CN104491868A - 新型基于抗体偶联化疗药物纳米adc及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于抗体偶联新技术的抗体化疗药物如阿霉素和美登素(DOX，DM1)的纳米粒子及其制备方法和应用。实验结果表明抗体偶联化药偶联物通过自组装成的纳米粒子与单独的抗体和单独的药物相比，其靶向性显着增强，对机体的药物毒副作用显着降低；形成的纳米粒子复合利用肿瘤组织的增强渗透保持滞留效应(EPR)增强瘤内富集，增强药物的生物利用率的同时降低药物的使用剂量，为肿瘤的靶向治疗提供一种高效低毒的纳米治疗方式。

Description

新型基于抗体偶联化疗药物纳米ADC及制备方法和应用

【技术领域】

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种新型基于抗体偶联化疗药物纳米ADC及制备方法和应用。

【背景技术】

肿瘤是当今严重威胁人类健康的三大疾病之一。我国的肿瘤发病率已达千分之二，死亡率为千分之一点五，其中，肺癌的死亡率最高，肝癌位居第二，胃癌第三。恶性胃癌治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上多采用的常规治疗方法如放疗、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间；但是化疗或放疗不能改变患者的生存期，即便是对首次化疗敏感的癌症患者来说，也很容易复发或产生耐药。而且复发后再次进行化疗或放疗时，疗效则明显降低。因此，对多数复发无法避免、治愈率极低的患者而言，低毒性、更有效的靶向治疗就显得非常必要。近年来，针对细胞表面分子的抗体靶向性治疗已取得了巨大进展。在抗肿瘤治疗过程中，由于抗体靶向治疗具有特异性高、副作用小、半衰期长等特点，已经成为一种非常有发展前途的肿瘤生物治疗的方法。但是单克隆抗体存在对肿瘤杀伤效果低，分子量大，免疫原性强，体内滞留时间长不易穿透组织，血管通透性差等缺点，使得单克隆抗体在临床实际应用存在一定的局限性。而抗体-药物偶联物(antibody-drugconjugates，ADC)的出现在一定程度上既克服了抗体杀伤不足的同时，也明显降低了化疗药物对正常组织的毒副作用。

抗体-药物偶联物是新一代抗体靶向治疗药物，主要用于癌症和肿瘤的治疗。从结构上，ADC药物由“弹头”药物(细胞毒药物)、抗体以及偶联抗体和药物的偶联链3部分组成，通过化学偶联的方法将细胞毒性药物连接到抗体蛋白上。得益于稳定结合子型的ADCs能够确切的将药物携带至细胞内，而在外周血和细胞表面很少降解；在同等给药剂量下，使用稳定型ADCs更像缓释剂一样能够长时间在体保持有效的杀伤浓度而不释放出多余的毒素，从而使得ADCs在抗肿瘤中具有更高效的杀伤效应和更小的不良反应。如人源化IgGl抗CD19单抗huB4通过一种含有二硫键的桥梁分子Ⅳ一琥珀酰亚氨基.4-(2-吡啶二硫代)丁酸(SPDB)与具有强效细胞毒作用的类美登醇(maytansinoid)衍生物DM4相，得到的抗体-药物偶联物SAR3419在血浆及水溶液中性质稳定，在细胞内可发生断裂释放DM4。SAR3419经给药进入机体后，huB4单抗可特异结合至表达CDl9的肿瘤细胞，连接于单抗分子的DM4由此释放出来并杀死肿瘤细胞。临床前药理研究显示：SAR3419活性强于huB4单抗和游离的DM4。

尽管抗体-药物偶联物相对于单一的抗体和化疗药物在杀伤效果和降低化疗药物毒性上具有一定的优势，但是由于不同细胞表面表达不同丰度的抗原，就会使得单一的抗体-药物偶联在抗原表达相对不足的细胞治疗效果上不尽如人意；且研究表明，偶联到ADC上的效应分子的数目影响ADC的聚合、抗原的结合活性、血液循环中的清除率、活性及耐受性，偶联的效应分子数目过少，降低了ADC的活性；相反，过多则降低ADC药物在血液中的半衰期及耐受性、同时影响抗体与抗原的有效结合；此外单个的抗体-药物偶联物在肿瘤内富集低，化学偶联的药物在血液循环中不够稳定，释放出来的细胞毒分子对细胞产生的毒副作用也使得抗体-药物偶联物达不到临床预期目标。

本发明的基于抗体偶联化疗药物纳米ADC旨在利用抗体的亲水性和化疗药物阿霉素的疏水性，在液相环境中自组装成内部是疏水性化疗药物内核，外部是亲水性抗体的外壳，形成免疫-化疗纳米体系；该纳米免疫-化疗体系不仅保留了单个抗体的靶向性和单独化疗药物对肿瘤的强杀伤性，免疫-化疗纳米体系以多价形式靶向肿瘤细胞，还显著增强了其抗原抗体亲和力，使大量的阿霉素有效富集到肿瘤部位，减少药物的使用剂量，从而降低药物对正常组织的杀伤，降低药物的毒副作用，而目前关于这类药物还未见报道。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供由抗体与药物偶联技术及其偶联物所自组装成的纳米粒子。

本发明的再一的目的是，提供所述纳米粒子的制备方法。

本发明的另一的目的是，提供所述纳米粒子的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

抗体与药物偶联技术及其偶联物所自组装成的纳米粒子，所述纳米粒子是由巯基化的抗体与带有双硫键的化疗药物在液相环境中自组装形成的，具有下的结构：

(Drug)_n—mAb

其中mAb代表单克隆抗体，drug代表化疗药物，n为偶联上的药物数目，n值为1-80；所述纳米粒子为胶束状核壳结构，疏水性的化疗药物包裹在胶束内核中，亲水性抗体形成胶束状外壳；所述胶束粒径大小为20-1000nm；所述每个纳米粒子中化疗药物的分子数目为1-10000。

所述化疗药物为阿霉素或美登素。

所述单克隆抗体为Her2、CD20、CD40、CD34、CD28、CD13或CD22；优选为Her2或CD20。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

所述的纳米粒子的制备方法包括下述步骤，

第一步：化疗药物与带有双硫键的交联剂，溶于甲醇后，室温下避光搅拌反应6天，得到带有双硫键的化疗药物；所述的交联剂为肼基-4-(2-吡啶二硫代)丁酸(PDPH)、SMCC、SPDP、VCP；优选为PDPH；

第二步：用2-IT(2-亚氨基硫烷盐酸盐)与抗体在pH＝7.4的PBS下反应，将抗体进行巯基化；

第三步：将巯基化的抗体用PBS稀释，加入双硫键的化疗药物的甲醇溶液，通N₂，密封，室温摇床下反应4h，置于4℃冰箱24h，离心纯化；

第四步：取5ml离心纯化的产物加入到50ml的旋蒸瓶中，通入氮气，旋转蒸发制备抗体包裹化疗药物的纳米粒子，所述旋转蒸发的优选条件为：转速60rpm，温度25℃，旋转蒸发时间为3.5h，氮气流速为10mL/min。

所述的化疗药物为阿霉素或美登素；所述的抗体为Her2、CD20、CD40、CD34、CD28、CD13或CD22，优选为Her2或CD20。

所述第一步化疗药物与带有双硫键的交联剂质量比为27.25:11.78，搅拌速度为100rpm、500rpm、1000rpm、5000rpm；优选为100rpm。

所述第二步抗体与2-IT的质量比为1000：75；所述巯基化后每个抗体结合7-8个巯基。

所述第三步巯基化的抗体与带有双硫键的化疗药物的质量比为1:1；所述离心纯化条件优选为：离心温度20℃，离心速度1500rpm，离心时间10min。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

所述纳米粒子在制备治疗胃癌药物中的应用。

所述纳米粒子在制备抑制胃癌细胞N87生长的药物中的应用。

本发明以化疗药物、抗体作为基本材料制备出一种既具有抗体主动靶向又可以将具有毒性的疏水性药物包裹进纳米粒子内核中的免疫-药物纳米体系。本发明的主要技术方案是：首先将阿霉素与带有双硫键的肼基-4-(2-吡啶二硫代)丁酸(PDPH)反应生成带有双硫键的阿霉素化合物；接着用2-IT(2-亚氨基硫烷盐酸盐)与抗体在pH＝7.4的PBS下反应，将抗体进行巯基化，得到抗体上带有一定数目的巯基；带有巯基的抗体与带有双硫键的阿霉素化合物进行反应，通过抗体上的巯基与阿霉素双硫键进行还原反应，一定数目疏水性阿霉素连接到抗体上；最后，通过旋蒸法制备得到内核包裹阿霉素，外壳连有亲水性抗体的纳米免疫体系。

本发明制备的抗体-药物免疫纳米体系具有如下特点：

(1)改载体以抗体和阿霉素为基本材料形成胶束状核壳结构，疏水性的阿霉素被包裹进胶束内核中，而亲水性抗体形成胶束的外壳，胶束粒径大小在(nm)；这种带有双硫键的抗体-药物免疫纳米胶束利用肿瘤组织的EPR效应实现药物在肿瘤内的富集。

(2)借助胶束表面大量数目的抗体能更好的被肿瘤细胞表面的抗原所识别，增强抗原抗体之间的亲和力更有利于被肿瘤细胞所内吞；带有双硫键的偶联链部分在胞内较高水平还原型谷胱甘肽的还原作用下，释放出细胞毒药物，从而达到专一性杀灭癌细胞而不损伤正常组织细胞的作用。所述的纳米载药体系与游离药物和单一抗体相比具有更长的半衰期，更好的靶向作用以及瘤内显著的富集效应，从而显著提高药物的生物利用率。

本发明优点在于：

1、本发明的抗体偶联化疗药物纳米ADC胶束状核壳结构，纳米级的胶束粒径更有利于药物在肿瘤内的富集。

2、本发明的抗体偶联化疗药物纳米ADC具有高效低毒的特点，能够专一性杀灭癌细胞而不损伤正常组织细胞。

3、本发明的抗体偶联化疗药物纳米ADC与游离药物和单一抗体相比具有更长的半衰期，更好的靶向作用以及瘤内显著的富集效应，从而显著提高药物的生物利用率。

【附图说明】

附图1是带有双硫键阿霉素(DOX-PDPH)合成示意图。

附图2是抗体巯基化标准曲线图。

附图3是纳米偶联化疗药物纳米ADC合成示意图。

附图4是抗体-药物纳米免疫体系自组装示意图。

附图5是抗体药物纳米粒子的粒径分布图。

附图6是抗体药物纳米粒子透射电子显微镜图。

附图7是ADC与纳米ADC的抗体结合实验。

附图8是细胞内吞实验。

附图9是细胞毒性实验。

附图10是抗体药物纳米粒子体内抑瘤效果示意图。

附图11是抗体药物纳米粒子杀伤肿瘤细胞示意图。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1 带有双硫键阿霉素(DOX-PDPH)的合成

称取质量为27.25mg的阿霉素(ADR)，11.78mg的肼基-4-(2-吡啶二硫代)丁酸(PDPH)，溶于3ml的甲醇；室温下避光搅拌反应6天，在不同的搅拌速度下(100rpm，500rpm，1000rpm，3000rpm)反应；减半速度快可防止阿霉素的沉淀，从而有利于ADR-PDPH的合成。反应结束后，可得到橘黄色的产物。ADR-PDPH的合成示意图见图1。

实施例2 巯基化Her2的制备

按l mg的her2和75μg 2-IT(2-iminothiolane·HCI(Traut’s reagent，上海前尘生物科技有限公司))的比例(Anti-Her2-Fab和2-IT的摩尔比为1：100或根据实际情况提高两者的比例)将两者混合。用封口膜封口，防止2-IT被氧化。在室温条件下反应2h。反应体系可以按比例扩大。巯基化的Her2通过透析(PBS，5mM EDTA，pH＝7.4)来除去多余的Traut试剂。6-8小时更换一次透析液，透析2～3次。

实施例3 抗体巯基化标准曲线

Ellman’s测试测定巯基化抗体的-SH量，DTNB为Ellman试剂。它用于比色法测定生物样品中巯基。它易溶于水。在巯基化合物的存在下，无色的DTNB将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412nm处具有最大吸收，DTNB的吸收光谱并不干扰巯基的测定。

试剂的配置：

(1)Tris-HCl缓冲液(0.25M)：DDW(deuterium depleted water)准确的配制后，用盐酸调节pH＝8.3，配置300ml。

(2)半胱氨酸标准溶液(1mM)：准确称取0.017563g L-半胱氨酸(分子量：175.63)，用1ml甲酸溶解，以DDW定容至100ml。

(3)DTNB(分子量:396.35)标准溶液(10mM)：准确的称取0.198175gDTNB，用50mM Na₂HP0₄(pH＝7.0)配制成50ml溶液，存放于棕色瓶中，避光低温保存备用。

(4)DTNB分析溶液(0.1mM)：由1体积10mM的DTNB标准液加99体积0.25M的Tris缓冲液配制而成，现用现配。

半胱氨酸标准曲线的制作：

(a)25℃条件下，用Tris-HCl缓冲液稀释半胱氨酸标准液配成的梯度稀释液各5.0ml，其浓度分别为：0.00mM、0.025mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM。

(b)取上述各浓度溶液1ml分别加入到5ml预先恒温于25℃水中的DTNB分析溶液，摇匀，准确静止10min，立即于波长412nm处测定吸光度值。

(c)由此可以得到吸光度对半胱氨酸浓度的标准曲线，结果如图2所示.根据此合成方法检测出来一个抗体可见结合7-8个巯基，为后续巯基化的抗体与ADR-PDPH反应提供条件。

实施例4 抗体-ADR偶联物的制备

将1mg巯基化的Her2用PBS稀释至1.2ml后，加入1mg的ADR-PDPH(0.4ml甲醇溶液)，混匀后，缓慢通入2min左右的N₂(以防止抗体上的巯基被氧化)，用封口膜将瓶口封死，室温摇床下反应4h后，置于4℃冰箱过夜；24h后，可观察到反应瓶底部仅有少许ADR沉淀，表明大部分的ADR已连接到亲水性抗体上，此时可观察到溶液仍为橘红色。采用离心的方法将未接上抗体游离的ADR从体系中分离出去，由于离心的速度和离心的时间和温度均对合成得到的产物有影响，因此我们对以上三个因素进行了一系列的优化；离心时间设置为5min，10min，20min，30min；离心温度设置为4℃，20℃，37℃；离心速度设置为1000rpm，1500rpm，2000rpm，2500rpm和3000rpm，来找出最优的除去游离阿霉素的条件。实验结果表明离心时间10min，温度20℃，离心速度1500rpm条件下，离心纯化效果最好。

实施例5 抗体偶联化疗药物阿霉素形成纳米粒子

采用旋蒸方法制备抗体包裹ADR纳米粒子。将上述离心纯化后得到的抗体-ADR偶联物5ml加入到50ml的旋蒸瓶中；由于旋转蒸发瓶旋转的速度、通入氮气的速度以及时间和温度对最终所制备的纳米粒子均有影响，因此我们对以上几种因素进行了一系列的研究。旋转瓶的转速设置为30，60，90，120；温度设置为4℃，25℃，37℃以及42℃；通入氮气的流速设置为缓慢(2mL/min)，较快(10mL/min)和快速(20mL/min)三个等级，以优化得到最佳制备纳米粒子的条件。实验结果表明转速60rpm，温度25℃，氮气流速为10mL/min条件下，旋转蒸发时间为3.5h，纳米粒子形成效果最好。根据最优参数，将液体倒进旋转蒸发瓶进行旋转蒸发3-4h后待瓶底溶剂完全蒸干后，可见到瓶底有一薄层红色的薄膜。停止通入氮气后，用少量的去离子水进行洗脱。抗体偶联化疗药物阿霉素形成纳米粒子如图3，4所示。

实施例6 抗体药物纳米粒子中ADR浓度检测

对实施例5制备得到抗体药物纳米粒子中ADR浓度检测。ADR的紫外吸收在495nm，采用紫外分光光度计来检测ADR浓度。取20ul的抗体药物纳米粒子加入20ul的有机试剂乙腈混合后，反应30min彻底将纳米粒子打破，释放出包裹在纳米粒子中的阿霉素；然后加入360ul的去离子水，稀释20倍在495nm处进行检测。阿霉素的浓度计算公式为：C_(ADR)＝A_{(495 nm)}×20×62.5ug/ml，经计算，抗体药物纳米粒子中阿霉素的浓度为C_(ADR)＝62.5ug/mL×20×0.085＝106.5ug/mL。

实施例7 抗体药物纳米粒子的表征

利用动态光散射法来检测制备得到的抗体药物纳米粒子的粒径分布和大小。取实施例5所制备的样品用Milli-Q水稀释成浓度为0.1mg/ml后，然后用0.45μm的Millipore滤器过滤，过滤后加入样品池测定，每个样品重复测定3次。测量条件为：90°散射角，25℃，结果如图5所示。使用TEM(透射电子显微镜)对制备的纳米粒子进行表征。取实施例5制备的样品5μl(样品的浓度为0.5mg/ml)滴到规格为200-网格线自由碳涂层的铜网薄片(Ted Pella Type-A型号)上，于室温静置，待溶液干了后，用2％磷钨酸(PTA)溶液染色2min，结果如图6所示。

实施例8

对与细胞表面相互作用的研究是评价单独化疗药物阿霉素(ADR)和抗体偶联化疗药物(ADC,Her-ADR)以及纳米抗体连接药物(Nano ADC，实施例5制备)的重要衡量指标。通过对与细胞表面的相互作用的研究评价，可以推测出纳米载体在体内的靶向并富集的效果，进而评价其潜在应用价值。具体实验过程如下：

(1)细胞铺板：取对数生长期的N87细胞(人胃癌细胞，上海盈公生物科技有限公司)消化、离心后计数，在24孔板中铺细胞密度为2×10⁵/孔，每孔加入500μl含血清培养液，周围一圈空白细胞孔每个均用500μl PBS补足，放置在7％CO₂，37℃的细胞培养箱中过夜。

(2)分别取游离的阿霉素(ADR)、单独的抗体偶联阿霉素ADC、以及抗体包裹ADR纳米粒子(NanoADC，实施例5制备)，加入细胞孔中，与N87细胞进行孵育，在7％CO₂，37℃孵育6h。

(3)孵育6h后，ADR组，ADC组和抗体包裹ADR纳米组分别用培养基轻轻洗2遍，并将细胞消化离心于15ml离心管中，然后用PBS洗2遍(800rpm×5min)，浓度为1×10⁶/ml，各1ml，上流式检测阿霉素的红色荧光强度。

实验结果如7、8示：其中黑色线表示不要任何药物的空白组，橘红色线表示游离药ADR物组，红色的线表示ADC组，绿色的线表示抗体药物纳米粒子组，从图中数据可以表明抗体与药物形成纳米粒子后，其表面有大量能够与细胞表面抗原结合的抗体，能够增强纳米粒子与细胞之间的相互作用，从图中显示出其ADR的荧光强度最大；其次是抗体偶联ADR，与游离ADR相比，其抗体的靶向性促进了细胞对其内吞，但是较之抗体药物纳米粒子来说，其荧光强度明显要低，这归咎于抗体药物纳米粒子表面大量的抗体。

实施例9 细胞毒性试验

制备得到的抗体药物纳米粒子，游离的药物ADR，单纯的抗体偶联化疗药物(ADC)以及抗体连ADR纳米组装体(Nano ADC，实施例5制备)对细胞的毒性进行评价。细胞铺板：取对数生长期的N87细胞(人胃癌细胞)消化、离心后计数，在24孔板中铺细胞密度为2×10⁵/孔，每孔加入500μl含血清培养液，周围一圈空白细胞孔每个均用500μl PBS补足，放置在7％CO₂，37℃的细胞培养箱中过夜。

分别取游离的阿霉素(ADR)、单独的抗体偶联阿霉素ADC、以及抗体包裹ADR纳米粒子，加入细胞孔中,浓度分别为0.01，0.02，0.04，0.08，0.1，0.2，0.4μg/ml与N87细胞进行孵育，在7％CO₂，37℃孵育24h后，弃去旧的培养基，加入PBS洗板2次后，每孔加入100ul含有10ul CCK-8的细胞培养液在7％CO₂，37℃下孵育2.5h，使用BIO-TEK Elx800全自动酶标仪在450nm波长处，读取样品孔的吸光值，并计算细胞生存率；细胞生存率计算方法：

surviving ratio＝(OD_450scan-OD_450nc)/(OD_450pc-OD_450nc)×100％

其中，OD_450sam：实验组在450nm波长下的吸光值；

OD_450no：阴性对照组在450nm波长下的吸光值；

OD_450pc：阳性对照组在450nm波长下的吸光值。

实验结果如图9所示：图中表明，游离ADR，ADC组以及抗体药物纳米组(Nano ADC)均随着药物浓度的增大，其细胞存活率依次降低；这三种药对细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为0.48±0.05ug/mL，0.14±0.01ug/mL和0.09±0.075ug/mL；由此可见抗体药物纳米组对细胞的抑制效果最好，其对细胞的抑制效果明显要好于ADC组和ADR组；比较ADR和ADC组可以发现，ADC组抑制效果要好于ADR组。

实施例10 体内抑瘤效果实验

首先建立了Her2高表达小鼠肿瘤模型(N87)，然后将接种了N87细胞(人胃癌细胞)的Balb/c裸鼠进行随机分组，分组为3组，包括PBS对照组(Control)、Her2-ADR组，及Nano-ADC组。每组Balb/c裸鼠为5只，平均每只荷瘤的Balb/c裸鼠每次注射按照阿霉素的剂量为5mg/kg，注射5次，平均每3天注射一次(防止单纯阿霉素注射组荷瘤裸鼠副作用导致裸鼠在未完成实验前死亡)。在第一天药物注射时开始记录并随时观察并记录每组接种了N87细胞的荷瘤Balb/c裸鼠的生存情况，每2天测量器肿瘤大小并对其进行体重称量。肿瘤体积计算方法如下：

肿瘤体积计算公式：长×宽×宽/2

对荷瘤Balb/c裸鼠进行药物注射后第30天对全部荷瘤的Balb/c裸鼠进行解剖，取出其肿瘤组织，并测量每组荷瘤Balb/c裸鼠的肿瘤组织的质量与体积，并对其进行数据处理。结果如图10所示，表明实施例5制备的新型Nano-ADC能实现对肿瘤组织的良好治疗。

该实验进一步证明本方法合成的新型Nano-ADC得到提高于临床肿瘤的治疗。这些都得益于抗体药物纳米组中大量的抗体靶向性以及纳米粒子在肿瘤细胞的富集效应，使得其对肿瘤细胞的杀伤效果最好。其基本机制如图11所示：相比于游离的ADC，nano ADC无论是在靶向性、药物递送量，还是瘤组织内的抗体计量上都得到明显的提高，因此，nano ADC无疑是更具有市场前景的新型抗体-化疗复合治疗的药物剂型。

实施例11 CD20-美登素纳米粒子的制备

(1)称取质量为27.25mg的美登素，11.78mg的肼基-4-(2-吡啶二硫代)丁酸(PDPH)，溶于3ml的甲醇；室温下避光搅拌反应6天，搅拌速度为1000rpm，3000。反应结束后，得到带有双硫键的美登素。

(2)按l mg的CD20(上海科敏生物科技有限公司)和75μg2-IT(2-iminothiolane·HCI(Traut’s reagent，上海前尘生物科技有限公司))的比例(Anti-Her2-Fab和2-IT的摩尔比为1：100或根据实际情况提高两者的比例)将两者混合。用封口膜封口，防止2-IT被氧化。在室温条件下反应2h。反应体系可以按比例扩大。巯基化的CD20通过透析(PBS，5mM EDTA，pH＝7.4)来除去多余的Traut试剂。6-8小时更换一次透析液，透析2～3次。分离得到巯基化的CD20。通过Ellman’s测试测定巯基化CD20的巯基数量，实验方法同实施例3，结果显示，每个CD20抗体结合了7-8个巯基。

(3)将1mg巯基化的CD20用PBS稀释至1.2ml后，加入1mg带有双硫键的美登素(0.4ml甲醇溶液)，混匀后，缓慢通入2min左右的N₂(以防止抗体上的巯基被氧化)，用封口膜将瓶口封死，室温摇床下反应4h后，置于4℃冰箱过夜；24h后，通过观察，反应瓶底部残余微量美登素沉淀，表明大部分的美登素已连接到亲水性抗体上。采用离心的方法将未接上抗体游离的美登素从体系中分离出去；离心条件为：离心时间10min，温度20℃，离心速度2000rpm，在此条件下，离心纯化效果最好。

(4)采用旋转蒸发的方法制备纳米粒子。取第3步制备得到的CD20-美登素偶联物5ml加入到50ml的旋蒸瓶中；旋转蒸发参数设置为：转速90rpm，温度25℃，氮气流速为10mL/min，将液体倒进旋转蒸发瓶进行旋转蒸发3-4h后待瓶底溶剂完全蒸干后，用少量的去离子水进行洗脱，得到最终产物CD20-美登素纳米粒子。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.抗体与药物偶联技术及其偶联物所自组装成的纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子是由巯基化的抗体与带有双硫键的化疗药物在液相环境中自组装形成的，具有下的结构：

(Drug)_n—mAb

其中mAb代表单克隆抗体，drug代表化疗药物，n为偶联上的药物数目，n值为1-80；所述纳米粒子为胶束状核壳结构，疏水性的化疗药物包裹在胶束内核中，亲水性抗体形成胶束状外壳；所述胶束粒径大小为20-1000nm；所述每个纳米粒子中化疗药物的分子数目为1-10000。

2.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述化疗药物为阿霉素或美登素。

3.根据权利要求1所述的纳米粒子，其特征在于，所述单克隆抗体为Her2、CD20、CD40、CD34、CD28、CD13或CD22；优选为Her2或CD20。

4.权利要求书1所述的纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

第一步：化疗药物与带有双硫键的交联剂，溶于甲醇后，室温下避光搅拌反应6天，得到带有双硫键的化疗药物；所述的交联剂为肼基-4-(2-吡啶二硫代)丁酸(PDPH)、SMCC、SPDP、VCP；优选为PDPH；

第二步：用2-IT(2-亚氨基硫烷盐酸盐)与抗体在pH＝7.4的PBS下反应，将抗体进行巯基化；

第三步：将巯基化的抗体用PBS稀释，加入双硫键的化疗药物的甲醇溶液，通N₂，密封，室温摇床下反应4h，置于4℃冰箱24h，离心纯化；

第四步：取5ml离心纯化的产物加入到50ml的旋蒸瓶中，通入氮气，旋转蒸发制备抗体包裹化疗药物的纳米粒子，所述旋转蒸发的优选条件为：转速60rpm，温度25℃，旋转蒸发时间为3.5h，氮气流速为10mL/min。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的化疗药物为阿霉素或美登素；所述的抗体为Her2、CD20、CD40、CD34、CD28、CD13或CD22；优选为Her2或CD20。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一步化疗药物与带有双硫键的交联剂质量比为27.25:11.78，搅拌速度为100rpm、500rpm、1000rpm、5000rpm；优选为100rpm。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第二步抗体与2-IT的质量比为1000：75；所述巯基化后每个抗体结合7-8个巯基。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第三步巯基化的抗体与带有双硫键的化疗药物的质量比为1:1；所述离心纯化条件优选为：离心温度20℃，离心速度1500rpm，离心时间10min。

9.权利要求1或4所述的纳米粒子在制备治疗胃癌药物中的应用。

10.权利要求1或4所述的纳米粒子在制备抑制胃癌细胞N87生长的药物中的应用。