CN104826110A

CN104826110A - 新一代多功能抗体纳米团簇的制备及其协同治疗应用

Info

Publication number: CN104826110A
Application number: CN201510257167.0A
Authority: CN
Inventors: 李威; 孙赟; 赵赫; 陈迪; 张歌; 张莉; 祝仙弟
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2015-05-19
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2035-05-19
Also published as: CN104826110B

Abstract

本发明涉及新一代多功能抗体纳米团簇的制备及其协同治疗应用，所述的抗体纳米团簇由两种或两种以上的同一类型或不同类型的抗体通过铰链偶联到同一大分子链或球面上，链接抗体和大分子链的铰链剂分子包括可氧化还原降解，可水解，可酸解等可断裂的化学键，及不可断裂的化学键。其优点表现在：首次将两种或不同种抗体在体外进行交联并成功应用体内，解决了具有协同治疗功能的抗体交联在体内无法应用的科学难题。所述CD20抗体纳米团簇在体外实验中成功激活了目前已知的所有CD20抗体抗肿瘤作用的四条通路。所述的抗体纳米团簇具有更强的抗肿瘤作用、更长的半衰期、更强的杀伤作用。

Description

新一代多功能抗体纳米团簇的制备及其协同治疗应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体地说，是新一代多功能抗体纳米团簇的制备及其协同治疗应用。

背景技术

分子靶向治疗是指针对参与了肿瘤发生发展过程的细胞信号转导和其他生物学途径的治疗手段。广义的分子靶向治疗的靶点包括了参与细胞分化、凋亡、迁移、侵袭性行为、淋巴转移、全身转移等多过程的从DNA到蛋白水平的任何亚分子。本世纪以来，分子靶向治疗已成为肿瘤学研究的热点和主要方向，推动着肿瘤治疗理念和理论的发展。利妥昔单抗(Rituximab,C2B8，商品名美罗华)是第一个被FDA批准的以人CD20分子为靶点治疗非霍奇金淋巴瘤的单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)。现Rituximab+经典的CHOP化疗方案(环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+泼尼松)已经成为CD20+非霍奇金淋巴瘤治疗的一线方案，在西方，几乎所有的CD20+非霍奇金淋巴瘤患者在其病程中都会接受利妥昔单抗的治疗。随后，抗体的靶向治疗已成为目前抗肿瘤生物治疗的主要手段。目前已有十几种抗体被FDA批准用于临床治疗。

然而并非所有的患者对抗体的分子靶向治疗都敏感。因此如何解决抗体的杀伤效果及其临床上表现出来的耐药问题成为广大科研和临床工作者函待解决的主要问题。传统癌症抗体治疗方法虽然已取得了一些可观的成效，但是彻底治愈和消除癌症仍然是当前社会医疗和人口健康的重大挑战之一。例如，近年来，虽然NHL对传统的放化疗较敏感，约48％的病人对Rituximab单抗治疗产生不良反应，其余的患者尽管初次治疗效果很好，但经过一段时间的治疗会出现继发性耐药，甚至复发。研究表明CD20抗体主要通过补体依赖的细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity；CDC)、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、诱导肿瘤细胞细胞凋亡三种机制杀伤肿瘤细胞。根据CD20抗体与靶细胞的CD20结合后的转脂筏能力将其分为两型，I型抗体主要作用机制包括CDC、ADCC，而诱导肿瘤细胞凋亡的能力很弱。II型抗体主要作用机制包括ADCC、诱导肿瘤细胞凋亡，而CDC作用很弱。此外，I型CD20抗体在体外与靶细胞的CD20结合后，再经过二抗的交联，可以诱导靶细胞产生较强的凋亡。研究表明，II型CD20抗体诱导淋巴瘤细胞凋亡并不依赖于传统的Caspase通路，而是依赖一条与溶酶体相关的特殊途径，而I型抗体交联后诱导淋巴瘤细胞的凋亡依赖于传统的Caspase通路。然而，将CD20抗体进行交联而诱导肿瘤细胞凋亡在体内情况下无法实现。

基于纳米技术的抗肿瘤治疗给癌症患者带来新的希望，与传统的抗体药治疗相比，纳米医药载体有以下几个优势：体内较稳定，对正常组织毒副作用低，可以实现药物可控释放，提高生物利用度。然而，基于传统纳米载药体系发展仍然不完善，受到体内外很大因素限制，导致目前纳米药物治疗的瓶颈问题：1，纳米载体体内稳定性差、循环时间短；2，由于靶向性和稳定性差，导致肿瘤内富集不足；3，肿瘤细胞靶向性及结合作用不强导致胞吞少；4，胞内特定部位药物释放不可控的问题。

纳米医学是将现代物理学、现代化学和先进工程技术与医学相结合的一门边缘学科，其由于毒副作用低、治疗效果好，在恶性肿瘤的预防及治疗中发挥着越来越重要的作用。本发明把纳米技术与靶向治疗抗体相结合，制备出新型的抗体纳米团簇，拟为淋巴瘤的治疗提供新的方法和思路。

本发明设计的新型抗体纳米团簇，国内外尚未见类似的研究报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供新一代多功能抗体纳米团簇。

本发明的再一的目的是，提供新一代多功能抗体纳米团簇的制备方法。

本发明的另一的目的是，提供新一代多功能抗体纳米团簇的协同治疗功能。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：抗体纳米团簇，所述的抗体纳米团簇由两种或两种以上的同一类型或不同类型的抗体通过铰链偶联到同一大分子链或球面上，链接抗体和大分子链的铰链剂分子包括可氧化还原降解，可水解，可酸解等可断裂的化学键，及不可断裂的化学键。

所述的抗体纳米团簇的形态为链状、球状或棒状，所述的抗体纳米团簇的尺寸范围为0.05-20μm，所述的分子链或球面的分子量为5000-100000g/mol。

所述的抗体纳米团簇还包括修饰其表面的PEG分子、温敏高分子或pH值敏感等功能高分子，所述的PEG分子的分子量为500-10000g/mol。

所述举例的抗体为抗CD20抗体。

所述的抗体为I型抗CD20抗体与II型抗CD20抗体。

所述的I型抗CD20抗体是Rituximab，所述的II型抗CD20抗体是11B8。

所述的抗体纳米团簇以短链聚乙烯亚胺为载体，将I型抗CD20抗体Rituximab与II型抗CD20抗体11B8在体外进行交联制得。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的抗体纳米团簇的制备方法包括以下步骤：

1)PEI溶液与MPEGS溶液反应制得MPEGS-PEI溶液，

2)分别将Rituximab抗体和11B8抗体巯基化，

3)巯基化的Rituximab抗体与巯基化的11B8抗体混合，再与MPEGS-PEI溶液反应制得抗体纳米团簇。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的抗体纳米团簇在制备治疗肿瘤(实体瘤及血液瘤)药物中的应用。

所述的肿瘤为淋巴瘤。

本发明制备的抗CD20抗体纳米团簇具有如下特点：

(1)、所述抗体纳米团簇首次将两种不同抗体在体外进行交联并成功应用体内，解决了CD20抗体交联在体内无法应用的科学难题。

(2)、所述抗体纳米团簇在体外实验中成功激活了目前已知的所有CD20抗体抗肿瘤作用的四条通路，包括CDC,ADCC,溶酶体介导的细胞凋亡以及caspases依赖的细胞凋亡通路，在体内和体外实验中表现出较强的肿瘤杀伤效果。

(3)、所述抗体纳米团簇能够结合不同肿瘤细胞表面的CD20抗原，引起淋巴瘤细胞的同源聚集，增强其抗肿瘤作用。

(4)、所述抗体纳米团簇与其来源抗体Rituximab、11B8相比具有更长的半衰期。

(5)、所述抗体纳米团簇对临床上对Rituximab耐药的淋巴瘤细胞仍然具有较强的杀伤作用。

(6)、所述抗体纳米团簇能通过纳米药物增强的渗透与滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR)以及抗原抗体的识别和结合效应，增强其在肿瘤内部的富集能力。

附图说明

附图1为抗CD20抗体纳米团簇构建示意图。

附图2为抗CD20抗体纳米列针鉴定与表征分析。

2A：SDS-PAGE鉴定抗CD20抗体纳米团簇的成功构建。1-2：PEI,3-4：PS-RB,5：Rituximab，6：11B8。

2B：抗CD20抗体纳米团簇粒径大小测定。

附图3为抗CD20抗体纳米团簇形态与CD20阳性的耐药Raji细胞结合与解离能力检测。

附图4为抗CD20抗体纳米团簇体外肿瘤杀伤效应检测。

4A：抗CD20抗体纳米团簇诱导耐药Raji细胞CDC能力检测，

4B：抗CD20抗体纳米团簇诱导耐药Raji细胞ADCC能力检测，

4C：抗CD20抗体纳米团簇诱导耐药Raji细胞凋亡能力检测。

附图5为抗CD20抗体纳米团簇诱导肿瘤细胞凋亡通路检测。

5A：抗CD20抗体纳米团簇诱导耐药Raji细胞溶酶体变化检测，

5B：抗CD20抗体纳米团簇激活耐药Raji细胞caspases能力检测，

5C：抗CD20抗体纳米团簇诱导耐药Raji细胞同源粘附能力检测。

附图6为抗CD20抗体纳米团簇体内肿瘤杀伤效应检测。

6A-B：抗CD20抗体纳米团簇治疗对荷瘤小鼠生存率影响，

6C-D：抗CD20抗体纳米团簇治疗对荷瘤小鼠皮下肿瘤抑制效果检测。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

下述具体实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述具体实施例中的比例，如无特殊说明，均为质量比。

实施例1：抗CD20抗体纳米团簇制备方法

(1)分别准备4mg/ml的PEI(聚乙烯亚胺，分子量25kDa)和MPEGS(MAL-PEG-SCM，马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯)溶液，将PEI和MPEGS以质量比1:20的比例混合，室温下充分反应4小时后，以3500MCW的透析膜透析4-6小时，除去未反应的游离MPEGS。

(2)巯基化抗体：取1mg Rituximab和11B8抗体母液，分别稀释为2mg/ml。按照2-IT/mAbs＝0.15:1，分别向抗体溶液中加入5mg/ml 2-IT(2-iminothiolane)，室温充分反应2-2.5h后用含5mM的EDTA的PBS溶液透析6-8H，除去未反应的游离2-IT(透析膜1000MCW)。

(3)将相同量经过巯基化的Rotuximab与11B8混合，向其中加入(1)制备的MPEGS-PEI溶液(mAb/PEI＝1000:3.44)在通入氮气的环境下,4℃反应过夜。然后用MCW300000的透析膜透析8h,除去未结合在载体上的游离抗体。

实施例2：抗CD20抗体纳米团簇的SDS-PAGE鉴定

将制备好的抗CD20抗体纳米团簇用8％的分离胶进行SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮蓝染色，鉴定抗CD20抗体纳米团簇的分子量。

实施例3：抗CD20抗体纳米团簇的粒径测定及形态观察

将制备好的抗CD20抗体纳米团簇用除菌PBS稀释后，用动态管散射仪(ALV/CGS-3,Germany)检测其粒径大小。

用稀释好的样品置于透射电镜专用铜网，风干后以2％PTA(磷钨酸)溶液进行负染后，用透射电镜观察其形态。

稀释好的样品也可以用常规方法置于原子力显微镜下进行形态观察。

实施例4：抗CD20抗体纳米团簇与淋巴瘤细胞结合与解离能力检测

收集正常培养的耐药Raji细胞，与10μg/ml的抗CD20抗体或抗体纳米团簇孵育1小时后，用PBS洗涤后，将结合抗体的耐药Raji细胞置于培养基中正常培养，并于不同时间点取样，以Alexa Fluor488标记的样抗人H+L二抗进行标记后，流式细胞术检测细胞表面平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)，以测定残留在细胞表面抗体的数量，根据以下公式计算抗CD20抗体纳米团簇与淋巴瘤细胞结合与解离能力。

实施例5：抗CD20抗体纳米团簇体外肿瘤杀伤效应

(1)体外CDC和ADCC功能检测：收集Raji细胞后用RPMI 1640培养液洗两遍，重悬于RPMI 1640培养液，调整细胞密度至2×10⁵/ml，按50ul/孔将细胞悬液加入96孔全白细胞培养板。用RPMI1640培养液将Rituximab、11B8和PS-RB分别稀释后加入细胞培养板中，使抗体终浓度分别为4μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml，1％Triton X-100作为阳性对照，PBS作为阴性对照，空白培养液作为空白对照。然后将5μl/孔细胞悬液的比例加入新鲜人血清作为补体来源(CDC检测)，或者按照效应细胞：靶细胞比例＝25:1加入人外周血单核细胞(ADCC检测)，补充无酚红RPMI1640培养液至总体积100μl/孔。以上每组各设3个复孔，37℃，5％CO2培养4小时后，按照CytoTox-Glo^TMCytotoxicity Assay kit(Promega)试剂盒说明书检测细胞活力，计算抗体纳米团簇诱导淋巴瘤细胞的CDC和ADCC能力。

(2)诱导肿瘤细胞凋亡能力检测：取生长对数期耐药Raji细胞，用含10％热灭火FBS的RPMI 1640培养基重悬至密度为5×10⁶/ml，取0.2ml细胞悬液每孔铺48孔板，每孔细胞数为1×10⁵。向其中加入CD20单克隆抗体或者抗体纳米团簇，使抗体终浓度均为10μg/ml，37℃，5％CO2条件孵育16小时后，按照凋亡试剂盒说明书提供方法，Annexin V-488、PI双染后流式细胞术检测细胞率。实验结果中，Annexin V+/PI-细胞为早期凋亡细胞，Annexin V+/PI+细胞为晚期凋亡细胞，两者之和统计为凋亡细胞数，与总计数细胞数目的比例统计为细胞凋亡率。

实施例6：抗CD20抗体纳米团簇诱导肿瘤细胞凋亡通路检测

流式细胞术检测CD20抗体纳米团簇导致淋巴瘤细胞溶酶体破裂实验：取生长对数期耐药Raji细胞，用含10％热灭活的FBS的RPMI 1640培养基重悬至密度为2.5×10⁶/ml，取0.3ml细胞悬液每孔铺48孔板，每孔细胞数为1×10⁵。向其中加入抗CD20抗体纳米团簇，使抗体终浓度均为10μg/ml，37℃，5％CO2条件孵育16小时后，收集细胞于流式细胞术专用管，用预冷的含1％FBS的PBS洗涤一次后，用200nM的Red重悬，重悬体积为0.3ml，37℃避光水浴10分钟后，激光共聚焦显微镜观察细胞溶酶体变化。

按照实施例5-(2)的方法处理细胞后，按照Invitrogen公司Caspases激活检测试剂盒提供的方法检测细胞内caspases激活情况。

实施例7：抗CD20抗体纳米团簇诱导淋巴瘤细胞同型粘附能力检测

搜集生长对数期的耐药Raji细胞，将其与2.5μg/ml的抗CD20抗体或抗体纳米团簇进行孵育，8小时后，用光学显微镜观察细胞形态。

实施例8：抗CD20抗体纳米团簇药代动力学检测

常规SCID小鼠饲养至6-8周龄，分别于第0,1,2天经尾静脉注射20mg/kg的Rituximab,11B8和PS-RB，在末次注射后，于不同时间点分别经内眦静脉取40-60μl的静脉血，用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunoassays,ELISA)检测其中抗体浓度，根据浓度-时间曲线，计算药代动力学参数。

实施例9：抗CD20抗体纳米体内肿瘤杀伤能力检测

(1)静脉肿瘤模型：将6-8周龄的SCID小鼠随机分为4组，尾静脉注射1×10⁷耐药Raji细胞，3天后分别接受PBS,Rituximab，Rituximab+11B8以及PS-RB的治疗(尾静脉注射，15mg/kg，隔日一次×5次)。后每日观察小鼠状态，测量小鼠体重，并记录小鼠生存时间绘制生存曲线，评价抗体和抗体纳米团簇的体内肿瘤杀伤效果。

(2)皮下肿瘤模型：按照实施例8的方法构建皮下荷瘤小鼠模型，将荷瘤小鼠随机分为4组，分别PBS,Rituximab，Rituximab+11B8以及PS-RB的治疗(尾静脉注射，15mg/kg，每周一次×3次)。期间每日测量小鼠肿瘤大小，2个月后处死小鼠，根据每日测量肿瘤体积绘制小鼠肿瘤生长曲线图，评价抗体和抗体纳米团簇的体内肿瘤杀伤效果。

表1为抗CD20抗体纳米团簇体内药代动力学检测参数。

表1：药代动力学参数

t_1/2：半衰期

CL：清除率

MRT：平均滞留时间

Vd：表观分布容积

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.抗体纳米团簇，其特征在于，所述的抗体纳米团簇由两种或两种以上的同一类型或不同类型的抗体通过铰链偶联到同一大分子链或球面上，链接抗体和大分子的铰链剂分子包括可断裂的化学键或不可断裂的化学键。

2.根据权利要求1所述的抗体纳米团簇，其特征在于，所述的抗体纳米团簇的形态为链状、球状或棒状，所述的抗体纳米团簇的尺寸范围为0.05-20μm，所述的分子链或球面的分子量为5000-100000g/mol。

3.根据权利要求1所述的抗体纳米团簇，其特征在于，所述的抗体纳米团簇表面修饰有功能高分子，所述的功能高分子包括PEG分子、温敏高分子或pH值敏感高分子，所述的PEG分子的分子量为500-10000g/mol。

4.根据权利要求1所述的抗体纳米团簇，其特征在于，所述的抗体为抗CD20抗体。

5.根据权利要求4所述的抗体纳米团簇，其特征在于，所述的抗体为I型抗CD20抗体与II型抗CD20抗体。

6.根据权利要求5所述的抗体纳米团簇，其特征在于，所述的I型抗CD20抗体是Rituximab，所述的II型抗CD20抗体是11B8。

7.根据权利要求5所述的抗体纳米团簇，其特征在于，所述的抗体纳米团簇以短链聚乙烯亚胺为载体，将I型抗CD20抗体Rituximab与II型抗CD20抗体11B8在体外进行交联制得。

8.根据权利要求1所述的抗体纳米团簇的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：

1)PEI溶液与MPEGS溶液反应制得MPEGS-PEI溶液，

2)分别将Rituximab抗体和11B8抗体巯基化，

9.根据权利要求1-7任一所述的抗体纳米团簇在制备治疗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为淋巴瘤。