CN104825427B - 一种采用2,4-二硝基氯苯复合乙酸法建立异常胆液质载体uc病证动物模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用维吾尔医学体液论结合2,4‑二硝基氯苯复合乙酸法建立异常胆液质载体UC病证动物模型的构建方法，通过以雄性wistar品系大鼠为建模动物，给予建模大鼠干热属性饮水、干热属性饲料灌胃、干热环境和慢性刺激连续刺激这四种处理，以2%的2,4‑二硝基氯苯丙酮液滴背，然后给予建模大鼠禁食，经肛门插入大鼠结肠内灌入2,4‑二硝基氯苯乙醇溶液、乙酸溶液和生理盐水冲洗等一系列的处理从而建立异常胆液质载体UC病证大鼠模型，克服了没有相关动物模型对于异常胆液质载体UC病证机制的研究和相关药物开发的限制，且造模方法简单、成模率高、造模周期短、成本低以及重现性好的优势，具有广泛的应用价值。

Description

一种采用2,4-二硝基氯苯复合乙酸法建立异常胆液质载体UC 病证动物模型的方法

技术领域

本发明涉及医学技术领域。具体的说，本发明涉及一种利用中华民族医药维吾尔医药理论采用科学方法实践的技术领域，进一步讲，本发明涉及一种采用2,4-二硝基氯苯复合乙酸法建立异常胆液质载体UC病证动物模型的技术领域。

背景技术

动物模型的构建是医学研究中的一项重要技术。构建与人类发病相似的疾病模型，可以克服人类本身发生疾病潜伏期长、影响因素多、发生发展缓慢、发病机制复杂等因素的制约，更好地反应疾病发生、发展的规律，并有利于研究不便于在人类本身进行研究的疾病。

溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)属于炎症性肠病，是一种慢性非特异性结肠炎症性疾病。其病程漫长，病情轻重不一，常反复发作，是结肠癌和直肠癌的高风险因素之一。随着社会经济的发展，人们生活方式及节奏的改变，以及健康意识的增强和结肠镜等检查手段的普及，流行病学资料显示，其发病率国内外都有逐年上升的趋势。UC是环境因素、饮食、过度紧张等多种因素相互作用的结果，其中环境因素和精神状态是UC发病的重要诱因，这一观点与维吾尔医学的基本理论相符。

维吾尔医药学（维医）作为我国传统医药学，具有悠久历史和较为完整的理论体系。维医体液论认为正常体液维持人体正常生命活动，当饮食失衡、长时间不运动、精神状态异常等因素可使体液质发生变化，产生相应的异常体液质，引起机体环境稳态平衡失调，使机体处于亚健康状态，若进一步发展超过人体的自我调节能力时，就会导致疾病的发生。维医的异常体液证特证较多，主要涉及精神状态、睡眠、舌苔等一系列表观指标的变化，已发现一些特征及精神状态与疾病有关，虽然这些变化不能作为疾病的诊断标准，但是通过对机体神经-内分泌-免疫系统的影响，可增加机体对疾病的易感性。异常体液使机体体液代谢过程失控从而生成并积累的各种具有致病性质的病理性物质，这种致病性物质可作为新的致病因素，进一步促进恶性进程。每类证型会引发不同疾病，而异常胆液质型人群易患神经系统疾病、肝病和消化系统疾病。因此，研究异常胆液质（属性干热）证与UC的关系就备受关注。在对其进行研究时，构建动物模型是研究异常胆液质载体UC病证发病机制、进行防治药物筛选、药理研究及药效评价研究的重要途径，具有举足轻重的作用。

发明内容

针对目前国内外现有技术中未见利用动物模型研究异常胆液质与UC的关系，并构建异常胆液质载体UC病证动物模型的技术现状，本发明旨在于提供一种采用维医体液论结合2,4-二硝基氯苯复合乙酸法建立异常胆液质载体UC病证动物模型的方法，利用药物2,4-二硝基氯苯复合乙酸构建了异常胆液质载体UC病证动物模型，利用此方法构建的异常胆液质载体UC病证动物模型获得良好的技术效果。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案：

通过以雄性wistar品系大鼠为建模动物，给予建模大鼠干热属性饮水、干热属性饲料灌胃、干热环境和慢性刺激连续刺激这四种处理，以2%的2,4-二硝基氯苯（DNCB）丙酮液滴背，然后给予建模大鼠禁食，经肛门插入大鼠结肠内灌入2,4-二硝基氯苯（DNCB）乙醇溶液、乙酸溶液和生理盐水冲洗等一系列的处理从而建立异常胆液质载体UC病证大鼠模型。

本发明提供一种采用维医体液论结合2,4-二硝基氯苯复合乙酸法建立异常胆液质载体UC病证动物模型的构建方法，具体构建方法步骤如下：

（1）实验动物：选取健康清洁级，体重为180±30g的雄性wistar品系大鼠。

（2）实验大鼠1-13天的饲养：实验大鼠按照每笼5只，满足正常饲养密度，实验大鼠给予每日每笼实验大鼠300g普通饲料适应性喂养7天后给予每日每笼实验大鼠300g普通饲料，400ml干热属性饮水，并连续给予干热属性饲料灌胃、干热环境和慢性刺激连续刺激。

（3）实验大鼠14-23天的饲养：将上述步骤（2）处理后的大鼠从第14天禁食，以准备灌肠DNCB，于第15天用直径 3mm的导管经肛门插入大鼠结肠内8cm左右灌入0.1%的2,4-二硝基氯苯（DNCB）乙醇溶液0.25ml，第16天相同方法以体积分数为6%的乙酸溶液 2ml灌肠，15s后立即注入5ml生理盐水冲洗，以消除乙酸的刺激作用，灌肠前 24h 禁食，自由饮水，观察7天，观察期前3天禁食，大鼠自由饮用7.5%葡萄糖水，以降低大鼠死亡率，葡萄糖水按照每30g葡葡糖粉与每400ml灭菌水配置。

（4）通过上述各技术步骤即可建立了异常胆液质载体UC病证大鼠模型。

本发明所述干热属性饮水：将体内产生胆液质的红花每1g溶于400ml的双蒸水中，侵泡约6h后再给予实验动物饮用。

本发明所述干热属性灌胃饲料：分别将体内产生胆液质的黑胡椒和干姜打成粉末；将每30g黑胡椒粉末、30g干姜粉末和0.3g红花溶于400ml的双蒸水制备为产生胆液质的灌胃饲料，每天每只大鼠灌胃热属性灌胃饲料2ml/100g，灌胃前一天配置,在4度的冰箱中保存；第二天灌胃前室温放置2h。

本发明所述干热环境：采用人工气候箱进行饲养，其中喂养环境温度为26±2℃，相对湿度为36～40%，打开光照，每天10小时。

本发明所述慢性刺激连续刺激：慢性刺激包括4种刺激：一是采用电刺激，采用间断足底电击作为应激源，在输出电压20～40 V，不定时改变电压，间隔2～5 min ，每天1次，1次30 min条件下产生慢性应激；二是采用夹尾刺激，用小型书夹夹住实验大鼠的尾巴,让其实验大鼠相互撕咬、打斗，若停止打斗，则用力拍鼠笼子予以刺激，让其重新打斗或奔跑，每日处理1次，每次5min；三是采用噪音刺激，每天用100dB的快节奏音乐持续播放2h；四是采用化学刺激，实验大鼠背部剃毛，用1mL注射器滴2%（2g/100 mL）的2,4-二硝基氯苯（DNCB）丙酮液0.25mL，滴在剃毛处，每天1次，连续14天。

本发明提供上述技术步骤（3）中出现了两次禁食，第一次为从“第14天禁食”，第二次为“观察7天，观察期前3天禁食”，即从第14天到灌酸后3天一直禁食，这3天给予葡萄糖水提供能量，大鼠自由饮7.5%的葡萄糖水， 按照每30g葡萄糖加400ml灭菌水配置葡萄糖水，每天给予一次。

本发明提供的一种异常胆液质载体UC病证动物模型构建方法，能够成功构建异常胆液质载体UC病证动物模型，克服了没有相关动物模型对于异常胆液质载体UC病证机制的研究和相关药物开发的限制，而且具有造模方法简单、成模率高、造模周期短、成本低以及重现性好的优势。

通过实施本发明具体的发明内容可以达到以下有益效果：

（1）建模方法简单：本发明提供的一种异常胆液质载体UC病证动物模型构建方法，能够成功构建异常胆液质载体UC病证动物模型，克服了没有相关动物模型对于异常胆液质载体UC病证机制的研究和相关药物的开发的限制，而且其具有造模方法简单、成模率高、造模周期短、成本低以及重现性好的优势。

（2）构建的动物模型具有与人类相似的特征表现：维吾尔医药中对异常胆液质型UC病证人群的描述包括舌苔黄，干，小便赤黄，体型消瘦等特征；本发明方法构建的大鼠动物模型表现出舌苔呈现黄色，干燥，随着建证时间的推移，大鼠的舌苔颜色变化略有加重，尿色逐渐加深，呈深黄色及黄褐色，大鼠的体重降低等症状。利用本发明方法构建的动物模型具有与人类相似的特征表现，是研究异常胆液质载体UC病证发病机制、进行防治药物筛选、药理研究及药效评价研究的理想模型。

（3）建模动物病变效果显著：通过以正常组大鼠和UC大鼠为对照，对大鼠的结肠进行了形态学分析；异常胆液质载体UC病证与UC对照组大鼠在一般行为状态，症状体征，组织病理与电镜结果上均存在差异，异常胆液质载体UC病证大鼠的病理变化较严重,均出现向炎症发展趋势，建模动物病变效果显著。

附图说明

图1 显示为异常胆液质载体UC组、UC组和正常组结肠观察图。图中，A为异常胆液质载体UC病证组结肠观察图；B为UC组结肠观察图；C为正常组结肠观察图。

图2 显示为异常胆液质载体UC病证组、UC对照组和正常组大鼠结肠组织HE染色图。图中，A为异常胆液质载体UC病证组大鼠结肠组织HE染色图；B为UC组大鼠结肠组织HE染色图；C为正常组大鼠结肠组织HE染色图。

图3 显示为异常胆液质载体UC病证组、UC结肠和正常组大鼠结肠组织超微结构图。图中，A为异常胆液质载体UC病证组大鼠结肠组织超微结构图；B为UC组大鼠结肠组织超微结构图；C为正常组大鼠结肠组织超微结构图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明所使用的主要实验动物：选择健康清洁级雄性wistar品系大鼠，体重为180±30g，由新疆医科大学实验动物中心提供。动物质量合格证书号：SYXX[新]2011-0004。

本发明所使用的主要实验动物饲料：标准大鼠饲料，由新疆医科大学实验动物中心提供；红花、黑胡椒、干姜，由新疆维吾尔自治区维吾尔医院提供。

本发明所使用的实验试剂和仪器：试剂：2，4-二硝基氯苯（DNCB）、口服葡萄糖、丙酮、乙酸、生理盐水、无水乙醇、液体石蜡、冰乙酸、甘油、甲醛、酒精、署红伊红等，仪器：RQH350型人工气候箱、人体静脉血样采集容器（分离胶/促凝胶)、BA200系列生物显微镜等。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：异常异常胆液质载体UC病证动物模型的构建

本发明采用维医体液论结合2,4-二硝基氯苯复合乙酸法构建异常胆液质载体UC病证动物模型，具体制备方法如下：

（1）实验动物：选取健康清洁级，体重为180±30g的雄性wistar品系大鼠。

（2）实验大鼠1-13天的饲养：实验大鼠按照每笼5只，满足正常饲养密度，实验大鼠给予每日每笼实验大鼠300g普通饲料适应性喂养7天后给予每日每笼实验大鼠300g普通饲料，400ml干热属性饮水，并连续给予产生胆液质饲料灌胃、干热环境和慢性刺激连续刺激。

所述干热属性饮水：将体内产生胆液质的红花每1g溶于400ml的双蒸水中，侵泡约6h后再给予实验动物饮用。

所述干热属性灌胃饲料：分别将体内产生胆液质的黑胡椒和干姜打成粉末；将每30g黑胡椒粉末、30g干姜粉末和0.3g红花溶于400ml的双蒸水制备为产生胆液质的灌胃饲料，每天每只大鼠灌胃ml/100g，灌胃前一天配置,在4度的冰箱中保存；第二天灌胃前室温放置2h。

所述干热环境：采用人工气候箱进行饲养，其中喂养环境温度为26±2℃，相对湿度为36～40%，打开光照，每天10小时。

所述慢性刺激连续刺激：慢性刺激包括4种刺激：一是采用电刺激，采用间断足底电击作为应激源，在输出电压20～40 V，不定时改变电压，间隔2～5 min ，每天1次，1次30min条件下产生慢性应激；二是采用夹尾刺激，用小型书夹夹住实验大鼠的尾巴,让其实验大鼠相互撕咬、打斗，若停止打斗，则用力拍鼠笼子予以刺激，让其重新打斗或奔跑，每日处理1次，每次5min；三是采用噪音刺激，每天用100dB的快节奏音乐持续播放2h；四是采用化学刺激，实验大鼠背部剃毛，用1mL注射器滴2%（2g/100 mL）的2,4-二硝基氯苯（DNCB）丙酮液0.25mL，滴在剃毛处，每天1次，连续14天。

（3）实验大鼠14-23天的饲养：将上述步骤（2）处理后的大鼠从第14天禁食，以准备灌肠DNCB，于第15天用直径 3mm的导管经肛门插入大鼠结肠内8cm左右灌入0.1%的2,4-二硝基氯苯（DNCB）乙醇溶液0.25ml，第16天相同方法以体积分数为6%的乙酸溶液 2ml灌肠，15s后立即注入5ml生理盐水冲洗，以消除乙酸的刺激作用，灌肠前 24h 禁食，自由饮水，观察7天，观察期前3天禁食，大鼠自由饮用7.5%葡萄糖水，以降低大鼠死亡率，葡萄糖水按照每30g葡葡糖粉与每400ml灭菌水配置。

（4）通过上述各技术步骤即可建立了异常胆液质载体UC病证大鼠模型。、

本发明提供上述技术步骤（3）中出现了两次禁食，第一次为从“第14天禁食”，第二次为“观察7天，观察期前3天禁食”，即从第14天到灌酸后3天一直禁食，这3天给予葡萄糖水提供能量，大鼠自由饮7.5%的葡萄糖水，按照每30g葡萄糖加400ml灭菌水配置葡萄糖水，每天给予一次。

通过上述方法构建的动物模型具有与人类相似的特征表现。维吾尔医药中对异常胆液质型UC病证人群的描述包括舌苔黄，干，小便赤黄，体型消瘦等特征；上述方法构建的大鼠动物模型表现出舌苔呈现黄色，干燥，随着建证时间的推移，大鼠的舌苔颜色变化加重，尿色加深，呈深黄色及黄褐色，大鼠的体重降低等症状。上述构建异常胆液质载体UC病证大鼠模型中的各技术步骤都是完整一体的，本发明在提供构建异常胆液质载体UC病证大鼠模型方法中，如何选动物、如何干热属性饲料灌胃、如何慢性刺激连续刺激、如何灌入2,4-二硝基氯苯（DNCB）乙醇溶液和乙酸溶液等技术从而构建动物模型，各技术过程中相互联系、相互制约，各技术参数协同通过提供的方法从而成功构建异常胆液质载体UC病证动物模型。

实施例二：异常胆液质载体UC病证动物模型的构建

UC是原因不明的大肠粘膜的慢性炎症和溃疡性病变，与结肠癌的发病存在一定关系，已被世界卫生组织列为现代难治疾病之一。目前的传统西医学对UC主要采用药物治疗和手术治疗，药物治疗虽然起效快，但长期服用副作用增多，停药后反复发；而手术治疗仍取决于外科医生治疗炎性肠病的经验。因此对UC的机制研究及治疗成为研究重点。

维吾尔医药认为人体是由干热属性的胆液质体液，湿热属性的血液质体液，湿寒属性的粘液质体液，干寒属性的黑胆质体液四种不同的体液构成，它们之间即相互依赖又相互制约。其中胆液质体液形成于肝脏，浓缩于胆囊，通过胆道滴至肠道中分解脂肪，以助消化，刺激肠道蠕动。胆液质体液的功能属性与“火”相似，因此被视为火在人体中的表现。机体摄入的营养物中的干热成分，会形成一种淡黄色、味极苦的胆液质体液。但当胆液质的数量和质量上发生改变，当胆液质占机体的主导成为对人体有损的体液时，称作异常胆液质体液。异常胆液质型体液是一种特殊状态下体液，对于其致病机制尚不清楚，维医认为异常胆液质易发神经系统疾病、肝病和消化系统疾病。因此研究异常胆液质与UC的关系极为重要。

异常胆液质载体UC病证动物模型构建：

（一）实验方法

1、实验动物的分组

取健康清洁级，体重为180±30g的雄性wistar品系大鼠34只，适应性喂养7天后，按体重完全随机法分为3组，即正常对照组10只，UC模型组（简称UC组）12 只、异常胆液质载体UC病证模型组（简称UC病证组）12只。

2、实验动物模型构建

2.1正常组 ：实验大鼠在温度为25±3℃，相对湿度为60-80%的条件下饲养，每笼5只，每日每笼用普通饲料300g，400ml双蒸水，随机饮食水，未受任何刺激。

2.2异常胆液质载体UC病证组

2.2.1异常胆液质载体UC病证组大鼠1-13天的饲养：

大鼠给予普通饲料：实验大鼠每笼5只，并满足正常饲养密度，每日每笼实验大鼠给予300g普通饲料，400ml干热属性饮水，并连续给予干热属性饲料灌胃、干热环境和慢性刺激连续刺激。

所述干热属性饮水：将体内产生胆液质的每1g红花溶于400ml的双蒸水中，侵泡约6h后再给予实验动物饮用。

所述干热属性灌胃药：分别将体内产生胆液质的黑胡椒和干姜打成粉末。将每30g黑胡椒粉末、30g干姜粉末和0.3g红花溶于400ml的双蒸水制备为产生胆液质灌胃饲料。每天每只大鼠灌胃饲料2ml/100g。灌胃前一天配置，并在4度冰箱保存，第二天灌胃前室温放置2h。

所述干热环境：采用人工气候箱进行饲养，其中喂养环境温度为26±2℃，相对湿度为36～40%，打开光照，每天10小时。

所述慢性刺激连续刺激：慢性刺激包括4种刺激。一是采用电刺激：采用间断足底电击作为应激源，产生慢性应激，其中输出电压为20-40 V，不定时改变电压，间隔2-5 min，每天1次，1次30 min。二是采用夹尾刺激：用小型书夹夹住实验大鼠的尾巴,让其相互撕咬、打斗，若停止打斗，则用力拍鼠笼子对其予以刺激，让其重新打斗或奔跑，每日处理1次，每次5min。三是采用噪音刺激：每天用100dB的快节奏音乐持续播放2h。四是采用化学刺激，实验大鼠背部剃毛，用1mL注射器滴2%（2g/100 mL）的2,4-二硝基氯苯（DNCB）丙酮液0.25mL，滴在剃毛处，每天1次，连续14天。

2.2.2异常胆液质载体UC病证组大鼠14-23天的饲养：将上述步骤处理后的大鼠从第14天禁食，以准备灌肠DNCB，于第15天用直径 3mm的导管经肛门插入大鼠结肠内8cm左右灌入0.1%的2,4-二硝基氯苯（DNCB）乙醇溶液0.25ml，第16天相同方法以体积分数为6%的乙酸溶液 2ml灌肠，15s后立即注入5ml生理盐水冲洗，以消除乙酸的刺激作用，灌肠前 24h禁食，自由饮水，观察7天，观察期前3天禁食，大鼠自由饮用7.5%的葡萄糖水，以降低大鼠死亡率，葡萄糖水按照每30g葡葡糖粉与每400ml灭菌水配置。

（3）UC组：

大鼠14天的饲养：实验大鼠每笼5只，并满足正常饲养密度，每日每笼实验大鼠给予300g普通饲料和400ml蒸馏水；采用化学刺激，实验大鼠背部剃毛，用1mL注射器滴2%（2g/100 mL）的2,4-二硝基氯苯（DNCB）丙酮液0.25mL，滴在剃毛处，每天1次，连续14天。

大鼠14-23天的饲养：将上述步骤处理后的大鼠从第14天禁食，以准备灌肠DNCB，于第15天用直径 3mm的导管经肛门插入大鼠结肠内8cm左右灌入0.1%的2,4-二硝基氯苯（DNCB）乙醇溶液0.25ml，第16天相同方法以体积分数为6%的乙酸溶液 2ml灌肠，15s后立即注入5ml生理盐水冲洗，以消除乙酸的刺激作用，灌肠前 24h 禁食，自由饮水，观察7天，观察期前3天禁食，大鼠自由饮用7.5%葡萄糖水，以降低大鼠死亡率，葡萄糖水按照每30g葡葡糖粉与每400ml灭菌水配置。

（二）实验指标

1、定性指标

维吾尔医药体液论对四种异常体液质型人群均有具体描述，其中异常胆液质型的人表现为目黄、舌干、多渴及小便赤黄、体型消瘦等特证外，性格多以暴躁易怒、敏感、慌张、不稳定少寝等为主。本实验根据维医体液论的具体描述以及本实验中的具体操作，拟定舌苔、兴奋程度、皮肤毛色、大便、尿色及体重增长指数为其观察指标。

给予强加因素后每天规定时间（10:00AM-2:00PM）观察实验大鼠一般状态：

皮肤毛发：日光下观察。

易激怒程度：正常组：捉持颈部时不明显反应，异常胆液质载体UC病证组：捉持颈部时尖叫，易怒，欲咬人，精神萎靡等。

舌象舌苔：日光下观察，每2天拍1次照片。

尿色：以当日正排尿时尿颜色为主，并用代谢笼收集。

大便状态：以正排大便时大便形状为主，每周评分两次。进行观察并记录。

2、定量指标

体重：每天按规定的时间称各组大鼠体重并纪录。

饮食量：每日2:00PM每笼加食物300g，次日2:00PM称食物余量，其中差值为每笼的总饮食量，根据下述公式得出100 g体重相对应的饮食量并记录，

100 g体重的饮食量=（100 g×总饮食量）/总体重。

饮水量：每日2:00PM每笼给400 ml水，次日2:00PM量取剩余水量，其中差值为每笼的总饮水量，根据下述公式得出100g体重相对应的饮水量并记录，

100g体重的饮水量=（100g×总饮水量）/总体重。

3、结肠标本的收集

距肛门8cm处取结肠，用眼科剪沿肠系膜剪开，用生理盐水冲洗，并将结肠内容物冲洗干净。粘膜面朝上按评分标准给予评分。并快速将结肠分为4部分，一部分约0.5×0.5立即置于10%甲醛溶液固定室温保存，一部分快速置于2.5%的戊二醛-磷酸缓冲液中固定4℃存放，一部分迅速放进1.5ml的EP管中并与剩下的组织用锡箔纸包好，均放入液氮冻存，并转移至-80℃冰箱保存，备用。结肠粘膜与镜下组织判定评分标准见下表1。

表1：结肠粘膜与镜下组织判定评分标准

注：每只大鼠镜下观察总评分为上皮细胞评分+炎细胞浸润评分。

（三）统计学分析

用SPSS18.0统计软件对动物实验各组数据进行统计学处理，计量资料以均数±标准差(x±S)表示，用One-way ANOVA进行多组样本均数比较，等级资料用秩和检验，显著性界值为0.05。

（四）实验结果

1、异常胆液质载体UC病证大鼠模型各定性指标间的比较

舌苔对比：正常组大鼠的舌苔呈现淡红色，微白苔。异常胆液质载体UC病证大鼠模型组大鼠的舌苔呈现黄色，干燥，并且随着建证时间的推移，大鼠的舌苔颜色变化略有加重。

兴奋程度对比：正常组大鼠对刺激敏感。异常胆液质载体UC病证大鼠模型组大鼠精神萎靡，喜蜷卧在鼠笼一角。

毛色对比：正常组大鼠毛色白，有光泽。异常胆液质载体UC病证大鼠模型组大鼠毛色暗淡，毛躁。

大便对比：正常组大鼠的大便成形、颗粒状、略软。异常胆液质载体UC病证组大鼠灌酸后出现稀便、粘液便、脓液便及血便多成血便。UC组的大便以脓液便为主。

尿色对比：正常组大鼠的尿色为浅黄色。异常胆液质载体UC病证大鼠的尿色逐渐加深，呈深黄色及黄褐色。UC组大鼠的尿色呈黄色和浅黄色，但尿色比异常胆液质载体UC病证组大鼠的尿色浅。

异常胆液质载体UC病证大鼠模型组、UC对照组和正常组定量指标观察

表2：正常组与异常胆液质载体UC病证大鼠模型组及UC对照组建模前后饮食、饮水及体重比较

注：*表示P<0.05。

由表2可知：建证前与正常组相比，异常胆液质载体UC病证大鼠模型大鼠的体重明显减轻且存在统计差异；见证后发现异常胆液质载体UC病证大鼠模型组大鼠体重骤减程度明显大于UC组大鼠，而UC组大鼠在饮食、饮水量前后的差值较为明显。

2.异常胆液质载体UC病证组与UC组和正常组动物模型形态学观察

（1）正常组和UC组与异常胆液质载体UC病证大鼠模型组大鼠结肠肉眼观察。

异常胆液质载体UC病证组：大鼠肠管变粗，肠壁甚至膨胀巨大变薄，肠壁外周粘连严重，结肠粘膜充血、坏死、溃疡形成。

UC对照组组：结肠粘膜充血、坏死，明显有溃疡形成。

正常组：结肠粘膜组织光滑，无粘连，无充血水肿，无溃疡形成

（2）根据结肠粘膜与镜下组织判定评分标准的得到大鼠结肠分级表，如下表3。

表3 正常组-UC对照组-异常胆液质载体UC病证组大鼠结肠分级

表4 ：正常组-UC对照组-异常胆液质载体UC病证组

大鼠结肠粘膜损伤程度比较

由表4可知：与正常组相比，与异常胆液质载体UC病证组和UC组大鼠结肠损伤程度比较均有统计学意义，但异常胆液质载体UC病证组与UC组大鼠结肠粘膜损伤程度比较并不存在差异。

（3）正常组和异常胆液质载体UC病证组组大鼠结肠的HE染色病理组织学观察。

异常胆液质载体UC病证组:结肠黏膜充血水肿、弥漫性破坏，并处于慢性恢复期，淋巴细胞侵润形成滤泡，粘膜上皮出现缺失，腺体排列紊乱，结构模糊，粘膜下层形成肉芽组织，大量嗜酸粒细胞增生，且伴有动脉增生，管壁增厚的现象。

UC对照组：结肠粘膜充血水肿，弥漫性破坏，有少量中性白细胞浸润,累及少量隐窝，粘膜上皮缺失，伴部分腺体异型。

正常组：黏膜上皮完整、连续，腺体排列规则、结构清楚，无溃疡、无靡烂点及淋巴细胞浸润。

（4）正常组与异常胆液质载体UC病证组大鼠结肠组织的电镜观察。

异常胆液质载体UC病证组结肠组织：粘膜上皮细胞微绒毛减少，排列零散；粘膜上皮细胞略有增生，细胞核型变形，核染色质增加，细胞间隙有增宽程度较大，粘性细胞松散。杯状细胞萎缩，线粒体肿胀。

UC对照结肠组织：粘膜上皮细胞间隙有增宽现象但没有异常胆液质UC的宽，柱状吸收上皮细胞微绒毛减少，排列紊乱，固有膜内见嗜酸性粒细胞增多，线粒体空泡变。

正常组结肠组织：粘膜上皮细胞接连紧密，排列整齐；粘膜上皮细胞呈椭圆型，与细胞排列方向一致，细胞器结果未见异常；柱状吸收上皮细胞微绒毛整齐丰富。

实施例三：异常胆液质载体UC病证动物模型的构建

异常胆液质载体UC病证动物模型一般形态分析：本发明用干热性饲料、干热环境、夹尾及噪音等复合刺激以及2,4-二硝基氯苯（DNCB）乙醇溶液等手段处理实验动物，建立异常胆液质载体UC病证动物模型。根据建模过程舌苔、兴奋程度、皮肤毛色、大便、尿色及体重增长指数6项指标由轻逐重，给予分值，选取集中的分值作为异常胆液质载体UC病证动物模型建立的标准。这些异常胆液质载体UC病证大鼠均满足维医对异常胆液质证人群的描述如舌苔黄，干；小便赤黄，体型消瘦等符合维吾尔医药体液论异常胆液质的鉴定标准，异常胆液质载体UC病证动物结肠组织形态学变化也符合UC的病理学改变 ，即认为异常胆液质载体UC病证动物模型建立成功。

本实验将结肠组织作为异常胆液质载体UC病证动物模型研究的重点，判断异常胆液质与UC是否存在联系，内环境稳态改变导致异常胆液质载体UC病证的发生。在对大鼠结肠肉眼观察中发现：常胆液质载体UC病证动物模型中大鼠肠管变粗，肠壁甚至膨胀巨大变薄，肠壁外周粘连严重，结肠粘膜充血、坏死、溃疡形成；在对大鼠结肠粘膜损伤程度研究中发现：与正常组相比，与异常胆液质载体UC病证组和UC组大鼠结肠损伤程度比较均有统计学意义，但异常胆液质载体UC病证组与UC组大鼠结肠粘膜损伤程度比较并不存在差异；在病理组织HE染色中发现：异常胆液质载体UC病证动物模型结肠黏膜充血水肿、弥漫性破坏，并处于慢性恢复期，淋巴细胞侵润形成滤泡，粘膜上皮出现缺失，腺体排列紊乱，结构模糊，粘膜下层形成肉芽组织，大量嗜酸粒细胞增生，且伴有动脉增生，管壁增厚的现象，认为是结肠炎症的表现；对大鼠结肠组织的电镜观察发现：异常胆液质载体UC病证动物模型结肠粘膜上皮细胞微绒毛减少，排列零散，粘膜上皮细胞略有增生，细胞核型变形，核染色质增加，细胞间隙有增宽程度较大，粘性细胞松散，杯状细胞萎缩，线粒体肿胀等进一步说明异常胆液质载体UC病证动物模型的结肠组织存在炎症。通过总结大鼠结肠肉眼观察结果、大鼠结肠粘膜损伤程度研究结果、病理组织HE染色观察结果、大鼠结肠组织的电镜观察结果这四方面关于大鼠结肠的研究，认为异常胆液质载体UC病证动物模型建立成功。

如上所述，即可较好地实现本发明,上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (2)

1.一种采用2,4-二硝基氯苯复合乙酸法建立异常胆液质载体UC病证动物模型的构建方法，其特征在于，具体构建方法步骤如下：

(1)实验动物：选取健康清洁级，体重为180±30g的雄性wistar品系大鼠；

(2)实验大鼠1-13天的饲养：实验大鼠按照每笼5只，满足正常饲养密度，实验大鼠给予每日每笼实验大鼠300g普通饲料适应性喂养7天后给予每日每笼实验大鼠300g普通饲料，400ml干热属性饮水，并连续给予干热属性饲料灌胃、干热环境和慢性刺激连续刺激；

所述的干热属性饮水,将每1g红花溶于400ml的双蒸水中，浸泡6h后再给予实验动物饮用；

所述的干热属性灌胃饲料，分别将黑胡椒和干姜打成粉末；将每30g黑胡椒粉末、30g干姜粉末和0.3g红花溶于400ml的双蒸水制备为产生胆液质的灌胃饲料，每天每只大鼠灌胃2ml/100g，灌胃前一天配置,在4度的冰箱中保存；第二天灌胃前室温放置2h；

所述的干热环境：采用人工气候箱进行饲养，其中喂养环境温度为26±2℃，相对湿度为36～40％，打开光照，每天10小时；

所述的慢性刺激连续刺激，慢性刺激包括4种刺激：一是采用电刺激，采用间断足底电击作为应激源，在输出电压20～40V，不定时改变电压，间隔2～5min，每天1次，1次30min条件下产生慢性应激；二是采用夹尾刺激，用小型书夹夹住实验大鼠的尾巴,让其实验大鼠相互撕咬、打斗，若停止打斗，则用力拍鼠笼子予以刺激，让其重新打斗或奔跑，每日处理1次，每次5min；三是采用噪音刺激，每天用100dB的快节奏音乐持续播放2h；四是采用化学刺激，实验大鼠背部剃毛，用1mL注射器滴2％(2g/100mL)的2,4-二硝基氯苯(DNCB)丙酮液0.25mL，滴在剃毛处，每天1次；

(3)实验大鼠14-23天的饲养：将上述步骤(2)处理后的大鼠从第14天禁食，以准备灌肠DNCB，于第15天用直径3mm的导管经肛门插入大鼠结肠内8cm灌入0.1％的2,4-二硝基氯苯(DNCB)乙醇溶液0.25ml，第16天相同方法以体积分数为6％的乙酸溶液2ml灌肠，15s后立即注入5ml生理盐水冲洗，以消除乙酸的刺激作用，灌肠前24h禁食，自由饮水，观察7天，观察期前3天禁食，大鼠自由饮用7.5％葡萄糖水，以降低大鼠死亡率，葡萄糖水按照每30g葡萄糖粉与每400ml灭菌水配置；

(4)通过上述各技术步骤即可建立了异常胆液质载体UC病证大鼠模型。

2.如权利要求1所述的采用2,4-二硝基氯苯复合乙酸法建立异常胆液质载体UC病证动物模型的构建方法，其特征在于，所述的两次禁食，第一次为从“第14天禁食”，第二次为“观察7天，观察期前3天禁食”，即从第14天到灌酸后3天一直禁食，灌酸后的3天给予葡萄糖水提供能量，大鼠自由饮7.5％的葡萄糖水，按照每30g葡萄糖加400ml灭菌水配置葡萄糖水，每天给予一次。