CN104817538A - 去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂及其药物用途 - Google Patents

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CN104817538A CN201510113249.8A CN201510113249A CN104817538A CN 104817538 A CN104817538 A CN 104817538A CN 201510113249 A CN201510113249 A CN 201510113249A CN 104817538 A CN104817538 A CN 104817538A
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吉民
杨悦
蔡进
张入仁
陈峻青
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Southeast University
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

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Abstract

本发明提供的去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂，其结构式如式I所示。本发明还提供了一种上述去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂的制备方法及其在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用。本发明将去铁斯诺和他克林通过不同长度的碳链连接到一起，保留去铁斯诺的金属螯合特性以及抗氧化特性，连接的他克林母体保留原有的乙酰胆碱酯酶抑制活性，得到了一类具有多功能，作用于多靶点的新型铁鳌合剂。

Description

去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂及其药物用途
技术领域
本发明属于医药化工领域，具体涉及一类去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂及其药物用途。
背景技术
最新人口普查表明，现如今，我国60岁以上的老年人口为1.3亿，我国已经提前进入老龄化社会，而阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease,AD)和帕金森氏病(Parkinson’s Disease,PD)的患病人数已达1500万以上。到2050年，我国老年人口将达到4.39亿，占总人口的1/4。人口老龄化和神经退行性疾病给社会、家庭和医学界造成巨大的压力和挑战。目前，AD是一种常见的但不可治愈的神经退行性疾病，在老年人中占有相当大的比例。在65岁以上的人群中，AD的发病率为5％；80岁以上的人群中，发病率为20％[Bloodsworth A.,O'Donnell V.B.,and Freeman B.A.Arterioscl.Throm.Vas.2000,20(7):1707-1715.]。在全球所有的致死疾病中，AD排在冠心病、癌症和中风之后，居第四位。因此，对AD的相关研究是很紧迫和必须的。
在过去的几十年中，围绕AD的发病机制，产生了各种的假说，例如：乙酰胆碱能异常假说，淀粉样蛋白的沉积假说，氧化应激假说，金属离子稳态失衡假说等等。如今，对于AD的治疗主要集中在提高患者体内乙酰胆碱酯酶(AChE)的水平上。在FDA已经批准的5个治疗AD的药物中，有4个是乙酰胆碱酯酶抑制剂(AchEi)。他们是他克林、多奈哌齐、加兰他敏和卡巴拉丁[Di Stefano A,Iannitelli A,Laserra S,et al.Expert opinion on drug delivery,2011,8(5):581-603.]。这足以证明，乙酰胆碱酯酶抑制剂在AD治疗方面取得了巨大的成功。其他的治疗药物有，钙离子拮抗剂尼莫地平；改善脑组织代谢药物脑复康；雌激素替代疗法等等。然而，在对多奈哌齐后续的临床研究中逐渐的发现，乙酰胆碱酯酶抑制剂并不是十分有效。另外，如今针对AD的治疗药物，只能对患者的症状进行暂时的缓解，并不能阻止或者逆转其疾病的发展。
富集在脑内神经组织的金属有铁，铜，锌等，人体对这些金属的储存，循环和使用有严格的控制机制。当这个机制被打破，体内蛋白质中金属含量过多时，就对细胞毒性反应提供了可能性。例如，具有氧化还原活性的铁离子和铜离子能够促进具有细胞毒性的羟基自由基的生成，并氧化生物分子导致细胞死亡[杰华.药学学报，2009，44(3)： 258-263.]。即使在没有氧化还原活性的情况下，Zn2+和Cu2+也能导致蛋白质的聚集。金属导致的损伤包括氧化应激和蛋白质折叠，这些都与神经退行性疾病的发生有关。
使用小分子金属螯合剂来抑制金属导致的损伤，治疗金属过载有关的疾病具有很大的前景。一般的金属过载疾病中，靶向金属量大而且容易被清除，而在神经退行性疾病中，金属离子与其不同。同时，我们现有的对中枢神经系统中金属内稳态有限的了解使得设计靶向作用于失衡金属的螯合剂具有很大的挑战[Madsen E,Gitlin J D.Annu.Rev.Neurosci.,2007,30:317-337]。一般的金属螯合剂能够保护细胞免受氧化应激反应的损伤，抑制蛋白质聚集。但是使用此种金属螯合剂进行长期治疗具有危险性，例如正常的金属离子会损耗和再分配，酶活性会受到抑制，也许还会有其他不可预估的后果。因此，设计和研究新型的多功能铁鳌合剂是目前药物化学研究所需要迫切解决的问题之一。
发明内容
发明目的：本发明的目的是在去铁斯诺(Deferasirox)的结构基础上通过不同长度的碳链连接乙酰胆碱酯酶抑制剂他克林(Tacrine)，提供了一类新型金属离子螯合剂，在保留去铁斯诺金属螯合能力和他克林抑制乙酰胆碱酯酶活性的基础上，得到了一类作用于多靶点的新型金属离子螯合剂。
技术方案：本发明提供的去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂，其结构式如式I所示：
其中，n为4至8中任意的自然数。
本发明还提供了一种上述去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)邻氨基苯甲酸和环己酮加入三氯氧磷中，回流反应，得到化合物3；
(2)将化合物3与4-8个碳原子的烷基二胺反应，得到化合物4；
(3)在缩合剂存在下，化合物4与去铁斯诺反应即得；
其中，化合物3的结构式为： 
其中，化合物4的结构式为： 
其合成路线如下：
其中，步骤(1)中，反应时间为2-4h；邻氨基苯甲酸、环己酮、三氯氧磷的摩尔比为1:1:(3-5)。
其中，步骤(2)中，所述4-8个碳原子的烷基二胺包括1，4-丁二胺、1,5-戊二胺、1，6-己二胺、1,7-庚二胺和1,8-辛二胺。
其中，步骤(2)中，化合物3与4-8个碳原子的烷基二胺的摩尔比为1:(4-5)，反应温度为140-160℃，反应时间为24-36h。
其中，步骤(3)中，缩合剂为EDCI和HOBT的组合；去铁斯诺、化合物4、EDCI和HOBT的摩尔比为1:(2-3):(1-2):(1-2)。
本发明还提供了上述去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用。
有益效果：本发明将去铁斯诺和他克林通过不同长度的碳链连接到一起，保留去铁 斯诺的金属螯合特性以及抗氧化特性，连接的他克林母体保留原有的乙酰胆碱酯酶抑制活性，得到了一类具有多功能，作用于多靶点的新型铁鳌合剂。尽管阿尔茨海默症发病机制的复杂性以及多样性，然而制得的去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂能够有效地克服原有抗阿尔茨海默症药物作用于单一靶点的缺陷，提高了药物的利用效率和治疗效果。
PC12细胞细胞存活率测定药理实验的结果表明：本发明的去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂均有强度不等的神经保护作用，其中TDe的活性最强。
乙酰胆碱酯酶抑制活性测定药理实验的结果表明：去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂具有强度不等的乙酰胆碱酯酶抑制活性，其中TDd的活性最强。
金属离子螯合能力活性测定药理实验的结果表明：去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂对Fe3+，Cu2+皆具有良好的金属螯合能力。
附图说明
图1为去铁斯诺螯合金属离子的紫外吸收曲线。其中，Def指向的曲线代表去铁斯诺甲醇溶液的紫外吸收曲线，Def+Fecl3指向的曲线代表在去铁斯诺甲醇溶液中加入FeCl3的甲醇溶液后的紫外吸收曲线，Def+CuCl2指向的曲线代表在去铁斯诺甲醇溶液中加入CuCl2的甲醇溶液后紫外吸收曲线。
图2为他克林螯合金属离子的紫外吸收曲线。其中，tacrine+CuCl2指向的曲线代表他克林甲醇溶液的紫外吸收曲线，tacrine指向的曲线代表在他克林甲醇溶液中加入FeCl3的甲醇溶液后的紫外吸收曲线，tacrine+Fecl3指向的曲线代表在他克林甲醇溶液中加入CuCl2的甲醇溶液后紫外吸收曲线。
图3为化合物TDc螯合金属离子的紫外吸收曲线。其中，TD+CuCl2指向的曲线代表TDc甲醇溶液的紫外吸收曲线，TD指向的曲线代表在TDc甲醇溶液中加入FeCl3的甲醇溶液后的紫外吸收曲线，TD+Fecl3指向的曲线代表在TDc甲醇溶液中加入CuCl2的甲醇溶液后紫外吸收曲线。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体工艺步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是 为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
熔点在电热熔点管或b型熔点管上测定，温度计未经校正；薄层层析(TLC)采用硅胶GF-254(青岛海洋化工厂生产)；紫外灯(λ：254nm)显色；柱层析采用100～200目柱层析硅胶(青岛海洋化工厂生产)，1H-NMR用ACFx300Q Buker核磁共振仪测定；MS用Nicolet2000型傅立叶变换质谱仪测定。
实施例1-1 9-氯-1,2,3,4-四氢吖啶(化合物3)的制备
将邻氨基苯甲酸(3.2g,23mmol)和环己酮(2.26mL，23mmol)放在冰浴中，用恒压滴液漏斗缓慢滴加69mmol POCl3到上述混合物中，边加边搅拌。滴加完毕后，撤去冰浴，将上述溶液加热至回流，反应3h，然后冷却至室温，减压蒸馏去除未反应的POCl3，剩余物用乙酸乙酯稀释，无水碳酸钾中和，盐水洗涤(3*100mL)。有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干，柱层析得浅黄色固体3为4.6g，产率91％。Mp 67–69℃。
实施例1-2 9-氯-1,2,3,4-四氢吖啶(化合物3)的制备
将邻氨基苯甲酸(3.2g,23mmol)和环己酮(2.26mL，23mmol)放在冰浴中，用恒压滴液漏斗缓慢滴加92mmol POCl3到上述混合物中，边加边搅拌。滴加完毕后，撤去冰浴，将上述溶液加热至回流，反应2h，然后冷却至室温，减压蒸馏去除未反应的POCl3，剩余物用乙酸乙酯稀释，无水碳酸钾中和，盐水洗涤(3*100mL)。有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干，柱层析得浅黄色固体3。Mp 67–69℃。
实施例1-3 9-氯-1,2,3,4-四氢吖啶(化合物3)的制备
将邻氨基苯甲酸(3.2g,23mmol)和环己酮(2.26mL，23mmol)放在冰浴中，用恒压滴液漏斗缓慢滴加115mmol POCl3到上述混合物中，边加边搅拌。滴加完毕后，撤去冰浴，将上述溶液加热至回流，反应4h，然后冷却至室温，减压蒸馏去除未反应的POCl3，剩余物用乙酸乙酯稀释，无水碳酸钾中和，盐水洗涤(3*100mL)。有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干，柱层析得浅黄色固体。Mp 67–69℃。
实施例2 N1-(1,2,3,4-四氢-9-基)丁烷-1,4-二胺(化合物4a)的制备
化合物3(1.0g,4.61mmol)，1,4-丁二胺(1.80g,13.83mmol)溶于5mL正戊醇中，溶解后，加热到160℃回流，反应36h。冷却至室温，反应液用50mL二氯甲烷稀释，用50mL 10％的NaOH溶液洗涤一次，后用清水洗涤(2×40mL)。有机层用无水硫酸 镁干燥，蒸干，柱层析得到深棕色油状物4a 1.02g,产率71％。
实施例3 4-(3,5-双(2-羟基苯基)-1H-1,2,4-三唑-1-基)-N-(4-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基氨基)丁基)苯甲酰胺(化合物TDa)的制备
将去铁斯诺(0.373g，1mmol)溶于无水二氯甲烷，加入少量DMF助溶，待全部溶解后，将溶液置于冰浴中，缓慢滴加HOBT(0.2g，1.5mmol)，EDCI(0.29g，1.5mmol)，冰浴下反应1h，将化合物4a(0.41g 1.5mmol)溶于无水二氯甲烷，用恒压滴液漏斗缓慢滴加进上述溶液中，20min内滴加完毕。然后再室温下反应6h。待反应结束后，用二氯甲烷稀释，用清水和饱和食盐水各洗涤三次，有机层用无水Na2SO4干燥，蒸干，柱层析得到淡黄色固体TDa 0.21g，产率33.65％。mp:146-148℃。
实施例4 N1-(1,2,3,4-四氢-9-基)戊烷-1,5-二胺(化合物4b)的制备
化合物34.61mmol，1,5-戊二胺18.44mmol溶于5mL正戊醇中，溶解后，加热到140℃回流，反应30h。冷却至室温，反应液用50mL二氯甲烷稀释，用50mL 10％的NaOH溶液洗涤一次，后用清水洗涤(2×40mL)。有机层用无水硫酸镁干燥，蒸干，柱层析得到深棕色油状物4b 0.34g。
实施例5 4-(3,5-双(2-羟基苯基)-1H-1,2,4-三唑-1-基)-N-(5-((1,2,3,4-四氢-9-氨基)戊基)苯甲酰胺(化合物TDb)的制备
将去铁斯诺1mmol溶于无水二氯甲烷，加入少量DMF助溶，待全部溶解后，将溶液置于冰浴中，缓慢滴加HOBT 1mmol，EDCI 2mmol，冰浴下反应1h，将化合物4a1mmol溶于无水二氯甲烷，用恒压滴液漏斗缓慢滴加进上述溶液中，20min内滴加完毕。然后再室温下反应4h。待反应结束后，用二氯甲烷稀释，用清水和饱和食盐水各洗涤三次，有机层用无水Na2SO4干燥，蒸干，柱层析得到淡黄色固体TDb0.38g。
1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:1.05(t,J＝5.73Hz,2H)，1.59(t,J＝8.94Hz,4H),2.71(d,J＝5.73Hz,2H),2.88(d,J＝5.19Hz,2H),3.22-3.28(m,2H),3.46-3.52(m,2H),5.75(s,1H),6.88(d,J＝8.22Hz,1H),6.95-7.04(m,3H),7.35(t,J＝7.95Hz,3H),7.49-7.57(m,4H),7.70(d,J＝8.34Hz,1H),7.84(d,J＝8.43Hz,2H),8.05(d,J＝7.47Hz,1H),8.14(d,J＝8.58Hz,2H),8.50(t,J＝5.04,1H),10.20(s,1H),10.79(s,1H) 
TOF-MS m/z：625[M+H]+。
实施例6 N1-(1,2,3,4-四氢-9-基)己烷-1,6-二胺(化合物4c)的制备
化合物34.61mmol，1，6-己二胺23.05mmol溶于5mL正戊醇中，溶解后，加热到150℃回流，反应24h。冷却至室温，反应液用50mL二氯甲烷稀释，用50mL 10％的NaOH溶液洗涤一次，后用清水洗涤(2×40mL)。有机层用无水硫酸镁干燥，蒸干，柱层析得到深棕色油状物4c 0.45g。
实施例7 4-(3,5-双(2-羟基苯基)-1H-1,2,4-三唑-1-基)-N-(5-((1,2,3,4-四氢-9-氨基)己基)苯甲酰胺(化合物TDc)的制备
将去铁斯诺1mmol溶于无水二氯甲烷，加入少量DMF助溶，待全部溶解后，将溶液置于冰浴中，缓慢滴加HOBT 2mmol，EDCI 1mmol，冰浴下反应1h，将化合物4a2mmol溶于无水二氯甲烷，用恒压滴液漏斗缓慢滴加进上述溶液中，20min内滴加完毕。然后再室温下反应8h。待反应结束后，用二氯甲烷稀释，用清水和饱和食盐水各洗涤三次，有机层用无水Na2SO4干燥，蒸干，柱层析得到淡黄色固体TDc0.33g。
1H NMR(CDCl3,300MHz)δ:0.83-0.89(m,3H),1.43(s,5H),1.88(s,4H),2.67(s,2H),2.98(s,2H),3.44-3.52(m,4H),4.13(s,1H),6.40(s,1H),6.69(t,J＝7.53Hz,1H),6.99-7.09(m,4H),7.30-7.39(m,3H),7.49-7.56(m,3H),7.83-7.97(m,4H),8.13(d,J＝7.62Hz,1H)
TOF-MS m/z:653[M+H]+。
实施例8 N1-(1,2,3,4-四氢-9-基)庚烷-1,7-二胺(化合物4d)的制备
与实施例2基本相同，不同之处仅在于：采用1,7-庚二胺代替1，4-丁二胺，得化合物4d 1.02g。
实施例9 4-(3,5-双(2-羟基苯基)-1H-1,2,4-三唑-1-基)-N-(5-((1,2,3,4-四氢-9-氨基)庚基)苯甲酰胺(化合物TDd)的制备
与实施例3基本相同，不同之处仅在于：采用化合物4d代替化合物4a，得化合物TDd 0.33g。
1H NMR(CDCl3,300MHz)δ:1.26-1.36(m,6H),1.56-1.64(m,4H),1.89(s,4H),2.69(s,4H),2.99(s,2H),3.40-3.51(m,4H),4.00(s,1H),6.35(s,1H),6.70(t,J＝7.65Hz,1H),7.00-7.08(m,4H),7.29-7.39(m,3H),7.49-7.59(m,3H),7.80(d,J＝8.10Hz,1H),7.94(t,J＝8.10Hz,3H),8.14(d,J＝7.74Hz,1H)
TOF-MS m/z:667[M+H]+。
实施例10 N1-(1,2,3,4-四氢-9-基)辛烷-1,8-二胺(化合物4e)的制备
与实施例2基本相同，不同之处仅在于：采用1,8-辛二胺代替1，4-丁二胺，得化合物4e 1.26g。
实施例11 4-(3,5-双(2-羟基苯基)-1H-1,2,4-三唑-1-基)-N-(5-((1,2,3,4-四氢-9-氨基)辛基)苯甲酰胺(化合物TDe)的制备
与实施例3基本相同，不同之处仅在于：采用化合物4d代替化合物4a，得化合物TDe 0.41g。
1H NMR(CDCl3,300MHz)δ:1.06(t,J＝7.11Hz,6H),1.57-1.66(m,5H),1.89(s,4H),2.54-2.61(m,3H),2.69(s,2H),3.00(s,2H),3.43-3.50(m,4H),4.02(s,1H),6.39(s,1H),6.70(t,J＝7.59Hz,1H),7.00-7.08(m,4H),7.33-7.7.39(m,3H),7.49-7.59(m,3H),7.80(d,J＝8.34Hz,1H),7.94(d,J＝8.07Hz,3H),8.14(d,J＝7.65Hz,1H)
TOF-MS m/z:681[M+H]+。
实施例12 PC12细胞体外活性的测定
材料与方法：药物、细胞
实验药：去铁斯诺Deferasirox(Def)、他克林TACRINE(Tac)和TDa-e系列化合物
细胞：PC12细胞(来自中科院上海细胞库)
细胞选择和培养
1.打开紫外照射超净台30分钟左右，关闭紫外灯，开风机以及照明灯。
2、从液氮罐中取出冻存好的高分化的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞冻存管立即放入准备好的37℃的温水中，并不时地摇动使其完全融化。
3、然后移至超净台中进行操作，用吸管吸除解冻后的细胞悬液，加入到离心管中，并用一定量的培养基冲洗冻存管后加到离心管中，低速离心4分钟左右，转速800rpm.
4、用吸管吸走上清液，再加一定量的培养基，震荡使得细胞均匀悬浮，并转移至培养瓶中，在37℃的CO2培养箱中孵育。
药物的MTT试验方法
(1)待上述细胞生长到80-90％时，在超净台下用一次性塑料吸管吸走原来的培养液，用PBS冲洗去残留培养基，使用胰酶将PC12细胞从细胞培养瓶中消化下来，然后加入新的培养液稀释并使细胞悬浮在培养液中。
(2)重新调整PC12细胞细胞悬浮液浓度，使细胞浓度至5×104个/mL左右。
(3)在96孔板中加入上述计数好的PC12细胞，每孔精确在100μl。
(4)将上述加入细胞的96孔板放在5％的CO2培养箱中在37℃条件下孵育24小时，然后吸出培养基，加入溶有浓度梯度药物的培养基，每孔100μl。
(5)5％CO2，37℃孵育3小时后，在需要加入H2O2的孔中加入适量的H2O2。24小时后倒置显微镜下观察，并进行下面操作。
(6)每孔加入50μl 1×MTT溶液，继续培养4h。
(7)终止培养，小心吸去孔内培养液。
(8)每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。
(9)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)
所有实验数据均经统计处理，实验结果如表1所示，由于化合物TDa在DMSO中溶解度较小，因此没有其进行细胞实验。结果表明本发明所述去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂均有强度不等的抗氧化活性，表现出了不同程度的神经保护作用。其中TDe表现出最小的细胞毒性和最强的抗氧化活性，具有最好的神经保护作用。
表1.化合物与细胞作用24h细胞存活率(％)
实施例13牛乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定
材料与方法： 
实验药：本发明所述去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂
试剂盒：牛乙酰胆碱酯酶试剂盒(南京森倍伽生物科技有限公司)
样本处理及要求：
血浆：应根据标本的要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形 成，应该再次离心。
操作步骤
1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为120U/L,80U/L,40U/L,20U/L,10U/L)。
2.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
所有实验数据均经统计处理。实验结果如表2所示，结果表明所有去铁斯诺-他克林 金属离子鳌合剂都具有乙酰胆碱酯酶抑制活性。其中化合物TDa和化合物TDc的活性比对照组Tac的活性要好。
表2.化合物抑制牛乙酰胆碱酯酶活性数据(IC50μM)
实施例14金属螯合能力 
材料与方法 
实验药：本发明所述去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂
试剂：FeCl3甲醇溶液和CuCl2甲醇溶液
操作步骤： 
(1)将化合物Def、Tac和化合物TDc溶于甲醇溶液中，配成浓度为1mg/mL的溶液(母液)。测其紫外吸收。
(2)将FeCl3和CuCl2的甲醇溶液加入到上述溶液中，分别观察其紫外吸收的变化。
(3)每隔10min观察一次紫外吸收的变化情况，记录螯合剂对金属的螯合所需的时间。
所有实验数据均经过处理。实验结果如图1至3所示，在加入FeCl3和CuCl2后，最大吸收波长均发生了改变，结果表明去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂对Fe3+和Cu2+均与较好的螯合能力，并且在加入金属离子后，螯合物立即形成，速度十分迅速。

Claims (7)

1.去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂，其结构式如式I所示：
其中，n为4至8中任意的自然数。
2.一种权利要求1所述的去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)邻氨基苯甲酸和环己酮加入三氯氧磷中，回流反应，得到化合物3；
(2)将化合物3与4-8个碳原子的烷基二胺反应，得到化合物4；
(3)在缩合剂存在下，化合物4与去铁斯诺反应即得；
其中，化合物3的结构式为：
其中，化合物4的结构式为：
3.根据权利要求2所述的一种去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，反应时间为2-4h；邻氨基苯甲酸、环己酮、三氯氧磷的摩尔比为1:1:(3-5)。
4.根据权利要求2所述的一种去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述4-8个碳原子的烷基二胺包括1，4-丁二胺、1,5-戊二胺、1，6-己二胺、1,7-庚二胺和1,8-辛二胺。
5.根据权利要求2所述的一种去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，化合物3与4-8个碳原子的烷基二胺的摩尔比为1:(3-5)，反应温度为140-160℃，反应时间为24-36h。
6.根据权利要求2所述的一种去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，缩合剂为EDCI和HOBT的组合；去铁斯诺、化合物4、EDCI和 HOBT的摩尔比为1:(1-2):(1-2):(1-2)；反应温度为室温，反应时间为4-8h。
7.权利要求1所述的去铁斯诺-他克林金属离子鳌合剂在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用。
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