的化合物，回流反应3～5h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到结构式为VII所示的化合物。

9.如权利要求2所述的含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤7进一步为：

在-25～-15℃搅拌下，依次向反应器中加入结构式如VII所示的化合物、二氯甲烷，并逐步滴加三溴化硼，搅拌40～80min后，室温继续反应10～14h，TLC跟踪反应，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到结构式如VIII所示的化合物，即目标产物。

10.一种结构如式IX所示的含萘环骨架的二氢吡唑氧肟酸C₂₁甾体皂苷苷元衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，

其中R₁选自H或CH₃；R₂选自H或CH₃；R₃选自H或CH₃；R₄选自H或CH₃。