CN104829683A - 含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪c21甾体皂苷苷元衍生物,及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物，及其制备方法与应用。本发明以具有C₂₁甾体皂苷母核的化合物为起始化合物，对其进行结构修饰研究，得到了如下式所示的化合物。并通过药理研究，结果表明此类化合物对人乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞有明显的抑制作用。其中，R₁为H或CH₃；R₂为H或CH₃；R₃为H或F；R₄为H或CH₃。

Description

含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C21甾体皂苷苷元衍生物,及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物合成领域，具体涉及一种含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物，及其制备方法与应用。

背景技术

吲哚类化合物是一类重要的杂环衍生物生物碱,该类化合物的癌症治疗作用得到了普遍的关注.其代表类吲哚类化合物，长春碱、吲哚美辛、褪黑素、靛玉红等，均在不同方面有着不错的抗肿瘤活性。

哌嗪，又称六氢吡嗪，是分子中含2个氮原子的六元杂环，其生成焓高、热稳定性好，是富氮杂环化合物的理想结构单元，为很多药物的重要组成部分。哌嗪化合物与传统的有机药物相比，具有更好的氮平衡对称结构。哌嗪类药物大多具有作用起效快、副反应小、毒性低、无成瘾性等特点，因而受到科研界的广泛关注。但是，这类药物大多水溶性较差，限制了它作为口服药和注射药剂的临床应用。

C₂₁甾体皂苷，是从中药通关藤中经过提取分离纯化得到的甾体皂苷类成分，其苷元是由21个C原子构成的独特甾体皂苷结构，因此称其为C₂₁甾体皂苷。具有C₂₁甾体皂苷母核的化合物具有免疫调节、平喘等药理活性，在临床上已经作为药物的指标性活性成分在临床上已经得到了较广泛的应用。

吡唑是一类重要的杂环化合物，广泛分布在自然界中。自从含吡唑环的安替吡啉被发现具有镇痛、消炎及退热作用以来，该类化合物因其具有高效、低毒，以及其环上取代基的多方位变换的性质，而在药物领域中得到广泛应用。例如二氢吡唑，是极为重要的含氮的五元杂环化合物，它具有很多优异的生物活性，比如抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗真菌、抗结核、杀虫等活性。它是一个具有各种药理特性的结构性存在亚基，存在普遍药用生物活性的活性化合物先导。除此之外，由于二氢吡唑多是手性的，可以导致环上的取代及分子的构象具有更大的多变性，因而，具有更好的生物活性潜质。

基于上述化合物的各自的特点，如果能够将具有优秀生物活性的吲哚骨架以及哌嗪基团引入到二氢吡唑衍生物中，同时结合具有很好活性的C₂₁甾体皂苷苷元骨架，从而得到一类新的化合物，并应用于抗癌领域，是值得人们研究的课题。

发明内容

发明目的：本发明合成了一系列的含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物，并提供了该类化合物的制备方法以及其在抗肿瘤领域的应用。

技术方案：本发明以具有C₂₁甾体皂苷母核的化合物为起始化合物，对其进行结构修饰研究，得到了一类含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物，并通过药理研究，结果表明此类化合物具有显著的抗肿瘤活性。

本发明公开了一系列的含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物，该类化合物具有以下通式：

其中，R₁为H或CH₃；R₂为H或CH₃；R₃为H或F；R₄为H或CH₃。

本发明所述的具有C₂₁甾体皂苷母核的化合物通关藤苷A(Tenacissoside A)；是从中药通关藤分离纯化得到的，分子式为C₄₈H₇₄O₁₉，分子量为954，纯度为99.2％，其结构式如下：

本发明所述的含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的制备方法包括以下步骤：

将对肼基苯甲酸与无水甲醇、氯化亚砜混合，反应得到对肼基苯甲酸甲酯；

将结构式如式I所示的C₂₁甾体皂苷与稀盐酸、无水乙醇反应，得到如式II所示的C₂₁甾体皂苷苷元；将如式II所示的C₂₁甾体皂苷苷元与重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物反应，得到如式III所示的晶体状中间物；

将如式III所示的中间物与KOH水溶液、不同取代基的吲哚-3-甲醛、乙醇反应，得到如式IV所示的中间物；将如式IV所示的化合物与无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯、冰醋酸反应，得到如式V所示的中间物；将如式V所示的中间物KOH加入到甲醇、THF水的混合溶液中，反应得到如式VI所示的化合物；

将如式VI所示的化合物和N-甲基哌嗪加入到二氯甲烷里，滴加含有DCC/DMAP的二氯甲烷混合溶液，反应得到如式VII所示的中间物；将如式VII所示的中间物与二氯甲烷、三溴化硼反应，得到如式VIII所示的晶体状目标化合物，

式IV到式VIII中，R₁为H或CH₃；R₂为H或CH₃；R₃为H或F；R₄为H或CH₃。

进一步地，本发明所述的制备方法，按以下步骤进行：

步骤1，在-5～5℃下，向反应器中加入无水甲醇、氯化亚砜、对肼基苯甲酸，搅拌0.5～1h左右后，常温继续搅拌3～5h，反应结束后，过滤，将得到的固体洗涤，干燥，重结晶，得到对肼基苯甲酸甲酯。

步骤2，在室温搅拌下，向反应器中加入结构式如I所示的C₂₁甾体皂苷TenacissosideA、稀盐酸、无水乙醇，搅拌0.5～1.5h后，接着回流反应7～9h，反应结束后，过滤，将所得固体洗涤，干燥，重结晶，得到部分还原化的晶体状如式II所示的C₂₁甾体皂苷苷元。

步骤3，在冰水浴搅拌作用下，向反应器中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物、如式II所示的C₂₁甾体皂苷苷元，搅拌0.2～1h左右后，再回流反应5～7h，反应结束后，过滤，将所得固体洗涤，干燥，重结晶，得到如式III所示的晶体状中间物。

步骤4，在室温搅拌下，向反应器中加入如式III所示的中间物、KOH水溶液、不同取代基的吲哚-3-甲醛、乙醇，搅拌反应3～5h后，稀盐酸酸化，调节pH为6～7，过滤，将所得固体洗涤，干燥，得到如式IV所示的中间物。

步骤5，将如式IV所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯、冰醋酸加入到反应器中，室温搅拌反应0.5～1.5h后，仍有部分固体不溶；接着回流反应5～7h，反应结束后，过滤，将固体洗涤，干燥，重结晶，得到如式V所示的晶体状中间物。

步骤6，将如式V所示的化合物、KOH加入到甲醇、THF水的混合溶液中，回流反应5～7h，反应结束后，稀盐酸酸化调节pH值小于7，将溶液倒入饱和食盐水中，过滤，将所得固体洗涤，真空干燥，重结晶，得到如式VI所示的晶体状化合物。

步骤7，把如式VI所示的化合物和N-甲基哌嗪加入到二氯甲烷里，混匀溶解，在-5～5℃左右搅拌下滴加含有DCC/DMAP的二氯甲烷混合溶液，反应0.5～1h左右后，在30～40℃搅拌下接着反应6～10h，反应结束后，将反应液倒入饱和食盐水中，过滤，将所得固体洗涤，干燥，重结晶，得到如式VII所示的晶体状中间物。

步骤8，在-25～-15℃搅拌下，向反应器中加入如式VII所示的中间物、二氯甲烷，并逐步滴加三溴化硼，继续搅拌反应0.5～1.5h左右后，室温继续反应10～14h，反应结束后，过滤，将所得固体洗涤，真空干燥，重结晶，得到如式VIII所示的晶体状目标化合物。

所述的步骤1～步骤7中采用TLC跟踪反应，展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2

所述的步骤8中采用TLC跟踪反应，展开剂V_AcOEt:V_正己烷＝1:2

所述步骤1～步骤8中的洗涤方法为：依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤

所述的各步骤中重结晶的溶剂为无水乙醇。

更进一步的，本发明的合成线路及具体制备步骤如下：

步骤1.在0±5℃下，依次向圆底烧瓶中加入无水甲醇、氯化亚砜、对肼基苯甲酸1，搅拌1h左右后，常温继续搅拌3-5h，过滤，得到的固体依次用蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到酯化物对肼基苯甲酸甲酯2。

步骤2.在室温搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入Tenacissoside A(一种C₂₁甾体皂苷)3、稀盐酸、无水乙醇，搅拌1h后，回流反应7-9h。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2)，反应结束后，过滤，得到的固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到部分还原化的晶体状C₂₁甾体皂苷苷元4。

步骤3.在冰水浴搅拌作用下，依次向圆底烧瓶中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物、C₂₁甾体皂苷苷元4，反应0.5h左右后，再回流反应5-7h。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2)，反应结束后，过滤，得到固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到晶体状中间物5。

步骤4.在室温搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入中间物5、KOH水溶液、不同取代基的吲哚-3-甲醛、乙醇，继续搅拌反应4h后，稀盐酸酸化调节pH，过滤，得到的固体依次用蒸馏水(3×100mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥得中间体6-10。

步骤5.依次将不同的化合物6-10、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯2、冰醋酸加入到圆底烧瓶中，室温搅拌反应1h后，仍有部分固体不溶；接着回流反应5h，TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2)，反应结束后，过滤，固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到晶体状中间物11-15。

步骤6.将化合物11-15、KOH加入到甲醇、THF水的混合溶液中，回流反应5h左右后。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2)，反应结束后，稀盐酸酸化调节pH至酸性，将溶液倒入饱和食盐水中，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状化合物16-20。

步骤7.把化合物16-20和N-甲基哌嗪加入到二氯甲烷里，混匀溶解，在0℃左右搅拌下滴加含有DCC/DMAP的二氯甲烷混合溶液，反应0.5h左右后，在35±5℃搅拌下接着反应8h左右。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2)，反应结束后，将反应液倒入饱和食盐水中，过滤，固体依次用稀盐酸(3×100mL)、蒸馏水(3×150mL)、冷乙醇(3×50mL)、蒸馏水(3×100mL)洗涤，干燥，将得到的固体粗产物溶于无水乙醇重结晶得到晶体状中间物21-25。

步骤8.在-20±5℃搅拌下，依次向圆底烧瓶中加入对应的中间物21-25、二氯甲烷，并逐步滴加三溴化硼，搅拌1h左右后，室温继续反应12h左右。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_正己烷＝1:2)，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇，重结晶提纯，得到晶体状目标化合物26-30。

本发明所述的(如下式所示)含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物，对人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)和肝癌细胞(HepG2)有明显的抑制作用，同时对人肾上皮细胞(293T)表现出了相当或者优于阳性对照药物Celecoxib的细胞毒性。因此本发明的含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物可以应用于制备抗肿瘤药物。

其中，R₁为H或CH₃；R₂为H或CH₃；R₃为H或F；R₄为H或CH₃。

有益效果：1，本发明所提供的含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物结构新颖，与现有技术中相关化合物相比，具有更好的生物活性、更高的选择性、更低的毒性以及更短的残效期。2，本发明所提供的合成路线易于实现且重复性好。3，本发明提供的化合物可以应用于抗肿瘤药物，其对人乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞有明显的抑制作用，同时毒性较小。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方式对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的并不局限于所述实施例。

实施例一：

N-甲基-4-(5-(3-吲哚)-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰哌嗪(化合物26)的制备

在-20℃搅拌下，依次向50mL的圆底烧瓶中加入步骤7得到的相应中间物21(10.0mmol)、二氯甲烷(25mL)，并逐步滴加三溴化硼(5mmol)继续搅拌反应1h后，将反应烧瓶转移至室温，继续反应12h。TLC跟踪反应(展开剂V_AcOEt:V_正己烷＝1:2)，反应结束后，过滤，固体用蒸馏水洗涤，最后真空干燥，将得到的固体溶于无水乙醇重结晶提纯得到晶体状目标化合物。

得白色晶体，产率47.1％。m.p.213～215℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.79(s,1H,NH),7.93(dd,J₁＝7.1,J₂＝7.2Hz,4H,ArH),7.58(d,J＝5.8Hz,1H,ArH),7.34(d,J＝5.5Hz,1H,ArH),7.18(s,1H,CH),7.10～6.95(m,2H,ArH),5.36(s,2H,OH),5.19(t,J＝7.3Hz,1H,CH),4.49(s,1H,OH),3.54(dd,J₁＝4.7,J₂＝4.8Hz,1H,CH),3.45～3.38(m,5H,CH and CH₂),3.36(d,J＝6.8Hz,1H,CH),3.34～3.01(m,2H,CH₂),2.30(t,J＝5.2Hz,4H,CH₂),2.17(s,3H,CH₃),2.01(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.79～1.21(m,15H,CH and CH₂),1.14(dd,J₁＝7.2Hz,J₂＝7.1Hz,1H,CH),0.89(s,3H,CH₃),0.84(s,3H,CH₃).ESI-MS:708.9[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₄₂H₅₃N₅O₅:C,H,N.

实施例二：

N-甲基-4-(5-(3-(7-甲基-吲哚))-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰哌嗪(化合物27)的制备

制备方法同实施例一。得白色晶体，产率45.3％。m.p.225～226℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.79(s,1H,NH),8.00(d,J＝8.4Hz,2H,ArH),7.72(d,J＝6.9Hz,2H,ArH),7.48(d,J＝5.8Hz,1H,ArH),7.21(d,J＝5.5Hz,1H,ArH),7.18(s,1H,CH),7.06(t,J＝7.3Hz,1H,CH),5.35(s,2H,OH),5.19(t,J＝7.3Hz,1H,CH),4.49(s,1H,OH),3.54(dd,J₁＝4.7,J₂＝4.8Hz,1H,CH),3.47～3.36(m,6H,CH and CH₂),3.32～3.13(m,2H,CH₂),2.68(s,3H,CH₃),2.33(t,J＝5.8Hz,4H,CH₂),2.18(s,3H,CH₃),2.01(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.74～1.21(m,15H,CH and CH₂),1.14(dd,J₁＝7.2Hz,J₂＝7.1Hz,1H,CH),0.89(s,3H,CH₃),0.84(s,3H,CH₃).ESI-MS:722.9[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₄₃H₅₅N₅O₅:C,H,N.

实施例三：

N-甲基-4-(5-(3-(6-甲基-吲哚))-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰哌嗪(化合物28)的制备

制备方法同实施例一。得白色晶体，产率42.3％。m.p.217～218℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.78(s,1H,NH),7.93(dd,J₁＝7.1,J₂＝7.3Hz,4H,ArH),7.55(d,J＝5.8Hz,1H,ArH),7.21(d,J＝5.5Hz,1H,ArH),7.18(s,1H,CH),7.06(s,1H,ArH),5.37(s,2H,OH),5.19(t,J＝7.3Hz,1H,CH),4.49(s,1H,OH),3.54(dd,J₁＝4.7,J₂＝4.8Hz,1H,CH),3.47～3.08(m,8H,CH and CH₂),2.44(s,3H,CH₃),2.35(t,J＝4.9Hz,4H,CH₂),2.20(s,3H,CH₃),2.01(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.79～1.21(m,15H,CH and CH₂),1.14(dd,J₁＝7.2Hz,J₂＝7.1Hz,1H,CH),0.88(s,3H,CH₃),0.85(s,3H,CH₃).ESI-MS:722.9[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₄₃H₅₅N₅O₅:C,H,N.

实施例四：

N-甲基-4-(5-(3-(6-甲基-吲哚))-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰哌嗪(化合物29)的制备

制备方法同实施例一。得白色晶体，产率37.3％。m.p.236～237℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.84(s,1H,NH),7.93(dd,J₁＝7.1,J₂＝7.3Hz,4H,ArH),7.55(d,J＝5.8Hz,1H,ArH),7.21(d,J＝5.5Hz,1H,ArH),7.18(s,1H,CH),7.06(s,1H,ArH),5.32(s,2H,OH),5.19(t,J＝7.3Hz,1H,CH),4.49(s,1H,OH),3.55(dd,J₁＝4.4,J₂＝4.3Hz,1H,CH),3.43～3.06(m,8H,CH and CH₂),2.55(s,3H,CH₃),2.37(t,J＝5.8Hz,4H,CH₂),2.18(s,3H,CH₃),2.01(t,J＝7.1Hz,1H,CH),1.79～1.21(m,15H,CH and CH₂),1.14(dd,J₁＝7.2Hz,J₂＝7.1Hz,1H,CH),0.90(s,3H,CH₃),0.85(s,3H,CH₃).ESI-MS:722.9[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₄₃H₅₅N₅O₅:C,H,N.

实施例五：

N-甲基-4-(5-(3-(6-氟-吲哚))-3-((3aR,4aS,8S,10aS,11S,12S,12aS)-(8,11,12-三羟基)-(10a,12a-二甲基)-(1,2-环戊烷基)-1,10a-b-环氧正十四碳烷基)-(4,5-二氢吡唑))苯甲酰哌嗪(化合物30)的制备

制备方法同实施例一。得白色晶体，产率68.2％。m.p.213～215℃；¹H NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ:10.49(s,1H,OH),7.98(dd,J₁＝7.0,J₂＝7.6Hz,2H,ArH),7.66(d,J＝5.4Hz,2H,ArH),7.24(d,J＝3.7Hz,1H,ArH),7.18(s,1H,CH),6.89(s,2H,ArH),5.38(s,2H,OH),5.19(t,J＝7.3Hz,1H,CH),4.47(s,1H,OH),3.58(dd,J₁＝4.4,J₂＝4.9Hz,1H,CH),3.51～3.40(m,6H,CH and CH₂),3.14～2.55(m,2H,CH₂),2.34(t,J＝5.3Hz,4H,CH₂),2.17(s,3H,CH₃),2.01(t,J＝5.5Hz,1H,CH),1.84～1.16(m,15H,CH and CH₂),1.14(dd,J₁＝7.2Hz,J₂＝7.1Hz,1H,CH),0.86(s,3H,CH₃),0.78(s,3H,CH₃).ESI-MS:726.9[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₄₂H₅₂FN₄O₆:C,H,N.

实施例六：

含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物体外抗肿瘤活性关于抗肿瘤细胞增殖的研究

采用MTT[3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物对人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)及肝癌细胞(HepG2)的半数抑制浓度(IC₅₀)。

(1)培养液(/L)的配制：①悬浮细胞：DMEM培养粉一袋(10.4g)，新生牛血清100mL，青霉素溶液(2×10^-5U/mL)0.5mL，链霉素溶液(2×10^-5U/mL)0.5mL，加三蒸水溶解后，用5.6％的NaHCO₃溶液调pH值至7.2-7.4，最后定容至1000mL。过滤灭菌。②贴壁细胞：同上，再加入NaHCO₃2.00g，HEPES 2.38g。

(2)D-Hanks缓冲液(每升)的配制：NaCl8.00g，KCl 0.40g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.06g，KH₂PO₄0.06g，NaHCO₃0.35g。高压灭菌。

(3)胰蛋白酶液的配制：利用D-Hanks缓冲液配成浓度为0.5％胰蛋白酶液。过滤除菌。

(4)实验药液的配制：将测试样品用少量的三蒸水溶解配成储备液，即按实验最高浓度的10倍配制储备液。根据化合物溶解性不同，可用三蒸水直接溶解，或用少量DMSO助溶，再加三蒸水溶解。储备液保存于-20℃冰箱中备用。

(5)人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、肺癌细胞(A549)以及肝癌细胞(HepG2)的培养：为贴壁生长细胞，常规培养于DMEM培养液内(含10％小牛血清、100U/mL链霉素)，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔3-4d传代一次。传代时将原瓶中培养液转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃去原培养液，加入等量新鲜培养液，吹打均匀，移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原体积(培养液体积约为培养瓶容量的1/10)。

(6)细胞孵育：取对数生长期的肿瘤细胞，调细胞悬液浓度为1-1.5×10⁵个/mL。在96孔培养板中每孔加细胞悬液100μL，置37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。培养24h后，分别按设计加入药液。

(7)加药：将测试药液按照最终浓度的浓度梯度分别加入到各个孔中，每个浓度设6个平行孔。实验分为药物试验组(分别加入不同浓度的测试药)、对照组(只加培养液和细胞，不加测试药)和空白组(只加培养液，不加细胞和测试药)。将加药后的96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。阳性对照药物的活性按照测试样品的方法测定。

(8)存活细胞的测定：在培养了48h后的96孔板中，每孔加MTT 40μL(用D-Hanks缓冲液配成4mg/mL)。在37℃放置4h后，移去上清液。每孔加150μL DMSO，振荡5min，使formazan结晶溶解。最后，利用自动酶标仪在570nm波长处检测各孔的光密度(OD值)。

半数抑制浓度(IC₅₀)定义为当50％的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测定的光密度(OD值)，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。

测得的IC₅₀见表1所示。

表1本发明所列含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物对肿瘤细胞的抑制IC₅₀值(μmol/mL)

^a6次平行试验，实验结果取平均值，误差在5-10％之间

实施例七：

含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物体外抗肿瘤活性关于细胞毒性的研究

本发明测试了新合成化合物26-30对人肾上皮细胞(293T)的细胞毒性，细胞毒性结果如表2，以Celecoxib作为阳性对照。每个化合物的毒性用抑制T细胞存活率到50％时的浓度(CC₅₀)来表示。

实验方法：

(1)培养人肾上皮细胞(293T)直至达到其对数生长期末细胞趋于融合，用细胞消化液消化分散细胞，用细胞培养液配制成1×10⁴个/mL的细胞悬液。取96孔培养板，每孔中加入100μL的细胞悬液。轻轻水平转动培养板使细胞均匀地分散在皿孔的表面。

(2)置于含5％CO₂细胞培养箱中，在37±2℃温度下培养24h。弃去原培养液，每孔加入100μL的空白对照液，阴性对照液，阳性对照液，100％和50％浓度的试验样品浸提液。每组至少设8孔。注：浸提原液或以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。采用0.9％氯化钠注射液浸提时，在稀释浸提时使用浓缩的2倍培养基。

(3)置于含5％CO₂培养箱中，在37±2℃温度下进行培养。培养48h。

(4)每个培养间期后，每孔加入MTT溶液20μL，置于含5％CO₂培养箱中，在37±2℃温度下培养5h。

(5)弃去孔内液体，每孔分别加入200μL DMSO，将培养板放置10min，水平摇晃使孔内溶液颜色均匀。

(6)用酶标仪测定吸光度，波长采用570nm。

测得的CC₅₀见表2所示。

表2本发明所列含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C21甾体皂苷苷元衍生物对293T细胞的抑制CC₅₀值(μmol/mL)

^a6次平行试验，实验结果取平均值，误差在5-10％之间

上述实施例表明，本发明的含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物对人肾上皮细胞(293T)表现出了相当或者优于阳性对照药物的细胞毒性。

本发明针对C₂₁甾体皂苷母核的化合物进行结构修饰研究，针对其结构特征进行药理活性研究，结果表明，具有C₂₁甾体皂苷母核的化合物具有良好的抗肿瘤的活性，对多种肿瘤具有较好的抑制作用，如对肝癌、肺癌、食道癌等均具有较好的抑制活性。同时对人肾上皮细胞表现出了相当或者优于阳性对照药物Celecoxib的细胞毒性。

Claims (7)

1.一种含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物，其特征在于具有以下通式：

其中，R₁为H或CH₃；R₂为H或CH₃；R₃为H或F；R₄为H或CH₃。

2.一种含吲哚骨架的二氢吡唑哌嗪C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

将对肼基苯甲酸与无水甲醇、氯化亚砜混合，反应得到对肼基苯甲酸甲酯；

将结构式如式I所示的C₂₁甾体皂苷与稀盐酸、无水乙醇反应，得到如式II所示的C₂₁甾体皂苷苷元；将如式II所示的C₂₁甾体皂苷苷元与重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物反应，得到如式III所示的晶体状中间物；

将如式III所示的中间物与KOH水溶液、不同取代基的吲哚-3-甲醛、乙醇反应，得到如式IV所示的中间物；将如式IV所示的化合物与无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯、冰醋酸反应，得到如式V所示的中间物；将如式V所示的中间物KOH加入到甲醇、THF水的混合溶液中，反应得到如式VI所示的化合物；

将如式VI所示的化合物和N-甲基哌嗪加入到二氯甲烷里，滴加含有DCC/DMAP的二氯甲烷混合溶液，反应得到如式VII所示的中间物；将如式VII所示的中间物与二氯甲烷、三溴化硼反应，得到如式VIII所示的晶体状目标化合物，

式IV到式VIII中，R₁为H或CH₃；R₂为H或CH₃；R₃为H或F；R₄为H或CH₃。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

步骤1，在-5～5℃下，向反应器中加入无水甲醇、氯化亚砜、对肼基苯甲酸，搅拌0.5～1h左右后，常温继续搅拌3～5h，反应结束后，过滤，将得到的固体洗涤，干燥，重结晶，得到对肼基苯甲酸甲酯；

步骤2，在室温搅拌下，向反应器中加入结构式如I所示的C₂₁甾体皂苷TenacissosideA、稀盐酸、无水乙醇，搅拌0.5～1.5h后，接着回流反应7～9h，反应结束后，过滤，将所得固体洗涤，干燥，重结晶，得到部分还原化的晶体状如式II所示的C₂₁甾体皂苷苷元；

步骤3，在冰水浴搅拌作用下，向反应器中加入重氮甲烷乙醚混合液、三氟化硼-乙醚络合物、如式II所示的C₂₁甾体皂苷苷元，搅拌0.2～1h左右后，再回流反应5～7h，反应结束后，过滤，将所得固体洗涤，干燥，重结晶，得到如式III所示的晶体状中间物；

步骤4，在室温搅拌下，向反应器中加入如式III所示的中间物、KOH水溶液、不同取代基的吲哚-3-甲醛、乙醇，搅拌反应3～5h后，稀盐酸酸化，调节pH为6～7，过滤，将所得固体洗涤，干燥，得到如式IV所示的中间物；

步骤5，将如式IV所示的化合物、无水乙醇、对肼基苯甲酸甲酯、冰醋酸加入到反应器中，室温搅拌反应0.5～1.5h后，仍有部分固体不溶；接着回流反应5～7h，反应结束后，过滤，将固体洗涤，干燥，重结晶，得到如式V所示的晶体状中间物；

步骤6，将如式V所示的化合物、KOH加入到甲醇、THF水的混合溶液中，回流反应5～7h，反应结束后，稀盐酸酸化调节pH值小于7，将溶液倒入饱和食盐水中，过滤，将所得固体洗涤，真空干燥，重结晶，得到如式VI所示的晶体状化合物；

步骤7，把如式VI所示的化合物和N-甲基哌嗪加入到二氯甲烷里，混匀溶解，在-5～5℃左右搅拌下滴加含有DCC/DMAP的二氯甲烷混合溶液，反应0.5～1h左右后，在30～40℃搅拌下接着反应6～10h，反应结束后，将反应液倒入饱和食盐水中，过滤，将所得固体洗涤，干燥，重结晶，得到如式VII所示的晶体状中间物；

步骤8，在-25～-15℃搅拌下，向反应器中加入如式VII所示的中间物、二氯甲烷，并逐步滴加三溴化硼，继续搅拌反应0.5～1.5h左右后，室温继续反应10～14h，反应结束后，过滤，将所得固体洗涤，真空干燥，重结晶，得到如式VIII所示的晶体状目标化合物。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的步骤1～步骤7中采用TLC跟踪反应，展开剂V_AcOEt:V_PE＝1:2；所述的步骤8中采用TLC跟踪反应，展开剂V_AcOEt:V_{正 己烷}＝1:2。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述各步骤中洗涤的方法为：依次用稀盐酸、蒸馏水、冷乙醇、蒸馏水洗涤。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的重结晶的溶剂为无水乙醇。

7.一种如下式所示的C₂₁甾体皂苷苷元衍生物的应用，其特征在于将其应用于制备抗肿瘤药物中，

其中，R₁为H或CH₃；R₂为H或CH₃；R₃为H或F；R₄为H或CH₃。