CN104818282A

CN104818282A - 斑马鱼tmem132e基因的cDNA全长序列及其应用

Info

Publication number: CN104818282A
Application number: CN201510108488.4A
Authority: CN
Inventors: 李江夏; 刘奇迹; 龚瑶琴
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2015-03-12
Filing date: 2015-03-12
Publication date: 2015-08-05

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种斑马鱼tmem132e基因的cDNA全长序列及其应用。本发明提供了斑马鱼tmem132e基因的全长序列，其DNA全长为3222bp，包含3219bp的开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。提供了由该斑马鱼tmem132e基因编码的蛋白质分子。通过本发明的斑马鱼tmem132e基因，可以根据基因序列人工合成或转基因生物合成具有生物活性的纯化蛋白或寡核苷酸，有助于了解斑马鱼tmem132e基因的基因组结构，分析该基因的表达和蛋白的功能。

Description

斑马鱼tmem132e基因的cDNA全长序列及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及斑马鱼tmem132e基因全长表达序列和所编码的一种蛋白，以及该基因的克隆和检测方法。

背景技术

大多数生命过程在长期的进化过程中具有高度的保守性，模式生物也因此成为研究人类发育、系统功能、疾病发生等的重要工具，特别是脊椎动物和人类的胚胎发育过程在形态上相当类似，在细胞和分子水平上所涉及的信号通路和基因一般也有高度的同源性。斑马鱼作为一种新型的脊椎模式生物，具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖等诸多优点，特别是可以进行大规模的正向基因饱和突变与筛选。这些特点使其成为功能基因组时代生命科学研究中重要的模型生物之一，已经被广泛应用于人类疾病和胚胎发育过程的研究。

位于人类17q12的TMEM132E(transmembrane protein 132E)基因包括10个外显子，基因组长约60kb,cDNA全长2955nt,编码985个氨基酸的单跨膜型糖蛋白,该基因的突变会导致人常染色体隐性遗传非综合症耳聋(DFNB99),但具体机制尚不明确，软件分析未发现类似相关蛋白。我们拟借助斑马鱼这一模式生物,利用斑马鱼作为模式生物的优点，通过研究斑马鱼中人TMEM132E的同源基因tmem132e的功能，为阐明人TMEM132E该基因的生物学功能奠定基础。

分析发现，在NCBI Genbank中已经有两个斑马鱼tmem132e的mRNA序列,分别为XM_003198707和XM_68740,都是在2011年3月被提交至Genbank。其中XM_003198707序列为tmem132e基因的部分mRNA序列，只有1451bp；XM_68740全长为2615bp，这两个序列都是在斑马鱼基因组测序结果的基础上，通过计算机软件分析预测出的斑马鱼tmem132e基因的mRNA序列，并没有在实验室中被验证。因此，得到斑马鱼tmem132e基因正确的全长cDNA序列和所编码的蛋白，是研究斑马鱼tmem132e基因功能的首要任务和目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种斑马鱼tmem132e基因，已注册于NCBI Genbank，命名为JX995104。斑马鱼tmem132e基因的cDNA全长为3222bp，包含3219bp的开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了上述基因编码翻译出的蛋白质分子，具有1073个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

MGHFVVQGDLPWILCSLRLVIMIIAGKVSPTSSDALFSVPVPSA

TSSPPEVYLPATFKLSNTQLAFFLQENRAPSYGSQRGHPLQRSESFVVFQTKELPAVN

ISLGPFTQDQTLSKDLLQPSSPLDIPGRLTVNWKVRAFIVQSRVYASNPLVQVLFYIA

GRDWDDFKIQDKLPCVRLHAFRDVREIKTSCRLQGNLAQCLAQLDLPSTWFNVNVAPL

GRRKSSGTDGLELTGETLQVELYYTLHDPDSNDECGESYPRRGGPSRGESLSQQPLLR

IGSISLYQPSQEQLVVDKQLDKNLFLRLPERPLKPGETLNIYLLLVPNSTVEQFTLKV

KAKKGVNLLSTKSRSNQWRVEWDMQSGAKHSIATVEASKIKGVSGDMAGSIEIMQLDF

EMENFTSQSVTRRINWNIDYRGQNPTSDAEKVVTELTVVQKDIQAIIPLSMDTEIINT

AVLTGRTVAIPVKVVSIELNGAVTDVSSSVQCKSFNEDIVKVSMNCDYVFVNGKETRG

SMNARVIFSYEHLSAPLELTVWVPKLPLKVELSDNRLSFIKGWRVPILPDRRTARDSD

DDDDDDRKVSRGCTLQYQRAQIKVLTQFHTTSSEGTNQMITMLGPDWQVDVTELVQDS

LKVVDGRVAELADRTVLVANELGSSTLKVESPLAVEAVLGETQFSVVDEKVSIVELRV

HAISGLALNLQPSPGNSHTMVAKATGLQTLSTLKQEASFSIWVYYSDNTAAPLSMYDP

KDYNLNGTSADDKVVTVAQQPQQRWPVIIAEGEGTGDIVHVEMTISETCQKTKRKSVI

ASSSVFVKVRFGTDEDSEEDMEMETEIDTRMPANTRRPAIDSNVGGAGYEPSNEQPAS

VPIDYTNFPTISNPEEPTEEDEEDDEFVHSPRSMTDLEIGMYALLGVFCLAILVFLIN

CIVFVLKYRHKRIPPEGQANMDHSHHWVFLGNGEPLRTQSDLSPQTVESPSNTLEGVQ

TCCHGDHHSSGSSQTSVQSQVHGRGDGSSGGSTKDHGEDASSPTSKRKRVKFTTFTLP

TEDLPYNSIPIANEEDIQWVCQDMGFQDQEELHDYMRRIKEIA。

本发明还提供了用于扩增斑马鱼tmem132e基因的引物序列，其中，用于扩增斑马鱼tmem132e基因5’端的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，扩增出的片段长度为1042bp；用于扩增斑马鱼tmem132e基因3’端的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，扩增出的片段长度为2280bp。

SEQ ID NO.3：5'ATGGGACATTTTGTTGTTCAAG3'

SEQ ID NO.4：5'TTGACTTGGTGCTGAGGAGATT 3'

SEQ ID NO.5：5'GACCCTCAACATCTATCTGCTC3'

SEQ ID NO.6：5'GGCTATTTCCTTTATCCTGCGC 3'

本发明进一步提供了斑马鱼tmem132e基因序列的克隆方法，包括以下步骤：

(1)提取斑马鱼幼体总RNA；

取受精后3天的Tu系野生型斑马鱼，在1.5ml的Ep管中用研磨棒粉碎，然后用Takara公司的Trizol试剂盒，按照试剂盒说明书操作提取出总RNA.

(2)引物设计

首先从NCBI Genbank中下载斑马鱼tmem132e的mRNA序列,分别为XM_003198707和XM_68740,经过BLAST比对，分析二者的共有序列，使用Primer 5软件设计引物。由于该基因较大，所以设计两对引物分别扩增斑马鱼tmem132e基因cDNA的5’端和3’端，为便于拼接全长，设计的引物要保证扩增的两DNA片段有部分序列重叠。用于扩增斑马鱼tmem132e基因5’端的引物序列如序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；用于扩增斑马鱼tmem132e基因3’端的引物序列如序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

(3)cDNA合成

以提取的斑马鱼幼体总RNA为模板，使用Fermentas公司的Reverse Transcription试剂盒，以Oligo(dT)18为引物，按照试剂盒说明书反转录合成cDNA。

(4)PCR扩增

用上述反转录产物做模板，PCR扩增tmem132e的5’端和3’端，PCR反应中的DNA聚合酶为Takara公司的LA Taq DNA聚合酶。PCR体系见下表：

成分	体积(μl)
		LA Taq DNA聚合酶	0.5
2X GC buffer I	25
		dNTP(1.0Mm)	10
forward primer(20μmol/L)	2
		reverse primer(20μmol/L)	2

cDNA	2
		灭菌三次蒸馏水	8.5
总体积	50

PCR反应循环参数为：94℃4min；94℃50s；58℃40s；72℃2min(35cycles)；72℃10min。

(5)PCR产物纯化回收：

取步骤(4)所得扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶120V电泳40min,EB染色后紫外线检测扩增片段，检测结果如图1所示。然后将扩增目的条带用干净刀片在紫外光下从琼脂糖中挖出，置于1.5mL离心管中，用北京全式金公司凝胶纯化试剂盒回收胶中的PCR产物。

(6)克隆测序：按照说明书，将回收的DNA片段克隆至Takara公司的pMD18-T载体，按照常规操作进行转化和菌落克隆的挑选，利用步骤(4)的PCR扩增体系对菌落进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小同预期，则为阳性克隆，然后送公司进行测序。测序结果与XM_003198707和XM_68740两克隆经过BLAST比对拼接，得到新的斑马鱼tmem132e cDNA序列。如SEQ ID NO.1所示。

本发明的有益效果：

(1)NCBI Genbank中已经有的两个斑马鱼tmem132e的mRNA序列,XM_003198707和XM_68740,其中XM_003198707序列为仅为tmem132e基因的部分mRNA序列，这两个序列都只是在斑马鱼基因组测序结果的基础上，通过计算机软件分析预测出的，并没有在实验室中加以验证。而我们的序列是在实验室中被测序验证过的，同时也在实验中得以应用而证实。

(2)通过本发明斑马鱼tmem132e基因的获得，可以根据基因序列人工合成或转基因生物合成具有生物活性的纯化蛋白或寡核苷酸，有助于我们了解斑马鱼tmem132e基因的基因组结构，分析该基因的表达和蛋白的功能。

附图说明

图1为实施例1PCR扩增产物凝胶电泳图；其中，Lane1为tmem132e的5’端PCR产物，Lane2为tmem132e的3’端PCR产物，M为DNA ladder；

图2为实施例2PCR扩增产物凝胶电泳图；其中，Lane1为tmem132e的5’端PCR产物，Lane2为tmem132e的3’端PCR产物，M为DNA ladder。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：斑马鱼tmem132e基因序列的克隆：

(1)提取斑马鱼幼体总RNA；

(2)引物设计

SEQ ID NO.35'ATGGGACATTTTGTTGTTCAAG3'

SEQ ID NO.45'TTGACTTGGTGCTGAGGAGATT 3'

SEQ ID NO.55'GACCCTCAACATCTATCTGCTC3'

SEQ ID NO.65'GGCTATTTCCTTTATCCTGCGC 3'

(3)cDNA合成

(4)PCR扩增

成分	体积(μl)
		LA Taq DNA聚合酶	0.5
2X GC buffer I	25
		dNTP(1.0Mm)	10
forward primer(20μmol/L)	2
		reverse primer(20μmol/L)	2
cDNA	2
		灭菌三次蒸馏水	8.5

总体积

50

(表中的forward primer是指序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示的引物；reverseprimer是指序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示的引物。)

(5)PCR产物纯化回收：

实施例2：斑马鱼tmem132e基因序列在制备玛琳代寡核苷酸中的应用

通过实施例1得到斑马鱼tmem132e基因组结构，明确了每个外显子和内含子的序列，进而设计出有效的玛琳代寡核苷酸，从而降低tmem132e基因在斑马鱼中的表达，建立tmem132e基因缺陷疾病斑马鱼模型，从而研究tmem132e基因突变导致的耳聋发病机制，以及用于治疗耳聋的药物研发。

经过比对得出，tmem132e基因有10个外显子，其中intron2/exon3接头序列如下所示：

attgttttgctctgtctaacatccaaaagagtccaggacaacaattctgagtgagtgcaa

atttgagaatgcctaacccactatgacctatcaattgttttctcagAACGGCCAGAGACA

GTGATGACGACGATGACGATGACCGCAAAGTGAGCCGGGGATGTACACTCCAGTACCAGA

GGGCCCAGATTAAGGTTTTGACCCAGTTCCACACAACTTCATCTGAAGGCACAAATCAGA

注：小写字体为intron2序列，大些字体为exon3序列。

在此序列基础上，我们委托GeneTools(Philomath,OR)公司设计合成了针对斑马鱼tmem132e基因intron2/exon3接头序列的玛琳代寡核苷酸，其序列如序列表中SEQ ID NO.7所示：

SEQ ID NO.7：5'-TTTTACCCTGTGAAAGAGACACAGT-3',

将合成的该寡核酸显微注射1或者2细胞生长期的斑马鱼，生长至48小时后，按照实施例1中的方法提取总RNA，反转录为cDNA，进行PCR扩增，PCR扩增所用引物如序列表中SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，PCR体系同实施例1，琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2所示。注射特异玛琳代寡核苷酸的斑马鱼中exon3被去除，PCR产物大小为532bp；对照组中exon3没有被去除，PCR产物大小为674bp.从而我们得到了有效的玛琳代寡核苷酸。

SEQ ID NO.85'-GACCCTCAACATCTATCTGCTC-3'

SEQ ID NO.95'-ACTTTAAGGGGCAGTTTGGGCA-3'。

Claims

1.一种斑马鱼tmem132e基因，其特征在于，DNA全长为3222bp，包含3219bp的开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种由权利要求1所述的斑马鱼tmem132e基因所编码的蛋白质分子，其特征在于，具有1073个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种用于获取权利要求1所述的斑马鱼tmem132e基因的引物序列，其特征在于，包括用于扩增该斑马鱼tmem132e基因5’端的引物序列和扩增该斑马鱼tmem132e基因3’端的引物序列。

4.如权利要求3所述的用于获取权利要求1所述的斑马鱼tmem132e基因的引物序列，其特征在于，所述用于扩增该斑马鱼tmem132e基因5’端的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示，扩增出的片段长度为1042bp。

5.如权利要求3所述的用于获取权利要求1所述的斑马鱼tmem132e基因的引物序列，其特征在于，所述用于扩增该斑马鱼tmem132e基因3’端的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示，扩增出的片段长度为2280bp。

6.权利要求1所述的斑马鱼tmem132e基因序列的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取斑马鱼幼体总RNA；

(2)引物设计：分别设计用于扩增斑马鱼tmem132e基因cDNA的5’端和3’端的引物，其中，用于扩增斑马鱼tmem132e基因5’端的引物序列如序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；用于扩增斑马鱼tmem132e基因3’端的引物序列如序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

(3)cDNA合成：以步骤(1)提取的斑马鱼幼体总RNA为模板，以Oligo(dT)18为引物，反转录合成cDNA；

(4)PCR扩增：用步骤(3)的反转录产物做模板，PCR扩增tmem132e的5’端和3’端，PCR反应中的DNA聚合酶为LA Taq DNA聚合酶；

(5)PCR产物纯化回收：取步骤(4)所得扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增目的条带从琼脂糖中取出，回收胶中的PCR产物；

(6)克隆测序：将步骤(5)回收的DNA片段克隆至pMD18-T载体，进行转化和菌落克隆的挑选，利用步骤(4)的PCR扩增体系对菌落进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物大小同预期，则为阳性克隆，进行测序，测序结果与XM_003198707和XM_68740两克隆经过BLAST比对拼接，得到斑马鱼tmem132e cDNA序列。

7.如权利要求6所述的斑马鱼tmem132e基因序列的克隆方法，其特征在于，步骤(4)中，PCR扩增条件为：94℃4min；94℃50s；58℃40s；72℃2min，35cycles；72℃10min。

8.权利要求1所述的斑马鱼tmem132e基因在制备玛琳代寡核苷酸中的应用。