CN104824493B - 一种应用榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素b1降解的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及应用榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素B1降解的方法；提供具体的科学的步骤及参数；提供特定培养基和特定营养补充液，并采用协同方式进行菌菇培养，同时创造性地采用两段式培养方式；还意外的发现，培养基中选用可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖的组合与胰蛋白胨，并且以可溶性淀粉：蔗糖：葡萄糖：胰蛋白胨＝2：1：1：0.5的碳氮比，取得了预料不到的效果，降解能力得到显著提高。对黄曲霉毒素B1的降解率达79‑87％。
Description
技术领域
本发明属于食品化学及食品微生物技术领域，涉及应用榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素B1降解的方法，涉及提高菌菇对黄曲霉毒素B1降解能力的培养基和培养基后期营养补充液。
背景技术
20世纪60年代在英国发生的十万只火鸡突发性死亡事件，经调查确认这起事件与从巴西进口的花生粕有关，这些花生粕被一种来自真菌的有毒物质污染，最终使人们发现了是由黄曲霉(Aspergillus.flavus)产生的有毒代谢物质，称为AFB1。AFB1是一类由黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)以及特曲霉(A.nomius)等真菌产生的次级代谢产物，无色、无味、无嗅，是一类具有二氢呋喃杂氧萘环结构的衍生物的总称。AFB1是已发现真菌毒素中危害性最大的一种。
AFB1是一种毒性极强的剧毒物，无论对人还是多种动物都表现出剧烈的毒性，而且具有明显的致癌、致畸、致突变能力。AFB1的靶细胞在肝脏，中毒后还会产生黄疸、低烧、沮丧、厌食和腹泻等典型而又非特异性的变化。在AFB1家族里，毒性最大的AFB1，其毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，二甲基亚硝胺的75倍。AFB1还可以与体内的tRNA结合形成加成物质，从而抑制与氨基酸的结合，对体内合成必须氨基酸产生不同程度的抑制，干扰蛋白的合成，影响细胞代谢。
黄曲霉毒素B1能污染多种农作物，如玉米，花生，大米，油料种子和香料等，在我国，以玉米和花生中污染最为严重。由于其污染范围较广且毒性较强，黄曲霉毒素被普遍认为是一种造成全球范围危害的真菌毒素。并且，黄曲霉毒素B1具有稳定的耐热性，且通过正常的烹饪手段难以将其去除，更增加了其危害性。鉴于此，开展如何去除AFB1的研究迫在眉睫，并且具有重要意义。目前，黄曲霉毒素的生物学脱毒方法主要有以下两种：微生物菌体吸附去除黄曲霉毒素：例如鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌干酪亚种及某些酿酒酵母等，上述菌株能通过物理吸附方式与黄曲霉毒素结合，形成毒素-菌体复合物，但如何将复合物从食品和饲料中分离去除，成为有待于解决的难题。微生物代谢产生的酶降解黄曲霉毒素：例如从嗜麦窄食单胞菌、诺卡氏菌、假密环菌、分枝杆菌及红串红球菌中提取出的降解酶，此方法降解效率高，降解条件温和，成本低而受到越来越多的关注。
有实验证明大型真菌也具有降解毒素能力。平菇可降解木质素，这是一个氧化过程，降解木质素的酶系主要有木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)和藜芦醇氧化酶(VAO)，其中起主要降解作用的是漆酶(Lac)。平菇菌丝能够产生降解纤维素的酶——漆酶。有研究者从可食用的真菌平菇中筛选到降解黄曲霉毒素的菌株，该菌株经发酵培养可产 生漆酶，是安全无毒的，可以直接食用。试验表明，农业废弃物(如稻草、棉籽壳等)被平菇等真菌降解后，其营养价值明显得到提高，可有效改善动物粗饲料贫乏的状况。虽然平菇来源容易，但是平菇漆酶存在酶活性不稳定、降低毒素能力还有待于进一步提高的缺点，而提高平菇降解黄曲霉毒素能力又遇到瓶颈。榆黄菇是一种可在榆树等阔叶树、玉米芯、稻草培养基上生长发育的可食用真菌，具有降解纤维素、木质素等物质的能力，榆黄菇来源广泛、容易培养。香菇不仅是人们日常生活中的美味食物，而且是一类降解能力相当强的白腐真菌，富含具有降解能力的多种酶，且易于提取并具有较高的耐热性。但国内外对榆黄菇与香菇降解黄曲霉毒素的研究处于空白，寻求适用的新菌菇资源、探索有效毒素降解方法和方式、提供特定培养基成为急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的：提供降解黄曲霉毒素菌菇新资源；提供更有效的黄曲霉毒素B1降解方法，科学步骤和参数。
本发明解决的技术问题：寻找到高效降解黄曲霉毒素菌菇新资源榆黄菇和香菇；克服平菇漆酶存在酶活性不稳定、降低毒素能力不高的缺点，提供具体的用榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素B1进行降解的方法及科学步骤和参数；提供特定培养基和特定营养补充液，并采用协同方式进行培养，大大提高毒素降解能力。
本发明的技术方案：
一种应用榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素B1进行降解的方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)菇菌活化：将榆黄菇或香菇从PDA试管斜面转接到YEPD固体平板中央，30-32℃恒温培养5-6d，进行活化；
(2)菌株发酵液的制备：将活化后的榆黄菇或香菇接种到装有100mLMSM液体培养基的三角瓶中，25-28℃、80-200rpm摇床培养4-5d，榆黄菇培养条件的pH＝5-6，香菇培养条件的pH＝3-3.5；然后7000-8000rpm离心5-8min，上清液经0.22μm滤膜过滤后，即得无菌发酵液，置于4℃冰箱中备用；
(3)毒素降解：准确吸取无菌发酵液800-1200μL，优选1000μL；加入到2.0mL灭菌离心管中，向离心管中加入0.05mL 100-200ng/mLAFB1标准品的标准溶液，振荡混匀，于25-35℃(榆黄菇35℃或香菇25℃)，pH值为5.5-6.5，转速80-200rpm，摇床培养6-8d，得混合液，将上述混合液8000-10000rpm离心1-5min，得降解了黄曲霉毒素B1的上清液，记为S液。后续将上清液，即S液，加入到三角瓶中，再向三角瓶中加入4-5mL乙腈-水(V:V＝84:16)，剧烈震荡15min，然后将三角瓶中的溶液加入到10mL离心管中，静置30min，取下层清液2mL加到氮吹试管中，于60℃氮气吹干，再用甲醇-水溶液(V:V＝1:9)溶解出AFB1，经0.22um 滤膜过滤后，上机测定；降解率计算：降解率＝(1－S液中AFB1浓度/标准品中AFB1的浓度)x100％。
一种提高榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素B1降解能力的方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)菇菌活化：将榆黄菇或香菇从PDA试管斜面转接到YEPD固体平板中央，30℃恒温培养5d，进行活化；
(2)菌株发酵液的制备：将活化后的榆黄菇或香菇接种到装有100mL特定液体培养基的三角瓶中，分两个阶段培养，第一阶段：先于25-28℃、榆黄菇pH＝6或香菇pH＝4、150-200rpm摇床培养1-1.5天；第二阶段：再于30-35℃、榆黄菇pH＝5或香菇pH＝3，80-90rpm摇床培养3-4天，并且在第二阶段开始补充营养补充液10mL，7000-8000rpm离心5-8min，上清液经0.22μm滤膜过滤后，即得无菌发酵液，置于4℃冰箱中备用；其中特定液体培养基按如下组分与配比制备：可溶性淀粉10g，蔗糖5g，葡萄糖5g，胰蛋白胨2.0g，KH2PO40.17g，MgSO4·7H2O 0.36g，CaCl2·2H2O 0.37g，吐温800.5mL，微量元素溶液80mL，121℃灭菌20min，冷却得到；其中，1升微量元素溶液：MgSO4·7H2O 0.3g，MnSO4·H2O 0.05g，CoCl2·6H2O 0.01g，ZnSO4·7H2O0.01g，CuSO4·5H2O 0.01g，KAl(SO4)2·12H2O 1mg，H3BO31mg，Na2MoO4·2H2O或Na2MoO41mg，余量为无菌纯净水；其中，1升营养补充液：胰蛋白胨2.0g、甘氨酸1.0g、硝酸钠1.0g、CuSO4·5H2O 0.5g、余量为无菌纯净水，121℃灭菌20min，冷却得到；
(3)毒素降解：准确吸取无菌发酵液800-1200μL，优选1000μL；加入到2.0mL灭菌离心管中，向离心管中加入0.05mL 100-200ng/mLAFB1标准品的标准溶液，振荡混匀，于25-35℃(榆黄菇35℃或香菇25℃)，pH值为5.5-6.5，转速150-200rpm，摇床培养6-8d，得混合液，将上述混合液8000-10000rpm离心1-5min，得降解了黄曲霉毒素B1的上清液。记为S液。后续将上清液，记S液，加入到三角瓶中，再向三角瓶中加入4-5mL乙腈-水(V:V＝84:16)，剧烈震荡15min，然后将三角瓶中的溶液加入到10mL离心管中，静置30min，取下层清液2mL加到氮吹试管中，于60℃氮气吹干，再用甲醇-水溶液(V:V＝1:9)溶解出AFB1，经0.22um滤膜过滤后，上机测定；降解率计算：降解率＝(1－S液中AFB1浓度/标准品中AFB1的浓度)x100％。
一种提高榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素B1降解能力的方法，其突出性特点，使用了所述的特定培养基和所述的营养补充液协同培养。
本发明的MSM培养基选用最低盐MSM培养基。
本发明的有益效果：对黄曲霉毒素B1的降解率达79-87％。
(1)本发明尝试使用榆黄菇和香菇来降解黄曲霉毒素，虽然榆黄菇、香菇与平菇都属于常见真菌，但子实体生理生化特性也存在诸多差异，使用榆黄菇、香菇是也是从成千上万种真菌 中筛选出来的，这本身就具有创新性。提供了一种应用榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素B1进行降解的具体方法，提供了科学的步骤和参数，这些参数的获得是付出了创造性劳动的，尤其提供了一种提高榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素B1降解能力的方法。
(2)创造性的采用特定培养基和特定补充液协同方式进行培养，能够显著提高降解能力。漆酶为一种次生代谢产物，一般在营养匮乏的时候才开始分泌，而且通常认为漆酶在低碳、低氮的培养基中活性较高，然而发明人意外发现高碳低氮培养基更有利于榆黄菇和香菇中高活性漆酶的分泌，同时意外发现培养基中选用可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖的组合与胰蛋白胨，并且以可溶性淀粉：蔗糖：葡萄糖：胰蛋白胨＝2：1：1：0.5的碳氮比，取得了预料不到的效果，降解能力得到显著提高。
(3)创造性地采用两段式培养方式，先于相对低温、高pH、高摇速进行培养，然后于相对第一阶段选择高温、低pH、慢摇速进行培养。在研究中发现，先在营养稍匮乏、条件适宜的培养基中短时培养，可以大大刺激漆酶的分泌及增强分泌倾向；紧接着改变为另一种不同而适宜的培养条件，培养条件的突然性改变，菌菇启动抗应激能力，此时，在补充液中铜离子的协同下进一步诱导漆酶的大量产生，氮和氨基酸的补充提供了必要的营养补充，酶的活性及稳定性得到明显提高。发明人研究发现，补充液中不适合添加碳源。整个参数是有机整体，不可分割对待。
(4)此外，本发明在营养液中不使用Fe，因为发明人发现Fe具有较强的抑制作用；以补充液形式再次添加，能够大大减少了第一阶段微量元素的使用量。
MSM培养基：蔗糖20g、酵母提取物3g、(NH4)2SO44.5g、K2HPO43g、MgSO4·7H2O 1g、柠檬酸0.25g、CaCl2·2H2O 0.05g、微量元素混合液10ml、蒸馏水1000ml；微量元素混合液：甘氨酸7.8g，MgSO4·7H2O 12g，MnSO4·H2O 2.9g，NaCl 17g，FeSO4·7H2O 0.359g，CoCl20.775g，CaCl2·2H2O 0.9g，ZnSO4·7H2O 0.348g，CuSO4·5H2O0.04g，KAl(SO4)2·12H2O 0.021g，H3BO30.16g，Na2MoO4·2H2O或Na2MoO40.041g，用蒸馏水定容至1000mL。也可以使用其它常规任意的MSM培养基。
YEPD培养基:酵母粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、蒸馏水1000ml；调节pH至6.0，121℃湿热灭菌20min即可。固态培养基，就在原来的基础上加15-20克的琼脂。也可以使用本领域任意其它适宜的培养基活化。
PDA培养基：马铃薯200克、蔗糖20克、琼脂20克、水1000毫升，121℃灭菌20min即可。也可以使用本领域任意其它适宜的培养基活化。
黄曲霉毒素B1的检测：
使用液相色谱-质谱联用法检测黄曲霉毒素B1：
黄曲霉毒素B1标准曲线的绘制
准确移取浓度为2μg/mLAFB1标准品500mL，用色谱纯甲醇将AFB1标准品溶解配制成浓度为500ng/mL的母液，再将标准母液逐级稀释，得到浓度分别为5.00、25.00、50.00、100.00、150.00、200.00、250.00ng/mL的系列标准溶液。分别移取1mL上述不同浓度标准溶液至10mL尖底试管中，氮吹，用1.0mL甲醇水(V:V＝1:9)溶液溶解残渣，经0.22μm滤膜过滤后，上机测定。每个浓度3次重复，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
a色谱条件
色谱柱:WatersAtlantisdC18柱(3.0mm×150mm×3.0um) 柱温33℃；
流动相:乙腈(A)和0.1％甲酸溶液(B) 流速0.3mL/min
b质谱条件
ESI正离子电离源，毛细管电压3.0kV萃取电压2V，离子源温度120℃，脱溶剂温度为380℃，脱溶剂气和锥孔气均为N2，其中脱溶剂气流速550L/h，锥孔气流速50L/h，碰撞气为高纯氩气，碰撞室的压力0.3Pa。采用多反应监测(MRM)模式，母离子(Q1)/子离子(Q3)对均设为单位分辨。
降解率＝(1－降解后样品中AFB1浓度)/标准品中AFB1的浓度)x 100％
本发明也可以使用本领域其它任意的黄曲霉毒素B1的检测方法和降解率的计算方式，方法原理或实质不变。
试验部分：
按本申请权利要求1所述方法，选用榆黄菇，其它条件相同，结果见表1。
表1：不同培养基黄曲霉毒素B1降解率比较
不同培养基之间的黄曲霉毒素B1降解率有显著性差异(P<0.05)
实施例1
一种应用榆黄菇对黄曲霉毒素B1进行降解的方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)菇菌活化：将榆黄菇从PDA试管斜面转接到YEPD固体平板中央，31℃恒温培养6d，进行活化；
(2)菌株发酵液的制备：将活化后的榆黄菇接种到装有100mLMSM液体培养基的三角瓶中，27℃、150rpm摇床培养4-5d，榆黄菇培养条件的pH＝5.5；然后7500rpm离心6min，上清液经0.22μm滤膜过滤后，即得无菌发酵液，置于4℃冰箱中备用；
(3)毒素降解：准确吸取无菌发酵液1000μL；加入到2.0mL灭菌离心管中，向离心管中加 入0.05mL 150ng/mLAFB1标准品的标准溶液，振荡混匀，于35℃，pH值为6，转速150rpm，摇床培养6-8d，得混合液，将上述混合液10000rpm离心5min，得降解了黄曲霉毒素B1的上清液，对黄曲霉毒素B1的降解率达79.02％。
实施例2
一种应用香菇对黄曲霉毒素B1进行降解的方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)菇菌活化：将香菇从PDA试管斜面转接到YEPD固体平板中央，32℃恒温培养6d，进行活化；
(2)菌株发酵液的制备：将活化后的榆黄菇或香菇接种到装有100mLMSM液体培养基的三角瓶中，28℃、200rpm摇床培养5d，香菇培养条件的pH＝3.5；然后8000rpm离心5-8min，上清液经0.22μm滤膜过滤后，即得无菌发酵液，置于4℃冰箱中备用；
(3)毒素降解：准确吸取无菌发酵液1000μL；加入到2.0mL灭菌离心管中，向离心管中加入0.05mL 100ng/mLAFB1标准品的标准溶液，振荡混匀，于25℃，pH值为6.5，转速200rpm，摇床培养6-8d，得混合液，将上述混合液8000-10000rpm离心1-2min，得降解了黄曲霉毒素B1的上清液，对黄曲霉毒素B1的降解率达81.02％。
实施例3
一种提高榆黄菇对黄曲霉毒素B1降解能力的方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)菇菌活化：将榆黄菇从PDA试管斜面转接到YEPD固体平板中央，30℃恒温培养5d，进行活化；
(2)菌株发酵液的制备：将活化后的榆黄菇接种到装有100mL特定液体培养基的三角瓶中，分两个阶段培养，第一阶段：先于27℃、pH＝6、200rpm摇床培养1.5天；第二阶段：再于32℃、pH＝5，90rpm摇床培养4天，并且在第二阶段开始补充营养补充液10mL，7000-8000rpm离心5-8min，上清液经0.22μm滤膜过滤后，即得无菌发酵液，置于4℃冰箱中备用；其中特定液体培养基按如下组分与配比制备：可溶性淀粉10g，蔗糖5g，葡萄糖5g，胰蛋白胨2.0g，KH2PO40.17g，MgSO4·7H2O 0.36g，CaCl2·2H2O 0.37g，吐温800.5mL，微量元素溶液80mL，121℃灭菌20min，冷却得到；其中，1升微量元素溶液：MgSO4·7H2O 0.3g，MnSO4·H2O0.05g，CoCl2·6H2O 0.01g，ZnSO4·7H2O 0.01g，CuSO4·5H2O 0.01g，KAl(SO4)2·12H2O1mg，H3BO31mg，Na2MoO4·2H2O或Na2MoO41mg，余量为无菌纯净水；其中，1升营养补充液：胰蛋白胨2.0g、甘氨酸1.0g、硝酸钠1.0g、CuSO4·5H2O 0.5g、余量为无菌纯净水，121℃灭菌20min，冷却得到；
(3)毒素降解：准确吸取无菌发酵液1000μL；加入到2.0mL灭菌离心管中，向离心管中加入0.05mL 100ng/mLAFB1标准品的标准溶液，震荡混匀，于35℃，pH值为6，转速200rpm，摇床培养6-8d，得混合液，将上述混合液8000-10000rpm离心3min，得降解了黄曲霉毒素B1的上清液。对黄曲霉毒素B1的降解率达87.06％。
实施例4
一种提高香菇对黄曲霉毒素B1降解能力的方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)菇菌活化：将香菇从PDA试管斜面转接到YEPD固体平板中央，30℃恒温培养5d，进行活化；
(2)菌株发酵液的制备：将活化后的榆黄菇或香菇接种到装有100mL特定液体培养基的三角瓶中，分两个阶段培养，第一阶段：先于28℃、pH＝4、200rpm摇床培养1-1.5天；第二阶段：再于35℃、pH＝3，90rpm摇床培养3-4天，并且在第二阶段开始补充营养补充液10mL，7000-8000rpm离心5-8min，上清液经0.22μm滤膜过滤后，即得无菌发酵液，置于4℃冰箱中备用；其中特定液体培养基按如下组分与配比制备：可溶性淀粉10g，蔗糖5g，葡萄糖5g，胰蛋白胨2.0g，KH2PO40.17g，MgSO4·7H2O 0.36g，CaCl2·2H2O 0.37g，吐温800.5mL，微量元素溶液80mL，121℃灭菌20min，冷却得到；其中，1升微量元素溶液：MgSO4·7H2O 0.3g，MnSO4·H2O 0.05g，CoCl2·6H2O 0.01g，ZnSO4·7H2O 0.01g，CuSO4·5H2O 0.01g，KAl(SO4)2·12H2O 1mg，H3BO31mg，Na2MoO4·2H2O或Na2MoO41mg，余量为无菌纯净水；其中，1升营养补充液：胰蛋白胨2.0g、甘氨酸1.0g、硝酸钠1.0g、CuSO4·5H2O 0.5g、余量为无菌纯净水，121℃灭菌20min，冷却得到；
(3)毒素降解：准确吸取无菌发酵液1000μL；加入到2.0mL灭菌离心管中，向离心管中加入0.05mL 150ng/mLAFB1标准品的标准溶液，振荡混匀，于25℃，pH值为6，转速200rpm，摇床培养6-8d，得混合液，将上述混合液8000-10000rpm离心5min，得降解了黄曲霉毒素B1的上清液。对黄曲霉毒素B1的降解率达86.12％。
Claims (3)
1.一种提高榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素B1降解能力的方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)菇菌活化：将榆黄菇或香菇从PDA试管斜面转接到YEPD固体平板中央，30℃恒温培养5d，进行活化；
(2)菌株发酵液的制备：将活化后的榆黄菇或香菇接种到装有100mL特定液体培养基的三角瓶中，分两个阶段培养，第一阶段：先于25-28℃、榆黄菇pH＝6或香菇pH＝4、150-200rpm摇床培养1-1.5天；第二阶段：再于30-35℃、榆黄菇pH＝5或香菇pH＝3，80-90rpm摇床培养3-4天，并且在第二阶段开始补充营养补充液10mL，7000-8000rpm离心5-8min，上清液经0.22μm滤膜过滤后，即得无菌发酵液，置于4℃冰箱中备用；其中特定液体培养基按如下组分与配比制备：可溶性淀粉10g，蔗糖5g，葡萄糖5g，胰蛋白胨2.0g，KH2PO4 0.17g，MgSO4·7H2O 0.36g，CaCl2·2H2O 0.37g，吐温800.5mL，微量元素溶液80mL，121℃灭菌20min，冷却得到；其中，1升微量元素溶液：MgSO4·7H2O 0.3g，MnSO4·H2O 0.05g，CoCl2·6H2O 0.01g，ZnSO4·7H2O0.01g，CuSO4·5H2O 0.01g，KAl(SO4)2·12H2O 1mg，H3BO31mg，Na2MoO4·2H2O 1mg，余量为无菌纯净水；其中，1升营养补充液：胰蛋白胨2.0g、甘氨酸1.0g、硝酸钠1.0g、CuSO4·5H2O0.5g、余量为无菌纯净水，121℃灭菌20min，冷却得到；
(3)毒素降解：准确吸取无菌发酵液800-1200μL，加入到2.0mL灭菌离心管中，向离心管中加入0.05mL 100-200ng/mLAFB1标准品的标准溶液，振荡混匀，榆黄菇35℃或香菇25℃，pH值为5.5-6.5，转速150-200rpm，摇床培养6-8d，得混合液，将上述混合液8000-10000rpm离心1-5min，得降解了黄曲霉毒素B1的上清液。
2.根据权利要求1所述的一种提高榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素B1降解能力的方法，其特征在于，第一阶段：先于25℃、榆黄菇pH＝6或香菇pH＝4、200rpm摇床培养1-1.5天；第二阶段：再于35℃、榆黄菇pH＝5或香菇pH＝3，90rpm摇床培养3-4天，并且在第二阶段开始补充营养补充液10mL，7000-8000rpm离心5-8min，上清液经0.22μm滤膜过滤后，即得无菌发酵液，置于4℃冰箱中备用。
3.根据权利要求1或2所述的一种提高榆黄菇或香菇对黄曲霉毒素B1降解能力的方法，其特征在于，使用所述的特定培养基和所述的营养补充液协同培养。
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