CN104826111B - 上转换纳米晶体‑竹红菌素复合物的制备方法及制得的复合物在光敏治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

一种上转换NaYF₄：yb³⁺，Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物的制备方法，采用水热法合成激发波长980nm，上转换荧光波长470nm的上转换NaYF₄：yb³⁺，Tm³⁺纳米晶体，酸性条件去除所述纳米晶体的表面修饰物，得到所述纳米晶体水溶液，加入竹红菌素溶液，孵育，透析除掉未吸附的竹红菌素及溶剂，得到所述的纳米晶体一竹红菌素复合物。本发明方法在上转换纳米晶体表面负载竹红菌素形成复合体，达到使竹红菌素长波敏化的目的，克服了竹红菌素激发波长短，治疗光源组织穿透深度浅的缺点，从而推动其在治疗体内实体肿瘤中的应用。本发明还涉及所述方法制备的复合物在制备光敏治疗药物中的应用。

Description

上转换纳米晶体-竹红菌素复合物的制备方法及制得的复合 物在光敏治疗中的应用

技术领域

本发明属于具有光动力活性的光敏剂技术领域，涉及一种长波敏化的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物的制备方法及制得的复合物在光敏治疗中的应用。

背景技术

光动力疗法（photodynamic therapy，简称PDT）又称光辐射疗法或光化学疗法，是一种新型肿瘤治疗手段。其原理是利用光源敏化肿瘤部位的光疗抗癌药发生光化学反应，产生活性氧诱导肿瘤损伤。在光动力疗法治疗肿瘤的过程中，选择具有优良活性氧产生能力的光疗药物为关键因素。至今已有血卟啉衍生物、金属酞菁、二氢卟吩、5-氨基乙酰丙酸和醌类化合物等多种光疗药物的抗肿瘤活性得到深入研究。其中，醌类化合物中的竹红菌素类光疗药物由于其极高的活性氧产生能力而受到广泛关注。

竹红菌素（hypocrellins）是我国首先从竹红菌及竹黄等中药材中提取的天然光疗药物，主要有竹红菌甲素(hypocrellin A，简称HA) 和竹红菌乙素(hypocrellin B，简称HB) 两种组分。与其它光疗药物相比，竹红菌素类化合物具有活性氧量子产率高、光毒性高、暗毒性低、从正常组织排出速度快及对多种肿瘤细胞均具有很高的光敏损伤活性等诸多优点，是一类很有应用前景的光疗抗肿瘤药物。然而，理想的光疗抗肿瘤药物除具有上述性质外，还应具有治疗光源可有效穿透生理组织的条件。但竹红菌素的激发波长位于470nm左右的可见光区，该波长范围的光源组织穿透深度小于1 mm，远远无法满足治疗体内实体肿瘤的要求。因此，目前竹红菌素在临床上只能用于治疗以视网膜黄斑变性和鲜红斑痣为代表的微血管类疾病及皮肤病等浅表病变，且动物实验也表明，竹红菌素治疗体内实体肿瘤效果并不理想。因此，针对竹红菌素存在的缺陷，设计并构建一个可实现长波敏化竹红菌素的体系，是推动其光动力治疗体内实体肿瘤临床应用进程的关键。

自2007年以来，具有吸收近红外光、发出可见光性质的上转换纳米晶体在光动力疗法领域的应用研究悄然兴起。NaYF₄、YF₃及LaF₃等纳米晶体掺杂Yb³⁺及Er³⁺、Tm³⁺或Ho³⁺等稀土离子后，使用980 nm左右的近红外光源激发该类晶体，可有效发出407 nm～660 nm的可见光。研究者利用上转换纳米晶体发出的可见光敏化特定光疗抗癌药产生活性氧，发挥抗肿瘤活性。

因光线在组织中的穿透深度与其波长密切相关，与传统可见光光源相比，近红外光光源有着更深的组织穿透能力，更加符合光动力疗法治疗体内实体肿瘤的要求。尤其是饰NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体，其激发波长为980nm，最大上转换发射波长为470 nm，恰好位于竹红菌素的最佳激发波长位置。利用这一性质，开发上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物，可以克服竹红菌素激发光源组织穿透能力弱，无法实现体内实体肿瘤治疗的困难。

发明内容

本发明的目的在于克服竹红菌素激发波长短，治疗光源组织穿透深度浅的缺点，开发一种在上转换纳米晶体表面负载竹红菌素的复合体形式，利用上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体980nm长波激发后，上转换发射波长为470 nm，间接激发竹红菌素以产生活性氧，最终杀灭肿瘤细胞的载药体系，并将该成果应用于光动力疗法领域。即，本发明将提供一种上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物的制备方法及制得的复合物在光敏治疗中的应用，该复合物达到使竹红菌素长波敏化的目的，推动其在治疗体内实体肿瘤中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物的制备方法，其特征在于，采用水热法合成NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体，酸性条件下去除所述纳米晶体的表面修饰物，得到在水相中稳定分散的所述纳米晶体水溶液，加入竹红菌素溶液，孵育，将竹红菌素固定于所述纳米晶体表面，透析除掉未吸附的竹红菌素及溶剂，得到纯净的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物。

所述的NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体，其激发波长为980nm，上转换荧光波长位于470nm。其合成方法可参照文献公开的方法（Angewandte chemie. 2011, 123(32):7523-7528）。本发明中所涉及的竹红菌素包括竹红菌甲素、竹红菌乙素以及它们的衍生物中的一种或几种，优选竹红菌甲素、竹红菌乙素或它们任意的混合物。

上述方法中，所述NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体与竹红菌素的质量比为1:10～10:1。

所述的方法在上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体表面常温稳定吸附竹红菌素，利用竹红菌素酚羟基及醌羰基易于金属配位的特性，将竹红菌素固定于所述纳米晶体表面，具体步骤如下：

（1）取50mL三颈烧瓶，加入1mmol Ln(CF₃COO)₃ (其中Ln 为Y、Yb和Tm，以摩尔百分比计，Y:Yb:Tm=78%:20%:2%)，10mmol氟化钠(NaF)和20ml有机溶剂(3ml油酸/17ml十八烯)，加热至160℃，在无水无氧氛围中持续加热1h；再在磁力搅拌的同时升温至320℃并保持1h，反应结束后自然冷却到室温；在得到的产物中加入无水乙醇，离心分离后得到沉淀，并反复用水和乙醇各洗涤三次；

（2）再将步骤（1）所得产物用盐酸洗涤（pH=4.0），水/乙醚混合溶剂萃取，得到表面没有油酸修饰的纯净纳米晶体，形成在水相中稳定分散的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体水溶液；

（3）随后，在步骤（1）所得产物中加入200 uL 竹红菌素溶液（15mM竹红菌素，DMSO助溶），室温磁力搅拌24h，使用二次蒸馏水透析除掉未吸附的竹红菌素及DMSO。

根据上述方法制备的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物，是一种适合静脉注射有机-无机复合纳米粒子。

完成本发明第二项发明任务的方案是：所述方法制得的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物在制备光敏治疗药物中的应用。

同样，所述复合物在光敏治疗领域中的应用所涉及的竹红菌素包括竹红菌甲素、竹红菌乙素及它们的衍生物中的一种或几种。

本发明方法及制得的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物具有如下的优点：

1．药物吸附过程在常温下进行，避免高温对药物活性影响。

2．药物吸附过程与纳米上转换晶体合成分开进行，避免药物的存在对上转换纳米晶体结晶过程的影响，保证了其有效的上转换发光效率。

3. 该纳米复合体系水相分散性好。

4. 该纳米复合体系可实现长波敏化竹红菌素，离体癌细胞实验结果表明，该类复合体系暗毒性低，光毒性高，激发波长长。

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。本发明的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。

附图说明

图 1 实施例1制备的NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌甲素复合物透射电镜图（1A）及上转换荧光照片(1B)。

图 2 实施例1制备的NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌甲素复合物长波（980nm）激发产生单线态氧效果图。

图 3 实施例1制备的NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌甲素复合物长波（980nm）激发杀灭体外肿瘤细胞效果对比（3A）：光照前细胞形态；（3B）：980nm激光器光照后细胞形态。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。

在本发明的实施例中，所用的光敏剂为竹红菌甲素（hypocrellin, HA）。HA为一种天然的光敏剂，已被用于临床治疗皮肤病、眼病及妇科疾病等，研究表明HA还具有一定的抗肿瘤和抗病毒活性。以下实施例中的描述是为了阐明本发明，本发明的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物同样适用于竹红菌乙素，或竹红菌甲素、竹红菌乙素的衍生物。

实施例1

取50mL三颈烧瓶，加入1mmol的Ln(CF₃COO)₃ (Y:Yb:Tm=78%:20%:2%)，10mmol氟化钠(NaF)和20ml有机溶剂(3ml油酸/17ml十八烯)，加热至160℃，在无水无氧氛围中持续加热1h。再在磁力搅拌的同时升温至320℃并保持1h，反应结束后自然冷却到室温。在得到的产物中加入无水乙醇，离心分离后得到沉淀，并反复用水和乙醇各洗涤三次，再将产物在盐酸（pH=4.0）中洗涤，水/乙醚混合溶剂萃取，得到表面没有油酸修饰的、纯净的，可在水相稳定分散的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体。随后，在体系中加入200 uL HA溶液（15mM，DMSO助溶），室温磁力搅拌24h，使用二次蒸馏水透析除掉未吸附的HA及DMSO等，即可得到上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌甲素复合物。

本实施例中制备的纳米复合体系的形貌以透射电子显微镜观测。纳米复合体系产生的单线态氧用9，10-二苯基蒽丙酸钠盐捕捉。使用细胞形态变化检测其长波敏化的光敏抗肿瘤活性。

上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌甲素复合物表征结果如下：

（1）上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌甲素复合物体系的形貌及上转换荧光观察

透射电镜观察纳米粒大小及形貌，如图1所示，透射电镜照片显示上转换NaYF₄:Yb^{3 +},Tm³⁺纳米晶体-竹红菌甲素复合物体系粒径分布均匀且单分散性良好。使用980nm激光器暗室观察，肉眼即可看到明亮的蓝色上转换荧光。

（2）单线态氧产生能力比较

使用9，10-二苯基蒽丙酸钠盐捕捉单线态氧，结果表明上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌甲素复合物体系可被980nm长波间接敏化，有效产生单线态氧。

（3）光敏杀伤肿瘤细胞能力比较

光敏损伤肿瘤细胞试验表明，上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌甲素复合物体系在长波（980nm）激发下，可以有效杀伤肺癌细胞（A549）。细胞发生明显的皱缩，失去原有活力。

实施例2，与实施例1基本相同，但所述的竹红菌甲素改用竹红菌乙素。制得的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物按照与实施例1相同的方法表征，结果基本相似。

实施例3，与实施例1基本相同，所述的纳米晶体和竹红菌素的质量比为1：0.1～1：10。

Claims (6)

1.一种上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物的制备方法，其特征在于，采用水热法合成NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体，酸性条件去除所述纳米晶体的表面修饰物，得到在水相中稳定分散的所述纳米晶体水溶液，加入竹红菌素溶液，孵育，将竹红菌素固定于所述纳米晶体表面，透析除掉未吸附的竹红菌素及溶剂，得到纯净的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物；

所述的方法包括以下步骤：

（1）三颈烧瓶中，加入1mmol Ln(CF₃COO)₃，其中Ln 为Y、Yb和Tm，以摩尔百分比计，Y:Yb:Tm=78%:20%:2%，10mmol氟化钠和20ml有机溶剂，有机溶剂为3ml油酸和17ml十八烯组成的混合溶剂；加热至160℃，在无水无氧氛围中持续加热1h；再在磁力搅拌的同时升温至320℃并保持1h，反应结束后自然冷却到室温；在得到的产物中加入无水乙醇，离心分离后得到沉淀，并反复用水和乙醇各洗涤三次；

（2）再将步骤（1）所得产物用盐酸洗涤，水/乙醚混合溶剂萃取，得到表面没有油酸修饰的纯净纳米晶体，形成在水相中稳定分散的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体水溶液；

（3）随后，在步骤（1）所得产物中加入200 uL 竹红菌素DMSO溶液，含15mM竹红菌素，室温磁力搅拌24h，使用二次蒸馏水透析除掉未吸附的竹红菌素及DMSO，制得所述的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物。

2.根据权利要求1所述的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物的制备方法，其特征在于，所述的竹红菌素为竹红菌甲素、竹红菌乙素或它们任意的混合物。

3.根据权利要求1所述的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物的制备方法，其特征在于，所述的NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体，激发波长为980nm，上转换荧光波长为470nm。

4.根据权利要求1所述的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物的制备方法，其特征在于，所述方法中，NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体与竹红菌素的质量比为1:10～10:1。

5.一种权利要求1所述的方法制备得到的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物在制备光敏治疗药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的上转换NaYF₄:Yb³⁺,Tm³⁺纳米晶体-竹红菌素复合物在制备光敏治疗药物中的应用，其特征在于，所述的竹红菌素为竹红菌甲素、竹红菌乙素或它们任意的混合物。