CN104815351B - 一种复合导电材料的心肌仿生支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合导电材料的心肌仿生支架及其制备方法。本发明利用导电材料氧化石墨烯与明胶复合，再交联无生物毒性的京尼平，形成一种导电性能增强的氧化石墨烯‑明胶水凝胶仿生支架。所述仿生支架，可通过改变交联度调控支架的弹性模量，更好地模拟体内心肌层的力学性能，同时该支架表面微结构可控以及所复合的导电材料——氧化石墨烯，从而实现了体内心肌微环境的模拟，更有利于心肌细胞的生长、形成高度有序的空间结构和细胞间电生理信号及收缩信号的传导，能够促进心肌细胞的生长和改善心肌细胞功能。
Description
技术领域
本发明属于组织工程领域，具体涉及一种复合了氧化石墨烯的明胶水凝胶心肌仿生支架及其制备方法。
背景技术
心血管疾病诱发多种严重的并发症，例如心肌梗死，从而导致心肌坏死和心肌细胞的缺失和死亡，在全球疾病致死率中居于首位，严重影响和危害着人类的健康和生活。目前心脏疾病的治疗方法主要为心脏移植和安装左心室辅助装置(LVADs)。但是心脏移植面临捐赠器官有限的问题且LVADs所需费用昂贵。心肌组织工程的目的是在可模拟体内心肌组织、由细胞和/或生物材料组成的支架的引导作用下实现受损心肌的修复或者在体外进行药物筛选，排除可能会引起心脏毒性副作用的药物。心肌组织结构复杂，心肌层排列紧密，且构成心肌层的心肌细胞排列高度有序，首尾相连的心肌细胞与心肌内其他细胞通过末端的连接盘(包括缝隙连接和其他粘着位点)相互联系，传导分子信号及收缩力的信号。在体内，心肌细胞能够顺应循环系统中急性或慢性的变化。心肌组织具有丰富且复杂的电生理活动，跳动的心肌细胞产生电信号，传播至整个心脏，引起细胞膜电位的去极化以及心肌细胞的收缩程序。因此组织工程化的心肌组织应当能够满足体内心肌特异的、高度有序的空间结构，为细胞提供软硬度适宜的支撑，还应当具备利于支架上的细胞传递电信号的性能，在结构和功能上同时模拟在体心肌组织。近些年来，开始有研究在仿生支架中复合导电材料(如纳米金，碳纳米纤维等)，增强支架的导电性。最近的一些研究结果表明复合导电材料的混合支架上的心肌细胞的代谢活动比单独的支架上的更为活跃，导电材料可能增强细胞间的电信号传导，促进与收缩和电耦合的心肌特异基因的表达上调，改善心肌支架的性能。氧化石墨烯由石墨经强酸氧化而成，是一种性能优异的新型碳材料，具有较高的比表面积和表面丰富的官能团，具有一定的导电性。Shin等人在明胶-甲基丙烯酸甲酯接枝共聚物中掺入氧化石墨烯并利用3T3细胞研究其细胞相容性，但3T3细胞为成纤维细胞系，增殖能力强并可持续传代，而心肌细胞为原代细胞，无法增殖，其特性与3T3细胞相差很大。(Shin S R,Aghaei‐Ghareh‐Bolagh B,Dang T T,et al.Cell‐laden Microengineeredand Mechanically Tunable Hybrid Hydrogels of Gelatin and Graphene Oxide[J].Advanced Materials,2013,25(44):6385-6391.)
发明内容
本发明目的在于提供一种复合导电材料氧化石墨烯的、导电性能增强的、可促进心肌细胞生长和改善心肌细胞功能的仿生支架。本发明的另一目的还在于提供一种复合导电材料氧化石墨烯的、导电性能增强的、可促进心肌细胞生长和改善心肌细胞功能的仿生支架的制备方法。
为了达到发明目的，本发明采用的技术方案是：
所述复合导电材料的心肌仿生支架，采用氧化石墨烯与明胶在水中进行复合，复合所得到的氧化石墨烯-明胶水凝胶再用京尼平进行交联。
所述的仿生支架中氧化石墨烯的浓度为0.3mg/mL～1.0mg/mL。明胶溶解于氧化石墨烯水溶液后，溶液体积不变，因此氧化石墨烯水溶液浓度不变。
所述的仿生支架中明胶的质量体积比为6％～20％。
所述的仿生支架表面具有可引导心肌细胞高度有序生长排列的微结构。
所述微结构为平行排列的沟槽结构。
所述沟槽结构的沟和嵴的宽度均为5μm～25μm，沟与嵴的高度差为0.5μm～1μm。
更优选地，所述沟槽结构的沟和嵴的宽度均为10～20μm。
进一步优选地，所述沟槽结构的沟和嵴的宽度均为15μm。
所述仿生支架的制备方法的具体过程如下，首先将明胶溶于0.3mg/mL～1.0mg/mL的氧化石墨烯水溶液中，得到明胶的质量体积比为6％～20％的氧化石墨烯-明胶溶液；然后吸取所得氧化石墨烯-明胶溶液成胶，即可得到表面无微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶；最后称取京尼平，用溶剂溶解，得到质量体积比为0.1％～1.0％的京尼平溶液，再将所述无微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶浸泡于所述京尼平溶液中，置于5℃～30℃下中交联4小时～72小时，交联完毕后，用超纯水清洗支架，最终制备得到所述的仿生支架；所述用于溶解京尼平的溶剂为水或浓度为10mM且pH为7.4的HEPES缓冲液。
所述的表面具有微结构的仿生支架的制备方法具体过程如下：首先将明胶溶于0.3mg/mL～1.0mg/mL的氧化石墨烯水溶液中，得到明胶的质量体积比为6％～20％的氧化石墨烯-明胶溶液；然后将硅模板上的微结构转移至PDMS模板上，再取所述氧化石墨烯-明胶溶液滴至PDMS模板表面成胶，待氧化石墨烯-明胶水凝胶成胶后，将其从PDMS模板上剥离，即制备得到表面具有微结构氧化石墨烯-明胶水凝胶；最后，称取京尼平溶解，用溶剂溶解，得到质量体积比为0.1％～1.0％的京尼平溶液，将所述具有微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶浸泡于所述京尼平溶液中，置于5℃～30℃下交联4小时～72小时，交联完毕后，用超纯水清洗支架，即制备得到所述表面具有微结构的仿生支架；所述用于溶解京尼平的溶剂为水或浓度为10mM且pH为7.4的HEPES缓冲液。
所述的仿生支架的制备方法中京尼平交联的温度为25℃。
所述的表面具有微结构的仿生支架的制备方法中京尼平交联的温度为25℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)构建了一种复合氧化石墨烯的、导电性能增强的、基于明胶的水凝胶仿生支架并用于心肌组织工程技术领域中，解决了现有技术中心肌仿生支架无导电性或导电性能差的问题。
(2)本发明的氧化石墨烯明胶水凝胶支架可以通过改变京尼平交联条件调控水凝胶支架的弹性模量，达到力学可控的效果，更能模拟体内心肌层的力学性能，能够更早地实现心肌细胞的整体同步跳动并带动基底收缩，从而促进心肌细胞生长和心肌片层形成。
(3)本发明的氧化石墨烯明胶水凝胶支架可以通过调控水凝胶表面微结构引导心肌细胞沿微结构方向高度有序地生长，提高细胞的伸长率，使心肌细胞产生的收缩力度增大，进一步地促进心肌细胞生长和心肌片层的形成。
附图说明：
图1-图3为不同时间点支架的收缩力度图。其中图1为实施例11制备得到的无微结构的明胶水凝胶，产生的最大收缩力度为0.45μN。图2为实施例2制备得到的无微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶，产生的最大收缩力度为0.75μN。图3为实施例7制备得到的表面具备微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶产生的最大收缩力度为13μN。
具体实施方式：
为了加深对本发明的理解，下面结合实施例对本发明作进一步详述。
实施例1：
步骤1、氧化石墨烯-明胶溶液的制备：称取0.6g的明胶溶于10mL的0.3mg/mL的氧化石墨烯溶液中，室温溶胀30min后，置于40℃水浴锅中溶解，形成明胶的质量体积比为6％的氧化石墨烯-明胶溶液；
步骤2、无微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶支架的制备：吸取400μL步骤1中的氧化石墨烯-明胶溶液注入内径为10mm的圆柱体模具中，置于4℃环境中2小时即可形成无微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶支架。
步骤3、京尼平交联水凝胶：称取一定量的京尼平溶解于超纯水中，形成质量体积比为0.1％的京尼平溶液。将上述制备得到的氧化石墨烯-明胶水凝胶支架浸泡于京尼平溶液中，置于5℃培养箱中交联4h。交联完毕后，超纯水清洗支架三遍，除去残留的京尼平，即制备得到所述心肌支架。
实施例2：
步骤1、氧化石墨烯-明胶溶液的制备：称取0.6g的明胶溶于10mL的0.6mg/mL的氧化石墨烯溶液中，室温溶胀30min后，置于60℃水浴锅中溶解，形成明胶的质量体积比为6％的氧化石墨烯-明胶溶液；
步骤2、无微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶支架的制备：吸取400μL步骤1中的氧化石墨烯-明胶溶液注入内径为10mm的圆柱体模具中，置于10℃环境中2小时即可形成无微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶支架。
步骤3、京尼平交联水凝胶：称取一定量的京尼平溶解于HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中，形成质量体积比为0.2％的京尼平溶液。将上述制备得到的水凝胶支架浸泡于京尼平溶液中，置于25℃培养箱中交联24h。交联完毕后，超纯水清洗支架三遍，除去残留的京尼平，即制备得到所述心肌支架。
实施例3：
步骤1、氧化石墨烯-明胶溶液的制备：称取0.6g的明胶溶于10mL的0.6mg/mL的氧化石墨烯溶液中，室温溶胀30min后，置于60℃水浴锅中溶解，形成明胶的质量体积比为6％的氧化石墨烯-明胶溶液；
步骤2、无微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶支架的制备：吸取400μL步骤1中的氧化石墨烯-明胶溶液注入内径为10mm的圆柱体模具中，置于4℃环境中2小时即可形成无微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶支架。
步骤3、京尼平交联水凝胶：称取一定量的京尼平溶解于HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中，形成质量体积比为0.8％的京尼平溶液。将上述制备得到的水凝胶支架浸泡于京尼平溶液中，置于25℃培养箱中交联24h。交联完毕后，超纯水清洗支架三遍，除去残留的京尼平，即制备得到所述心肌支架。
实施例4：
步骤1、氧化石墨烯-明胶溶液的制备：称取2g的明胶溶于10mL的1.0mg/mL的氧化石墨烯溶液中，室温溶胀30min后，置于90℃水浴锅中溶解，形成明胶的质量体积比为20％的氧化石墨烯-明胶溶液；
步骤2、无微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶支架的制备：吸取400μL步骤1中的氧化石墨烯-明胶溶液注入内径为10mm的圆柱体模具中，置于4℃环境中2小时即可形成无微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶支架。
步骤3、京尼平交联水凝胶：称取一定量的京尼平溶解于HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)中，形成质量体积比为1.0％的京尼平溶液。将上述制备得到的水凝胶支架浸泡于京尼平溶液中，置于30℃培养箱中交联72h。交联完毕后，超纯水清洗支架三遍，除去残留的京尼平，即制备得到所述心肌支架。
实施例5：
制作微结构氧化石墨烯-明胶水凝胶：首先称取PDMS的主剂与固化剂，以质量比为10:1的比例混合，用药匙搅拌混合均匀后置于真空干燥箱中，抽真空15min，除去试剂中的气泡。随后，将PDMS浇注到硅模板表面，放入60℃烘箱中2h，其中所述硅模板上的微结构为平行排列的沟槽结构，沟和嵴的宽度均为5μm，沟与嵴的高度差为0.5μm。待PDMS固化后，将其从硅模板表面剥离，即制备得到可重复利用的PDMS模板(PDMS模板上的微结构与硅模板上的微结构相反)。制备微结构水凝胶时，取30μL水凝胶溶液滴至PDMS模板表面，将玻片轻扣于水凝胶溶液表面，4℃环境中静置24小时成胶。水凝胶成胶风干后，将其从PDMS模板上剥离，即制备得到与硅模板微结构一致的表面具微结构氧化石墨烯-明胶水凝胶。
之后的采用京尼平交联氧化石墨烯-明胶水凝胶的方法与实施例1相同。
实施例6：
制作微结构氧化石墨烯-明胶水凝胶与实施例5唯一不同的是：制备微结构水凝胶时，在25℃环境中静置72小时成胶。
之后的采用京尼平交联氧化石墨烯-明胶水凝胶的方法与实施例1相同。
实施例7：
制作微结构氧化石墨烯-明胶水凝胶与实施例5唯一不同的是：硅模板上的微结构的沟和嵴的宽度均为10μm，深度为0.5μm。
之后的采用京尼平交联氧化石墨烯-明胶水凝胶的方法与实施例2相同。
实施例8：
制作微结构氧化石墨烯-明胶水凝胶与实施例5唯一不同的是：硅模板上的微结构的沟和嵴的宽度均为15μm，深度为1μm。
之后的采用京尼平交联氧化石墨烯-明胶水凝胶的方法与实施例3相同。
实施例9：
制作微结构氧化石墨烯-明胶水凝胶与实施例5唯一不同的是：硅模板上的微结构的沟和嵴的宽度均为20μm，深度为1μm。
之后的采用京尼平交联氧化石墨烯-明胶水凝胶的方法与实施例4相同。
实施例10：
制作微结构氧化石墨烯-明胶水凝胶与实施例5唯一不同的是：硅模板上的微结构的沟和嵴的宽度均为25μm，深度为1μm。
之后的采用京尼平交联氧化石墨烯-明胶水凝胶的方法与实施例4相同。
实施例11：
制作无微结构的、未加入氧化石墨烯的明胶水凝胶与实施例2唯一不同的是：明胶溶液的制备是称取0.6g明胶溶于10mL的超纯水中。
之后的采用京尼平交联明胶水凝胶的方法与实施例4相同。
实施例12：
实施例1-10制备得到的氧化石墨烯-明胶水凝胶及实施例11制备得到的明胶水凝胶利用半导体参数仪对其电阻值进行测量。从下表1中可以看出：氧化石墨烯的加入增强了水凝胶支架的导电性，利于心肌细胞之间的信号传导。
表1.各实施例中支架的电阻值
| 实施例序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 电阻值(MΩ) | 0.4±0.18 | 0.35±0.14 | 0.34±0.15 | 0.2±0.09 | 0.42±0.18 | 0.44±0.17 |
| 实施例序号 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| 电阻值(MΩ) | 0.37±0.11 | 0.38±0.12 | 0.21±0.18 | 0.24±0.13 | 1 |
实施例13：
在普通光学显微镜下观察实施例2、实施例7和实施例11制备得到的支架上的心肌细胞的生长情况并拍摄视频，可见新生大鼠心肌细胞在支架上同步跳动，并带动支架收缩。利用Matlab软件分析视频中支架的收缩力度，最大收缩力度越大，则说明心肌细胞生长情况越好，电生理活动越活跃。图1-图3为不同时间点支架的收缩力度图。其中图1为实施例11制备得到的无微结构的明胶水凝胶，产生的最大收缩力度为0.45μN。图2为实施例2制备得到的无微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶，产生的最大收缩力度为0.75μN。图3实施例7制备得到的表面具备微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶产生的最大收缩力度为13μN。
Claims (10)
1.一种复合导电材料的心肌仿生支架，其特征在于，所述仿生支架采用氧化石墨烯与明胶在水中进行复合，复合所得到的氧化石墨烯-明胶水凝胶再用京尼平进行交联，所述仿生支架中氧化石墨烯的浓度为0.3mg/mL～1.0mg/mL，所述仿生支架中明胶的质量体积比为6％～20％。
2.根据权利要求1所述的仿生支架，其特征在于，所述仿生支架表面具有可引导心肌细胞高度有序生长排列的微结构。
3.根据权利要求2所述的仿生支架，其特征在于，所述微结构为平行排列的沟槽结构。
4.根据权利要求3所述的仿生支架，其特征在于，所述沟槽结构的沟和嵴的宽度均为5μm～25μm，沟与嵴的高度差为0.5μm～1μm。
5.根据权利要求4中所述的仿生支架，其特征在于，所述沟槽结构的沟和嵴的宽度均为10～20μm。
6.根据权利要求5中所述的仿生支架，其特征在于，所述沟槽结构的沟和嵴的宽度均为15μm。
7.一种如权利要求1所述的仿生支架的制备方法，其特征在于，制备方法的具体过程如下，首先将明胶溶于0.3mg/mL～1.0mg/mL的氧化石墨烯水溶液中，得到明胶的质量体积比为6％～20％的氧化石墨烯-明胶溶液；然后吸取所得氧化石墨烯-明胶溶液成胶，即可得到表面无微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶；最后称取京尼平，用溶剂溶解，得到质量体积比为0.1％～1.0％的京尼平溶液，再将所述无微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶浸泡于所述京尼平溶液中，置于5℃～30℃下中交联4小时～72小时，交联完毕后，用超纯水清洗支架，最终制备得到所述的仿生支架；所述用于溶解京尼平的溶剂为水或浓度为10mM且pH为7.4的HEPES缓冲液。
8.根据权利要求7所述的仿生支架的制备方法，其特征在于京尼平交联的温度为25℃。
9.一种如权利要求2-6中任一所述的表面具有微结构的仿生支架的制备方法，其特征在于，具体制备过程如下：首先将明胶溶于0.3mg/mL～1.0mg/mL的氧化石墨烯水溶液中，得到明胶的质量体积比为6％～20％的氧化石墨烯-明胶溶液；然后将硅模板上的微结构转移至PDMS模板上，再取所述氧化石墨烯-明胶溶液滴至PDMS模板表面成胶，待氧化石墨烯-明胶水凝胶成胶后，将其从PDMS模板上剥离，即制备得到表面具有微结构氧化石墨烯-明胶水凝胶；最后，称取京尼平溶解，用溶剂溶解，得到质量体积比为0.1％～1.0％的京尼平溶液，将所述具有微结构的氧化石墨烯-明胶水凝胶浸泡于所述京尼平溶液中，置于5℃～30℃下交联4小时～72小时，交联完毕后，用超纯水清洗支架，即制备得到所述表面具有微结构的仿生支架；所述用于溶解京尼平的溶剂为水或浓度为10mM且pH为7.4的HEPES缓冲液。
10.根据权利要求9所述的表面具有微结构的仿生支架的制备方法，其特征在于京尼平交联的温度为25℃。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |