CN104812910A - 自动化酵母出芽测量 - Google Patents

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Abstract

本发明总的来说涉及分析酵母的活性和酵母的繁殖率。更具体来说，本发明涉及用于评估和测量酵母细胞的出芽百分率、活性和浓度的高效且有效的方法和组合物。

Description

自动化酵母出芽测量
优先要求权和相关专利申请
本申请要求2012年10月18日提交的美国临时申请系列No.61/715,496的优先权利益，所述临时申请的全部内容作为整体通过参考并入本文。
技术领域
本发明总的来说涉及酵母细胞的分析和测量。更具体来说，本发明涉及用于评估和测量酵母细胞的酵母出芽、活性(viability)和浓度的高效且有效的方法和组合物。
背景技术
生物燃料和酿造工业一直利用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为主要生物体来开始生产CO2和生物乙醇作为产物的发酵过程。目前，最大的生物燃料过程严重依赖于乙醇生产，其利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)对甘蔗、玉米粉、多糖和废水进行发酵。由于它们的高的乙醇耐受性、最终乙醇浓度、葡萄糖转化率和工业发酵在历史上的稳健性(historical robustness)，酵母是用于生物乙醇生产的理想组分。(Antoni等，2007Appl.Microbiol.Biotech.vol.77,pp.23-35；Vertès等，2008J.Mol.Microbiol.and Biotech.vol.15,pp.16-30；Basso等，2008FEMS Yeast Res.vol.8,pp.1155-1163；等，2009J.Chem.Technolog.Biotech.vol.84,pp.497-503；Gibbons等，2009In Vitro Cell.&Developm.Biol.-Plant,vol.45,pp.218-228；Hu等，2007Genetics,vol.175,pp.1479-1487；Argueso等，2009Genome Res.vol.19,pp.2258-2270；Eksteen等，2003Biotech.and Bioeng.vol.84,pp.639-646。)
酵母出芽是酿酒厂和生物燃料公司用于确定发酵质量的最重要的参数之一。用于繁殖和发酵的酵母接种时间(pitching time)是样品中出芽酵母的百分率，已知其能够估算酵母的生长率。目前，没有现有的简单的自动酵母出芽检测方法。成像流式细胞仪已被用于进行酵母细胞周期测定以测量出芽百分率。(Meredith等，2008Cytometry Part A,73A:825-833。)然而，成像流式细胞仪相对昂贵并且需要相当大量的维护以及训练有素的技术人员进行操作。因此，它不适合于工业生产背景中的质量保证。此外，由于样品中大的玉米糖化醪残渣会堵塞系统中的流体通路，因此基于流动的样品制备不能用于生物燃料样品。
用于浓度、活性和酵母出芽百分率的常规分析方法包括在常规光学显微镜下在血细胞计数器中对酵母颗粒进行手动计数和在铺板中对菌落形成单位进行菌落计数。这些方法是繁琐和耗时的，并且由于操作人员的主观性而固有地不一致。为了获得在发酵期间酵母行为的准确体现，需要用于测量样品的浓度、活性和出芽百分率的自动方法。
因此，对用于准确且高效测量酵母的浓度、活性和出芽百分率的自动方法，存在着未满足的需求。
发明概述
本发明部分是基于用于自动测量酵母出芽百分率的高效和有效方法的发现。本发明克服了以前方法的缺点，通过本发明的方法可以容易地并准确地分析例如来自于生物燃料和葡萄酒生产厂的实时样品。由于本发明允许高的染色特异性，因此可以有效地测量混杂的样品。由于允许快速、准确和同时测定酵母出芽、浓度和活性，本发明的自动的、基于图像的细胞计量方法极大简化了生物燃料和酿造工业的测量过程。
一方面，本发明总的来说涉及一种用于自动分析酵母细胞的出芽状态的方法。所述方法包括：在缓冲溶液中用染料对将要进行酵母细胞出芽分析的样品进行染色；获取所述染料染色的样品的荧光图像；通过基于计算机的自动化处理分析所述染料染色的样品的所述荧光图像，以确定所述染料染色的样品中酵母细胞的图像的纵横比，由此确定所述样品中出芽的酵母细胞的状态。
另一方面，本发明总的来说涉及一种用于同时测定酵母出芽和活性的方法。所述方法包括：将待测样品在缓冲溶液中用第一染料并用第二染料进行染色；获取用所述第一和第二染料染色的样品的第一荧光图像，该第一荧光图像对应于来自于所述第一染料的荧光；获取用所述第一和第二染料染色的样品的第二荧光图像，该第二荧光图像对应于来自于所述第二染料的荧光；通过基于计算机的自动化处理分析所述第一荧光图像以确定酵母细胞的纵横比，由此确定所述样品中出芽的酵母细胞的状态；以及分析所述第二荧光图像以确定酵母活性。
另一方面，本发明总的来说涉及一种用于同时测量样品中酵母细胞的浓度、活性、出芽百分率的方法。所述方法包括：将待测样品在具有约5至约12的pH的缓冲条件下用第一染料并用第二染料进行染色；获取用所述第一和第二染料染色的样品的第一荧光图像，该第一荧光图像对应于来自于所述第一染料的荧光；获取用所述第一和第二染料染色的样品的第二荧光图像，该第二荧光图像对应于来自于所述第二染料的荧光；以及分析所述第一和第二荧光图像，以确定酵母细胞的浓度、活性和出芽百分率。
附图简述
图1描绘了来自于本发明的方法的实施例的某些示例性结果，示出了用于对出芽酵母进行计数的成像分析方法。
图2描绘了来自于本发明的方法的实施例的某些示例性结果，示出了从正在生长的酵母群体测量的出芽百分率。
图3描绘了来自于本发明的方法的实施例的某些示例性结果，示出了与传统的手动计数方法的比较。
发明详述
本发明解决了以前方法的缺点，并提供了对各种不同样品例如来自于生物燃料厂的含有玉米糖化醪和其他残渣的样品的实时和准确的分析。由于高的染色特异性，因此可以有效地测量混杂样品。通过允许同时分析和测量酵母细胞的活性和浓度，本发明还提供了极高的效率和有效性。
最近，Nexcelom Bioscience(Lawrence，MA)开发了一种新的成像细胞计量方法，其能够使用廉价的一次性计数板快速测量细胞浓度，仅需20μl样品。(Lai等，2009J.Clin.Oncology vol.27,pp.1235-1242；Nott等，2009J.Biol.Chem.vol.284,pp.15277-15288；Qiao等，2009Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biol.vol.29,pp.1779-U139；Rounbehler等，2009Cancer Res.vol.69,pp.547-553；Shanks等，2009Appl.and Envir.Microbiol.vol.75,pp.5507-5513；Stengel等，2009Endocrinology,vol.150,pp.232-238。)
利用明场和荧光成像的结合，所述系统能够自动获取细胞图像并使用新的计数算法进行处理，以对细胞群体和各种不同细胞类型的活性进行的准确一致的测量。以前已报道了多种应用，例如免疫细胞、癌细胞、干细胞、昆虫细胞、脂肪细胞、肝细胞、血小板、藻类细胞和异质性细胞的计数，GFP转染的定量，使用台盼蓝或碘化丙啶的活性测定，测量全血中的WBC。更重要的是，所述方法已被显示为产生一致的纯酵母的浓度和活性测量，在生物燃料、饮料和烘焙业中用于质量控制。(Nexcelom Bioscience，“使用Oxonol简单、快速和一致地测定酵母活性”(Simpe,Fast and Consistent Determination of YeastViability using Oxonol)，在Application Focus:Cellometer Vision 10X,pp.1-2中)。
本文中公开了一种新的成像荧光细胞计量方法，其利用Vision(Nexcelom Bioscience,Lawrence,MA)，用于在例如来自于运行中的发酵罐的玉米糖化醪中确定酵母出芽、浓度和活性。使用本发明的稀释缓冲液并用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)染色样品，出芽状态、活性和失活的酵母被选择性标记，同时消除了来自于玉米糖化醪的非特异性荧光信号。这种方法可以使用直接来自于加工中的发酵罐的样品，不需进一步的过滤处理，高效地进行酵母质量控制，这可能对在美国监测一致的生物乙醇生产具有巨大影响。除了玉米糖化醪之外，使用这种方法也可以测量甘蔗发酵中酵母的活性。所述方法也可以容易地应用于酿造生产过程中的质量控制。
如图1中所示，本发明利用了一种包括自动显微术、荧光染色和缓冲液以及图像分析方法的系统。本发明的图像分析方面利用荧光染色的酵母的获取的图像，并测量每个酵母颗粒的长轴和短轴长度。长轴与短轴长度之比，在本文中被定义为“斜率＝长轴/短轴”，提供了可以藉以评估酵母的出芽状态的变量(参数)。例如，如果酵母颗粒正在出芽，则长轴长度将大于短轴长度，因此产生大于1的斜率值，而如果酵母颗粒不在出芽，则对于圆形酵母来说斜率具有约为1的值。使用这个参数，人们可以自动将图2中的第二群体设门(gate)为出芽群体。
一方面，本发明总的来说涉及一种用于自动分析酵母细胞的出芽状态的方法。所述方法包括：在缓冲溶液中用染料对将要进行酵母细胞出芽分析的样品进行染色；获取染料染色的样品的荧光图像；通过基于计算机的自动化处理分析染料染色的样品的荧光图像，以确定染料染色的样品中酵母细胞的图像的纵横比，由此确定样品中出芽的酵母细胞的状态。
在某些优选实施例中，基于计算机的自动化处理包括自动测量样品中出芽的酵母的形状。可以设定阈值，使得如果酵母细胞(通常为圆形)的纵横比为1.1以上，则将它当作出芽的。取决于应用，可以设定其他阈值，例如1.15以上、1.2以上、1.25以上的纵横比等。
所述染料可以是适合于染色和分析的任何染料，例如选自由吖啶橙、SYTO 9、DAPI、Hoechst、钙荧光白、碘化丙啶、溴化乙锭、Oxonol、Mg-ANS、吖啶黄、ConA-FITC所组成的组中的一种以上染料。使用的染料量/浓度取决于具体的应用。例如在吖啶橙的情形中，浓度可以在约1μg/mL至约50μg/mL(例如约2μg/mL至约50μg/mL、约5μg/mL至约50μg/mL、约10μg/mL至约50μg/mL、约20μg/mL至约50μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约40μg/mL、约1μg/mL至约30μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL)的范围内。
缓冲液可以是任何适合的缓冲溶液，例如具有约5至约12范围内(例如约6至约12、约7至约12、约8至约12范围内，约8、9、10、11或12)的pH的缓冲液。
通过本文公开的方法可以分析任何适合的样品。例如，样品可以是来自于使用酵母的醇类生产过程的样品。在某些实施例中，待测样品是来自于生物燃料发酵过程的样品。待测样品可能含有某些残渣，例如玉米糖化醪、甘蔗、纤维素和玉米秸中的一种以上残渣。
本发明的方法适合于分析和测量来自于从生物质生产乙醇、丁醇和甲醇中的一种以上的生物燃料发酵过程的样品。
适合于通过所公开的方法分析的样品的其他实例，包括来自于葡萄酒生产过程的样品。
所述方法普遍适用于测量一般酵母的出芽状态。酵母的示例性种类包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
另一方面，本发明总的来说涉及一种用于同时确定酵母出芽和活性的方法。所述方法包括：将待测样品在缓冲溶液中用第一染料并用第二染料进行染色；获取用第一和第二染料染色的样品的第一荧光图像，该第一荧光图像对应于来自于第一染料的荧光；获取用第一和第二染料染色的样品的第二荧光图像，该第二荧光图像对应于来自于第二染料的荧光；通过基于计算机的自动化处理分析第一荧光图像以确定酵母细胞的纵横比，由此确定样品中出芽的酵母细胞的状态；以及分析第二荧光图像以确定酵母活性。该方法还可以包括分析第一和第二荧光图像以确定出芽的酵母细胞的浓度的步骤。
例如，在吖啶橙的情况下，浓度可以在约1μg/mL至约50μg/mL(例如约2μg/mL至约50μg/mL、约5μg/mL至约50μg/mL、约10μg/mL至约50μg/mL、约20μg/mL至约50μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约40μg/mL、约1μg/mL至约30μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL)的范围内。此外，例如在碘化丙啶的情况下，浓度可以在约1μg/mL至约50μg/mL(例如约2μg/mL至约50μg/mL、约5μg/mL至约50μg/mL、约10μg/mL至约50μg/mL、约20μg/mL至约50μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约40μg/mL、约1μg/mL至约30μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL)的范围内。
在某些实施例中，第一染料选自由吖啶橙、SYTO 9、DAPI、Hoechst、钙荧光白所组成的组，并且第二染料选自由碘化丙啶、溴化乙锭、Oxonol、Mg-ANS所组成的组。在某些优选实施例中，第一染料是吖啶橙并且第二染料是碘化丙啶。
在另一方面，本发明总的来说涉及一种用于同时测量样品中酵母细胞的浓度、活性、出芽百分率的方法。该方法包括：将待测样品在具有约5至约12的pH的缓冲条件下用第一染料并用第二染料进行染色；获取用第一和第二染料染色的样品的第一荧光图像，该第一荧光图像对应于来自于第一染料的荧光；获取用第一和第二染料染色的样品的第二荧光图像，该第二荧光图像对应于来自于第二染料的荧光；以及分析第一和第二荧光图像，以确定酵母细胞的浓度、活性和出芽百分率。
所开发的自动酵母出芽检测方法可以应用于大量类型的酵母。可以调整测量的斜率参数以能够固定对芽的大小的限制，以消除不同技术人员之间的主观性。本公开的方法快速且简单，并且可以容易地适应于酿造和生物燃料工业的生产或研究部门处的质量保证环境。本公开的发明的更加独特之处在于可以同时测量所有三个重要参数(酵母浓度、活性和出芽百分率)。
实施例
酵母制备
通过将酵母在30℃下在YPD培养基中过夜温育来制备酵母生长培养物。然后通过在30℃下振荡，将酵母培养物(800μL)重悬浮在20mL培养基玻璃试管中。在2.5、5、6、8、10、24和30小时的时间点收集酵母并用吖啶橙和碘化丙啶染色。获取荧光图像。
自动检测
在每个时间点，使用Cell Profiler(Cambridge，MA)和NexcelomCellometer软件(Lawrence，MA)分析荧光图像，其中将输出的数据输入到FCS Express 4Image(Los Angeles，CA)中。然后使用FCSExpress 4对每个酵母颗粒的斜率进行作图，以便分开并测量两个群体(出芽和不出芽的)(图1)。这种方法被并入软件中，以便使用斜率值来确定出芽百分率，并同时测量浓度和活性。
手动比较
在每个时间点，在明场成像和荧光成像下进行酵母颗粒和出芽的手动计数。对总酵母颗粒和出芽的酵母进行手动计数以产生样品中的出芽百分率。判定标准目前被设定为如果两个酵母相接触，则它被计数为一个芽。将手动计数的结果与自动检测方法进行比较。
自动方法的验证
自动出芽检测方法在每个时间点处的设门结果示出在图3中。存在清楚的趋势，即在生长阶段开始时，观察到高的出芽百分率。随后从延滞期、对数期到稳定期，出芽百分率降低。在生长期中，出芽百分率从～60降低至20％。
将自动出芽结果与明场和荧光手动计数进行比较(图3)。结果显示出在所有三种方法之间测量到可比的出芽百分率。由于将碎片计数，明场手动计数通常过高估计出芽，而荧光手动计数方法与自动方法保持相对一致。
在本说明书和随附的权利要求书中，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“一(the)”包含复数引用，除非上下文明确陈述并非如此。
除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员所通常理解的相同的意义。尽管与本文中所描述的相似或等同的任何方法和材料也可用于本公开的实践或试验，但现在描述了优选的方法和材料。除了所公开的具体顺序之外，本文中叙述的方法可以以任何逻辑上可能的顺序执行。
通过参考并入
在本公开中，对其他文献例如专利、专利申请、专利公开、杂志、书籍、论文、网页内容进行了参考和引用。为任何目的，所有这样的文献在此作为整体通过参考并入本文。被称为通过参考并入本文，但是与现有的定义、陈述或本文中专门提出的其他公开材料冲突的任何材料或其部分，仅以不在并入的材料与本公开的材料之间产生冲突的程度上并入。在有冲突的情况下，以支持作为优选公开内容的本公开的方式解决冲突。
等同物
本文中公开的代表性实例旨在帮助说明本发明，并且不打算、它们也不应被解释为限制本发明的范围。事实上，对于本领域技术人员来说，根据本文件的全部内容、包括随后的实例和对本文中引用的科学和专利文献的参考，除了本文中示出和描述的之外，本发明的各种修改例及其许多进一步的实施例将变得显而易见。本文中的实例在其各种不同实施例及其等同例中含有重要的附加信息、示例和指导，其可以适用于实践本发明。

Claims (46)

1.一种用于酵母细胞的出芽状态的自动化分析的方法，所述方法包括：
在缓冲溶液中用染料对将要进行酵母细胞出芽分析的样品进行染色；
获取所述染料染色的样品的荧光图像；
通过基于计算机的自动化处理分析所述染料染色的样品的荧光图像，以确定所述染料染色的样品中酵母细胞的图像的纵横比，由此确定所述样品中出芽的酵母细胞的状态。
2.权利要求1的方法，其中所述基于计算机的自动化处理包括圆形出芽酵母的形状的自动测量。
3.权利要求2的方法，其中如果圆形酵母细胞的纵横比为1.1以上，则它被认为是出芽的。
4.权利要求1的方法，其中所述染料选自由吖啶橙、SYTO 9、DAPI、Hoechst、钙荧光白、碘化丙啶、溴化乙锭、Oxonol、Mg-ANS、吖啶黄、ConA-FITC所组成的组。
5.权利要求1的方法，其中所述缓冲条件具有约5至约12的pH。
6.权利要求5的方法，其中所述缓冲条件具有约8至约12的pH。
7.权利要求1的方法，其中所述待测样品是来自于使用酵母的醇类生产过程的样品。
8.权利要求1的方法，其中所述待测样品是来自于生物燃料发酵过程的样品。
9.权利要求8的方法，其中所述待测样品包含玉米糖化醪的残渣。
10.权利要求8的方法，其中所述待测样品包含甘蔗、纤维素和玉米秸的一种以上残渣。
11.权利要求8的方法，其中所述生物燃料发酵过程包括从生物质生产乙醇。
12.权利要求8的方法，其中所述生物燃料包括从生物质生产丁醇。
13.权利要求8的方法，其中所述生物燃料包括从生物质生产甲醇。
14.权利要求1的方法，其中所述待测样品是来自于葡萄酒生产过程的样品。
15.权利要求1的方法，其中所述待测样品是来自于啤酒酿造生产过程的样品。
16.权利要求1的方法，其中所述酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)种类。
17.权利要求4的方法，其中所述染料是浓度为约1μg/mL至约50μg/mL的吖啶橙。
18.一种用于同时确定酵母出芽和活性的方法，所述方法包括：
将待测样品在缓冲溶液中用第一染料并用第二染料进行染色；
获取用所述第一和第二染料染色的样品的第一荧光图像，该第一荧光图像对应于来自于所述第一染料的荧光；
获取用所述第一和第二染料染色的样品的第二荧光图像，该第二荧光图像对应于来自于所述第二染料的荧光；
通过基于计算机的自动化处理分析所述第一荧光图像以确定酵母细胞的纵横比，由此确定所述样品中出芽的酵母细胞的状态；以及
分析所述第二荧光图像以确定酵母的活性。
19.权利要求18的方法，其中所述基于计算机的自动化处理包括图像分析以测量出芽的酵母的形状。
20.权利要求18的方法，其中如果酵母细胞的图像的纵横比为1.1以上，则它被认为是出芽的。
21.权利要求18的方法，其中所述第一染料选自由吖啶橙、SYTO9、DAPI、Hoechst、钙荧光白所组成的组，并且所述第二染料选自由碘化丙啶、溴化乙锭、Oxonol、Mg-ANS所组成的组。
22.权利要求21的方法，其中所述第一染料是吖啶橙并且所述第二染料是碘化丙啶。
23.权利要求18的方法，其中所述缓冲条件具有约5至约12的pH。
24.权利要求23的方法，其中所述缓冲条件具有约8至约12的pH。
25.权利要求18的方法，其中所述待测样品是来自于生物燃料发酵过程的样品。
26.权利要求25的方法，其中所述生物燃料发酵过程包括生产乙醇。
27.权利要求25的方法，其中所述生物燃料发酵过程包括生产丁醇。
28.权利要求25的方法，其中所述生物燃料发酵过程包括生产甲醇。
29.权利要求25的方法，其中所述待测样品包含玉米糖化醪的残渣。
30.权利要求25的方法，其中所述待测样品包含甘蔗的残渣。
31.权利要求18的方法，其中所述将要进行酵母出芽和活性试验的样品是来自于葡萄酒生产过程的样品。
32.权利要求18的方法，其中所述待测样品是来自于啤酒酿造生产过程的样品。
33.权利要求18的方法，其中所述酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)种类。
34.权利要求22的方法，其中吖啶橙具有约1μg/mL至约50μg/mL的浓度，并且碘化丙啶具有约1μg/mL至约50μg/mL的浓度。
35.权利要求18的方法，其还包括分析所述第一和第二荧光图像以确定出芽的酵母细胞的浓度。
36.一种用于同时测量样品中酵母细胞的浓度、活性、出芽百分率的方法，所述方法包括：
在具有约5至约12的pH的缓冲条件下，将待测样品用第一染料并用第二染料进行染色；
获取用所述第一和第二染料染色的样品的第一荧光图像，该第一荧光图像对应于来自于所述第一染料的荧光；
获取用所述第一和第二染料染色的样品的第二荧光图像，该第二荧光图像对应于来自于所述第二染料的荧光；以及
分析所述第一和第二荧光图像，以确定酵母细胞的浓度、活性和出芽百分率。
37.权利要求36的方法，其中所述第一染料选自由吖啶橙、SYTO9、DAPI、Hoechst、钙荧光白所组成的组，并且所述第二染料选自由碘化丙啶、溴化乙锭、Oxonol、Mg-ANS所组成的组。
38.权利要求37的方法，其中所述第一染料是吖啶橙并且所述第二染料是碘化丙啶。
39.权利要求36的方法，其中所述缓冲条件具有约8至约12的pH。
40.权利要求39的方法，其中所述缓冲条件具有约8至约12的pH。
41.权利要求36的方法，其中所述样品来自于生物燃料发酵过程。
42.权利要求41的方法，其中所述样品包含玉米糖化醪的残渣。
43.权利要求41的方法，其中所述样品包含甘蔗、纤维素和玉米秸的一种以上残渣。
44.权利要求36的方法，其中所述样品来自于葡萄酒生产过程。
45.权利要求36的方法，其中所述样品来自于啤酒酿造生产过程。
46.权利要求36的方法，其中所述酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)种类。
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