CN104817489B - 一种具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物及其制备方法和应用，该化合物的结构式为其中R1为吲哚、五元杂环或六元杂环，R2为三氟甲基或三氟甲氧基，R3为叔胺片段。通过五个步骤的有机合成反应即可制得该化合物，具有反应过程操作简单、原料易得、反应条件温和、所用试剂便宜等优点，适于制药企业的大规模生产制造。该化合物对VEGFR‑2激酶有很好的抑制活性，并且能够抑制肿瘤细胞的增殖活性，可用于抗肿瘤药物及抑制VEGFR‑2激酶活性药物的制备，具有良好的应用前景和科研价值。

Description

一种具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，涉及一种抗肿瘤的化合物，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一，极大地危害人类的健康，并将成为新世纪人类的第一杀手。恶性肿瘤已不再只是发达工业国家的严重疾病，发展中国家面临着更大的疾病负担。
化学药物治疗作为治疗肿瘤的重要手段之一，在近三十年已经有了巨大的发展和进步，得到了一大批具有不同作用机制的临床抗肿瘤药物。但是抗肿瘤药也存在许多不良反应，比如脱发，呕吐，产生骨髓抑制，快速产生耐药性等等，这些都导致化学药物无法达到预期的治疗效果。因此新的抗肿瘤药物的研究与开发是目前药学领域的热点和难点问题之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物及其制备方法和应用，该化合物在体外体现出很好的抗肿瘤活性，能够应用于抗肿瘤药物的制备。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物，其化学结构式如下：
其中，R1为吲哚、五元杂环或六元杂环，R2为三氟甲基或三氟甲氧基，R3为叔胺片段。
所述的R1为3-吡啶、2-甲氧基-5-嘧啶、4-吡唑、1-甲基-4-吡唑、5-嘧啶或5-吲哚。
所述的R2为2-三氟甲氧基或3-三氟甲基。
所述的R3为二甲氨基、二乙氨基、二异丙氨基或吗啉基。
具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)3-氨基-4-甲氧基苯甲酸与BOC酸酐反应，得到3-((叔丁氧羰基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸；
2)将3-((叔丁氧羰基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸与醇胺片段缩合成酯，得到含有叔胺片段的酯类化合物；
3)用三氟乙酸将含有叔胺片段的酯类化合物中的叔丁氧羰基脱去，生成含有苯胺片段的酯类化合物；
4)将3-三氟甲基-5-溴苯胺或2-三氟甲氧基-5-溴苯胺与三光气形成异氰酸酯，再与含有苯胺片段的酯类化合物缩合，形成脲类化合物；
5)在四(三苯基膦)钯催化下，将脲类化合物与含有杂环的苯硼酸通过Suzuki反应，生成具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物。
具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物在制备抑制VEGFR-2激酶活性药物中的应用。
具有抗肿瘤活性的杂环苯脲芳基联类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的抗肿瘤药物是以VEGFR-2激酶为靶点的药物，包括抗肺癌、抗肝癌、抗胃癌、抗白血病、抗神经癌、抗结肠癌、抗乳腺癌、抗宫颈癌和抗胰腺癌的药物。
所述的抗肿瘤药物为抑制肿瘤细胞增殖活性的药物。
所述的抗肿瘤药物为抑制肺癌细胞A549和肝癌细胞SMCC-7721增殖活性的药物。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供的具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物，是一种经化学合成得到的新型的具有抗肿瘤活性的化合物，其对VEGFR-2激酶有很好的抑制活性，并且能够抑制肿瘤细胞的增殖活性。科学研究已发现血管的生成与肿瘤的发生、发展和迁移都有密切关系，抑制新生血管的形成可以有效的抑制肿瘤的生长和迁移，许多生长因子都参与调控新生血管的生成，其中VEGFR-2是已知的最强的正调控因子。本发明提供的具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物通过抑制VEGFR-2激酶的活性，阻断其诱导的信号通路，从而能够抑制肿瘤细胞的增生和迁移，因此本发明提供的具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物可用于抗肿瘤药物及抑制VEGFR-2激酶活性药物的制备，具有良好的应用前景和科研价值。
本发明提供的具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物的制备方法，通过五个步骤的常规有机合成反应即可制得目标化合物，具有反应过程操作简单、原料易得、反应条件温和、所用试剂便宜等优点，适于制药企业的大规模生产制造。
另外，本发明提供的具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物，能够对包括人非小细胞肺癌细胞(A549)和肝癌细胞(SMCC-7721)在内的肿瘤细胞抑制其细胞增殖活性，可应用于抗肿瘤药物的制备。
附图说明
图1为具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物的合成路线图；
其中，化合物1为3-氨基-4-甲氧基苯甲酸；化合物2为3-((叔丁氧羰基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸；化合物3为含有不同叔胺片段的酯类化合物；化合物4为含有苯胺片段的酯类化合物；化合物为5为脲类化合物；化合物6为具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物；
图1中的标注具体为：a：(BOC)2O，NaOH(1mol/L)，回流；b：HoBt，DCC，DMAP，回流；c：TFA，DCM；d：BTC，Et3N，DCM；e：BO2(CH)2(CH3)4，Pd(pddf)Cl2，Na2CO3，H2O，dioxane。
具体实施方式
本发明提供一种具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物，该杂环联苯芳基脲类化合物在体外体现出抗肿瘤活性，能够应用于抗肿瘤药物的制备。
下面结合附图和实施例对本发明做详细的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明提供的具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物，其化学结构式为：
其中，R1为吲哚、五元杂环或六元杂环，R2为三氟甲基或三氟甲氧基，R3位叔胺片段。
具体的：R1为3-吡啶、2-甲氧基-5-嘧啶、4-吡唑、1-甲基-4-吡唑、5-嘧啶或5-吲哚；R2为2-OCF3或3-CF3；R3为二甲氨基、二乙胺基、二异丙胺基或吗啉基。
下面结合图1中所示的合成路线和具体的合成实例来详细说明本发明的具有抗肿瘤活性的候选药物杂环联苯芳基脲类化合物的制备方法及其活性筛选方法。
实施例1
化合物的结构式中，R1为3-吡啶，R2为3-三氟甲基，R3为二甲氨基，通过以下步骤制备(参见图1)：
1)3-氨基-4-甲氧基苯甲酸(化合物1)与BOC酸酐反应得到3-((叔丁氧羰基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸(化合物2)；
用180ml氢氧化钠溶液溶解3-氨基-4-甲氧基苯甲酸(化合物1)20g，加入150ml四氢呋喃，冰浴中滴加BOC酸酐(104,4g)的四氢呋喃(70ml)溶液，滴加完毕后撤去冰浴，室温搅拌5小时。搅拌完毕后真空旋出四氢呋喃，加入80ml乙酸乙酯，水相用盐酸酸化至pH至4～5,用80ml乙酸乙酯提取，合并有机相后用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。旋干液体后得到灰白色固体3-((叔丁氧羰基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸(化合物2)20.78g，产率65％；
2)将3-((叔丁氧羰基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸(化合物2)与N，N-二甲基乙醇胺缩合成酯，得到2-(二甲氨基)乙基-3-((叔丁氧羰基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸(化合物3)
用50ml无水四氢呋喃溶解8g 3-((叔丁氧羰基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸(化合物2)，加入4.55g HoBt，冰浴搅拌滴加DCC(11.63g)的四氢呋喃(20ml)溶液滴加完毕后撤去冰浴搅拌，取N，N-二甲基乙醇胺13.3g，加入0.2g DMAP，用30ml四氢呋喃溶解，滴加到上述反应液中，30℃油浴锅搅拌17小时。搅拌完毕后抽滤，滤除DCU，蒸出四氢呋喃，加入80ml乙酸乙酯，分别用水、饱和碳酸钠、饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋干后得到黄色油状物2-(二甲氨基)乙基-3-((叔丁氧羰基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸(化合物3)6.1g，产率：60％；
3)2-(二甲氨基)乙基-3-((叔丁氧羰基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸(化合物3)脱BOC生成2-(二甲氨基)乙基-3-氨基-4-甲氧基苯甲酸(化合物4)
干燥的100ml二氯甲烷溶解2-(二甲氨基)乙基-3-((叔丁氧羰基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸(化合物3)6g，滴加24ml三氟乙酸，室温搅拌半小时，搅拌完毕后用碳酸氢钠溶液调节至碱性，水相用30ml二氯甲烷萃取3遍，合并有机相，用饱和碳酸氢钠、水洗一遍，无水硫酸钠干燥，旋干后得到黄色油状物2-(二甲氨基)乙基-3-氨基-4-甲氧基苯甲酸(化合物4)3.1g，产率：74％；
4)2-(二甲氨基)乙基-3-氨基-4-甲氧基苯甲酸(化合物4)与3-三氟甲基-5-溴苯胺通过缩合反应制备化合物2-(二甲氨基)乙基-3-(3-(3-溴-5-(三氟甲基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)
在冰浴条件下，用20mL重蒸二氯甲烷将0.74g(2.5mmol)双(三氯甲基)碳酸酯(BTC)溶解并搅拌5min，再缓慢滴加1.66g(6.9mmol)3-三氟甲基-5-溴苯胺的二氯甲烷溶液，滴加完毕搅拌15min，向浑浊液中继续滴加0.75mL(5.5mmol)三乙胺的二氯甲烷溶液10mL，滴加完毕后继续搅拌15min，然后向反应溶液中滴加1.50g(6.3mmol)2-(二甲氨基)乙基-3-氨基-4-甲氧基苯甲酸和0.75mL(5.5mmol)三乙胺的二氯甲烷溶液10mL，滴加完毕后继续搅拌20min，将反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干得到红色油状物，用层析柱分离得到暗白色固体2-(二甲氨基)乙基-3-(3-(3-溴-5-(三氟甲基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)1.36g，产率43％
5)2-(二甲氨基)乙基-3-(3-(3-溴-5-(三氟甲基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)与3-吡啶硼酸通过Suzuki偶联反应制备化合物2-(二甲氨基)乙基-4-甲氧基-3-((3-吡啶-3-基-5-(三氟甲基)苯基)脲)苯甲酸(化合物6)
将2-(二甲氨基)乙基-3-(3-(3-溴-5-(三氟甲基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)0.6g(1.2mmol)、3-吡啶硼酸0.3g(2.4mmol)、碳酸钾0.4g(2.9mmol)、四(三苯基膦)钯0.2g(0.17mmol)溶于20mL 1,4-二氧六环和5ml水中，在氮气保护下于100℃反应过夜。冷却至室温，抽滤，1,4-二氧六环洗涤滤饼，收集滤液，旋干得黑色残留物，经过层析柱分离(洗脱溶剂按二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到白色固体(化合物6)0.33g，产率58％；
所得化合物的结构如下式所示：
理化性质：mp:115～117℃,MS(ESI)[M-H]+:m/z＝501.30
氢谱核磁共振数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.88(s,1H),8.94(d,J＝2.3Hz,1H),8.80(d,J＝2.1Hz,1H),8.66(dd,J＝4.8,1.5Hz,1H),8.52(s,1H),8.17-8.14(m,1H),8.03(s,1H),7.86(s,1H),7.66(dd,J＝8.5,2.1Hz,2H),7.57-7.54(m,1H),7.18(d,J＝8.7Hz,1H),4.35(t,J＝5.8Hz,2H),3.99(s,3H),2.63(t,J＝5.8Hz,2H),2.24(s,6H).
实施例2
该化合物的结构式中，R1为5-吲哚，R2为2-OCF3，R3为二乙氨基。
步骤1)～4)与实施例1中步骤1)～4)相同，只是步骤2)中将原料N，N-二甲基乙醇胺替换成N，N-二乙基乙醇胺，步骤4)中将原料3-三氟甲基-5-溴苯胺替换为2-三氟甲氧基-5-溴苯胺，即由起始化合物3-氨基-4-甲氧基苯甲酸(化合物1)制备得到化合物2-(二乙氨基)乙基-3-(3-(3-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)。
5)将2-(二乙氨基)乙基-3-(3-(3-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)与5-溴吲哚通过Suzuki偶联反应制备化合物2-(二乙氨基)乙基-3-((5-(1H-吲哚-5-基)-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物6)，具体操作步骤为：
将5-溴吲哚1.5g(7.6mmol)溶于20mL 1,4-二氧六环中，加入联硼酸频哪醇酯2.13g(8.4mmol)、催化剂Pd(pddf)Cl20.50g(0.7mmol)及醋酸钾3.00g(30mmol),在氮气保护下，于100℃反应5h，氮气保护下冷却至室温得到产物5-吲哚苯硼酸频哪醇酯，溶液不经处理进行下一步操作。
2-(二乙氨基)乙基-3-(3-(3-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)与5-吲哚苯硼酸频哪醇酯通过Suzuki偶联反应制备2-(二乙氨基)乙基-3-((5-(1H-吲哚-5-基)-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物6)
向上述溶液中加入无水碳酸钠0.40g(3.8mmol)，2-(二乙氨基)乙基-3-(3-(3-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)0.80g(1.5mmol)以及2mL H2O，氮气保护下于100℃反应过夜。冷却至室温，抽滤，1,4-二氧六环洗涤滤饼，收集滤液，旋干得黑色残留物，经过层析柱分离(洗脱溶剂按二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到白色固体(化合物6)0.51g，产率60％；
所得化合物结构如下式所示：
理化性质：mp:114～115℃,MS(ESI)[M-H]+:m/z＝583.30
氢谱核磁共振数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.21(s,1H),9.23(s,1H),9.11(s,1H),8.84(d,J＝2.1Hz,1H),8.61(d,J＝2.0Hz,1H),7.82(s,1H),7.65(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),7.50(d,J＝8.4Hz,1H),7.42(s,1H),7.40(t,J＝5.8Hz,2H),7.38(d,J＝2.1Hz,1H),7.18(d,J＝8.7Hz,1H),6.53(s,1H),4.28(t,J＝5.8Hz,2H),4.00(s,3H),2.75(t,J＝5.9Hz,2H),2.58–2.53(m,4H),0.98(t,J＝7.1Hz,6H).
实施例3
化合物的结构式中，R1为5-嘧啶，R2为2-OCF3，R3为二异丙胺基。
步骤1)～4)与实施例1中步骤1)～4)相同，只是步骤2)中将原料N，N-二甲基乙醇胺替换成N，N-二异丙基乙醇胺，步骤4)中将原料3-三氟甲基-5-溴苯胺替换为2-三氟甲氧基-5-溴苯胺，即由起始化合物3-氨基-4-甲氧基苯甲酸(化合物1)制备化合物2-(二异丙氨基)乙基-3-(3-(5-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)。
5)将2-(二异丙氨基)乙基-3-(3-(5-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)与5-嘧啶硼酸通过Suzuki偶联反应制备化合物2-(二异丙氨基)乙基-4-甲氧基-3-((5-嘧啶-5-基-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)苯甲酸(化合物6)，具体的操作步骤为：
将2-(二异丙氨基)乙基-3-(3-(5-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)1.0g(1.7mmol)、5-嘧啶硼酸0.4g(3.2mmol)、碳酸钾0.6g(4.3mmol)、四(三苯基膦)钯0.24g(0.21mmol)溶于20mL 1,4-二氧六环和5ml水中，在氮气保护下于100℃反应过夜。冷却至室温，抽滤，1,4-二氧六环洗涤滤饼，收集滤液，旋干得黑色残留物，经过层析柱分离(洗脱溶剂按二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到白色固体(化合物6)0.52g，产率52％；
所得化合物结构如下式所示：
理化性质：mp:185～187℃,MS(ESI)[M-H]+:m/z＝574.30
氢谱核磁共振数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.35(d,J＝3.9Hz,1H),9.24(s,1H),9.13(d,J＝2.1Hz,1H),9.11(s,2H),8.81(d,J＝2.0Hz,1H),8.64(d,J＝2.0Hz,1H),7.66(dd,J＝8.6,2.1Hz,1H),7.56(s,1H),7.53(d,J＝2.0Hz,1H),7.17(dd,J＝8.7,2.1Hz,1H),4.15(t,J＝6.4Hz,2H),3.99(s,3H),3.02–2.99(m,2H),2.71(t,J＝6.4Hz,2H),0.98(s,6H),0.96(s,6H).
实施例4
化合物的结构式中，R1为4-吡唑，R2为2-OCF3，R3为吗啉基。
步骤1)～4)与实施例1中步骤1)～4)相同，只是步骤2)中将原料N，N-二甲基乙醇胺替换成N，N-二吗啉基乙醇胺，步骤4)中将原料3-三氟甲基-5-溴苯胺替换为2-三氟甲氧基-5-溴苯胺，即由起始化合物3-氨基-4-甲氧基苯甲酸(化合物1)制备化合物2-吗啉乙基-3-(3-(5-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)。
5)将2-吗啉乙基-3-(3-(5-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)与4-吡唑硼酸频哪醇酯通过Suzuki偶联反应制备化合物2-吗啉-4-基乙基-4-甲氧基-3-((5-(1H-吡唑-4-基)-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)苯甲酸(化合物6)，具体的操作步骤为：
将2-吗啉乙基-3-(3-(5-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)1.0g(1.8mmol)、4-吡唑硼酸频哪醇酯0.5g(2.6mmol)、碳酸钾0.62g(4.3mmol)、四(三苯基膦)钯0.24g(0.21mmol)溶于20mL 1,4-二氧六环和5ml水中，在氮气保护下于100℃反应过夜。冷却至室温，抽滤，1,4-二氧六环洗涤滤饼，收集滤液，旋干得黑色残留物，经过层析柱分离(洗脱溶剂按二氯甲烷：甲醇＝20:1)得到白色固体(化合物6)0.53g，产率55％；
所得化合物如下式所示
理化性质：mp:148～150℃,MS(ESI)[M-H]+:m/z＝548.25
氢谱核磁共振数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.01(s,1H),9.16(s,1H),9.07(s,1H),8.82(d,J＝2.1Hz,1H),8.40(d,J＝1.7Hz,1H),7.65(dd,J＝8.6,2.1Hz,1H),7.35(d,J＝2.1Hz,1H),7.17(d,J＝8.7Hz,1H),4.37(t,J＝5.7Hz,2H),3.99(s,3H),3.58(t,J＝8.7Hz,4H),2.68(t,J＝5.7Hz,2H),2.50(s,4H).
实施例5
化合物的结构式中，R1为2-甲氧基-5-嘧啶，R2为2-OCF3，R3为二异丙胺基。
步骤1)～5)与实施例3中步骤1)～5)相同，只是步骤5)中将原料5-嘧啶硼酸替换为2-甲氧基-5-嘧啶硼酸，即由起始化合物3-氨基-4-甲氧基苯甲酸(化合物1)制备化合物2-(二异丙氨基)乙基-3-(3-(5-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)，然后2-(二异丙氨基)乙基-3-(3-(5-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸与2-甲氧基-5-嘧啶硼酸通过Suzuki偶联反应制备得到化合物6，所得化合物6的结构式如下所示：
实施例6
化合物的结构式中，R1为1-甲基-4-吡唑，R2为2-OCF3，R3为吗啉基。
步骤1)～5)与实施例4中步骤1)～5)相同，只是步骤5)中将原料4-吡唑硼酸频哪醇酯替换为1-甲基-4-吡唑硼酸频哪醇酯，即由起始化合物3-氨基-4-甲氧基苯甲酸(化合物1)制备化合物2-吗啉乙基-3-(3-(5-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)，然后2-吗啉乙基-3-(3-(5-溴-2-(三氟甲氧基)苯基)脲)-4-甲氧基苯甲酸(化合物5)与1-甲基-4-吡唑硼酸频哪醇酯通过Suzuki偶联反应制备得到化合物6，所得化合物6的结构式如下所示：
血管的生成与肿瘤的发生、发展和迁移都有密切关系，抑制新生血管的形成可以有效的抑制肿瘤的生长。许多生长因子都参与调控新生血管的生成，其中VEGFR-2是已知的最强的正调控因子。通过抑制VEGFR-2激酶的活性，阻断其诱导的信号通路，能够抑制肿瘤细胞的增生和迁移，进而达到治疗肿瘤的目的。
下面对本发明提供的具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物进行抗肿瘤活性实验。
1、具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物对VEGFR-2激酶的抑制活性筛选：
激酶VEGFR-2和底物Abltide购自Signal-Chem公司，选用Promega公司的ADP-GlobTM Kinase Assays检测试剂盒检测目标化合物的抑酶活性，操作方法按照试剂盒说明进行。
将ATP(1mM)用buffer(2×)(Tris 80mM,MgCl220mM,BSA 0.2mg/mL,DTT2mM)稀释80倍配制成ATP(125μM)的buffer(2×)溶液；将125μM的ATP溶液和Abltide溶液体积1:1混合配制成ATP(62.5μM)-Abltide(0.5μg/μl)的混合溶液备用；VEGFR-2激酶溶液用buffer(1×)(Tris 40mM,MgCl210mM,BSA 0.1mg/mL,DTT 1mM)稀释100倍配制成VEGFR-2(10ng/μl)的buffer(1×)溶液备用。将目标化合物和阳性对照药(Sorafinib)用buffer(1×)分别配制成6×10-5mol/L、6×10-6mol/L、6×10-7mol/L、6×10-8mol/L、6×10-9mol/L、6×10-10mol/L浓度梯度的样品溶液，于384孔板上每孔依次加入2μL ATP-Abltide的混合溶液，1μL样品溶液，2μL酶溶液；空白孔加3μL缓冲液和2μLATP-Abltide的混合溶液；对照孔加2μL ATP-Abltide的混合溶液，1μL缓冲液，2μL酶溶液，加毕，30℃下孵育60min；加入ADP-Glo试剂5μL，在25℃下孵育40min；加入Kinase detection试剂10μL，在25℃下孵育30min。
采用PerkinElmer多功能酶标仪的化学发光模块测定每孔的发光值，计算目标化合物对VEGFR-2的抑制率和IC50。
本发明提供的具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物对VEGFR-2激酶抑制剂活性的结果，如表1所示：
表1具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物对VEGFR激酶的IC50
通过表1可以看出本发明提供的具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物中的个别化合物具有良好的抑制VEGFR-2激酶的活性，能够在制备抑制VEGFR-2激酶活性的药物中应用。
2、具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物的抗肿瘤活性筛选
采用MTT法检验具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物对肿瘤细胞的生长抑制活性：
本发明提供的具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物具有抗肿瘤作用，对肿瘤细胞有体外抑制增殖活性的作用，在肺癌细胞(A549)，肝癌细胞(SMCC-7721)细胞系中具有抑制肿瘤细胞的增殖活性，可以用于对这些癌症的治疗；与阳性药索拉菲尼相比，个别化合物显示了更高的抑制肿瘤细胞增殖活性。
将处于对数生长期的肺癌细胞(A549)、肝癌细胞(SMCC-7721)，用0.25％的胰酶消化3～5分钟，吹打均匀后稀释成浓度为1×104～2×104个/mL的单细胞悬液，平行接种于96孔培养板中，每孔接种体积为180μL；于37℃，5％CO2培养箱中培养24个小时；以含0.25％DMSO(N,N-二甲基亚砜)的水溶液为阴性对照，以索拉菲尼(Sorafinib)为阳性对照，待测样品加入4个不同浓度的杂环联苯芳基脲类衍生物(8×10-7mol/L、4×10-6mol/L、2×10-5mol/L、1×10-4mol/L)，每个浓度设3个复孔，继续培养48个小时；然后每孔加入5mg/mL的MTT工作液22μL，混匀，37℃培养箱孵育4小时后取出，小心吸弃培养液，每孔加入150μL DMSO，振荡10min，酶联免疫法检测仪测量各孔490nm处紫外吸收值(OD值)，然后计算细胞抑制率，并根据抑制率求出IC50值；细胞抑制率的计算公式为：
抑制率％＝(阳性对照组OD值-用药组OD值)/阴性对照细胞OD值×100％
检测结果显示：与阴性对照组相比，本发明提供的具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物对上述2种肿瘤细胞具有不同程度的体外抑制作用，具体结果如表2所示。
表2.具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物对不同细胞株的IC50(μM)
结果显示部分化合物对肿瘤细胞的抑制和阳性对照药索拉菲尼相当，甚至有一些活性要高于阳性对照。说明本发明提供的具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物对肿瘤细胞(肺癌细胞A549和肝癌细胞SMCC-7721)的增殖抑制效果比较明显，能够在制备抗肿瘤药物中应用。
由于VEGFR-2激酶对肿瘤细胞的生长作用，以及本发明提供的具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物对VEGFR-2激酶的抑制作用，故本发明提供的具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物能够在以VEGFR-2激酶为靶点的抗肿瘤药物中应用，不仅包括上述举例的抗肺癌和抗肝癌药物，同理，还可包括抗胃癌、抗白血病、抗神经癌、抗结肠癌、抗乳腺癌、抗宫颈癌和抗胰腺癌等药物。

Claims (1)

1.一种具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)3-氨基-4-甲氧基苯甲酸与BOC酸酐反应，得到3-((叔丁氧羰基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸；
2)将3-((叔丁氧羰基)氨基)-4-甲氧基苯甲酸与醇胺片段缩合成酯，得到含有叔胺片段的酯类化合物；
3)用三氟乙酸将含有叔胺片段的酯类化合物中的叔丁氧羰基脱去，生成含有苯胺片段的酯类化合物；
4)将3-三氟甲基-5-溴苯胺或2-三氟甲氧基-5-溴苯胺与三光气形成异氰酸酯，再与含有苯胺片段的酯类化合物缩合，形成脲类化合物；
5)在四(三苯基膦)钯催化下，将脲类化合物与含有杂环的苯硼酸或含有杂环的苯硼酸酯通过Suzuki反应，生成目标产物——具有抗肿瘤活性的杂环联苯芳基脲类化合物；
其中，醇胺片段的结构式为
含有叔胺片段的酯类化合物的结构式为
含有苯胺片段的酯类化合物的结构式为
脲类化合物的结构式为
含有杂环的苯硼酸的结构式为
含有杂环的苯硼酸酯的结构式为
目标产物的结构式为
R1为3-吡啶基、2-甲氧基-5-嘧啶基、4-吡唑基、1-甲基-4-吡唑基、5-嘧啶基或5-吲哚基；R2为2-OCF3或3-CF3；R3为二甲氨基、二乙胺基、二异丙胺基或N-吗啉基。
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