CN104805214A - 基于实时荧光定量pcr的黔北麻羊fshr基因组织表达谱的建立方法 - Google Patents

基于实时荧光定量pcr的黔北麻羊fshr基因组织表达谱的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法。本发明应用实时荧光定量PCR技术，建立山羊FSHR基因在不同组织中的表达谱，对于阐明FSHR基因表达的作用机理具有一定的指导作用。而且它具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强及自动化程度高等优点，还有效解决了PCR污染的问题，因此比采用其它方法来建立组织表达谱适应性更强。本发明方法简单，易于实施，成本低廉，使用效果好。

Description

基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法。
背景技术
促卵泡素（Follicle stimulating hormone， FSH）是脑腺垂体分泌的对卵巢卵泡生长、发育、分化和成熟起重要作用的生殖类激素。其为生物大分子，不能透过细胞膜，必须与促卵泡素受体(follicile stimulating hormone receptor，FSHR)结合才能发挥其生物学功能。FSHR是G蛋白偶联受体超家族的成员之一，其受体蛋白肽链在功能和结构上可以分为三个部分：胞内域、跨膜域和胞外域，即4个包质区、7个跨膜疏水区和N端的3个环状区组成的细胞外区。促卵泡素对雌性动物的繁殖性能具有重要的作用。然而，促卵泡素必须与促卵泡素受体结合才能发挥作用。所以，促卵泡素受体的质量和数量决定促卵泡素生物学功能是否充分发挥。或者说，FSHR含量的多少可能与雌性动物的繁殖性能有一定的作用。
实时荧光定量PCR不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强、有效解决了PCR污染的问题、自动化程度高等特点。山羊FSHR基因已有研究表明对山羊的繁殖性能有一定的影响，但其生物学机理扔不清楚。我们应用实时荧光定量PCR技术，建立山羊FSHR基因在不同组织中的表达谱，对于阐明FSHR基因表达的作用机理具有一定的指导作用。
发明内容
本发明的目的是：提供一种基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法，它具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强、有效解决了PCR污染的问题、自动化程度高等特点，比采用其它方法来建立组织表达谱适应性更强。
本发明是这样实现的：基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法，采用Trizol法分别提取已屠宰的发情期产单羔和产双羔母羊的5种组织的总RNA，所述的5种组织包括下丘脑、垂体、卵巢、输卵管和子宫；并对提取的总RNA进行cDNA的反转录合成；以上述cDNA为模板，分别对FSHR和GAPDH进行常规PCR扩增；FSHR上游引物的序列为5’- CGAGTCATCCCAGAAGGAG-3’， FSHR下游引物的序列为5’- GGCAGGTTGGAGAACACATT- 3’； GAPDH上游引物的序列为5’ -CTGACCTGCCGCCTGGAGAAA -3’， GAPDH:下游引物的序列为5’ -GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTT- 3’； 回收相应条带并与T-载体连接，转化DH5α感受态细胞，将鉴定为阳性的重组质粒进行测序，并将获得的重组质粒进行10倍比稀释后，将其作为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，获得标准曲线；荧光定量PCR每个样品，并用ddH2O做阴性对照；采用2-△△Ct定量分析方法对山羊FSHR基因在发情期不同组织进行差异表达量分析，构建组织表达谱。
所述的对对FSHR和GAPDH进行常规PCR扩增时，PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min，34个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；反应体系为20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL, DNA模板2 μL，上、下游引物各1.5 μL，加水至20 μL。
所述的回收相应条带并与T-载体连接，具体反应体系如下：胶回收的PCR产物3 μL；pUCm-T载体1 μL；10×Ligation Buffer 1 μL；50%PEG 4000 μl；Sterilized ddH2O 3 μl；T4 DNA Ligation 1 μL；混匀，16 ℃连接过夜。
所述的转化DH5α感受态细胞的转化步骤如下：取100 μL感受态细胞，置于冰上，完全解冻后将细胞均匀悬浮；将上述的连接液全部加入感受态细胞中混匀，冰上放置30 min；42℃水浴热激90 s，冰上放置15～20 min；加400 μL SOC培养基，37℃200～250 rpm振荡培养1小时；室温下4000rpm离心5 min，用枪头吸掉400 μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；将细菌涂布在预先用20 μL 100Mm IPTG和100 μL 20mg/ml X-gal涂布的氨苄青霉素平板上；平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。
所述的构建组织表达谱，具体是：首先计算各组织样品的目的基因与内参基因的Ct差值（△Ct=△Ct目的基因-△Ct内参基因），然后计算每个组织样品△Ct平均值，选取垂体组织为对照，用其它组织样△Ct减去垂体组织的△Ct，即△△Ct=（△△Ct目的基因-△△Ct内参基因）试验组-（△△Ct目的基因-△△Ct内参基因）对照组。
由于采用了以上技术方案，本发明应用实时荧光定量PCR技术，建立山羊FSHR基因在不同组织中的表达谱，对于阐明FSHR基因表达的作用机理具有一定的指导作用。而且它具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强及自动化程度高等优点，还有效解决了PCR污染的问题，因此比采用其它方法来建立组织表达谱适应性更强。本发明方法简单，易于实施，成本低廉，使用效果好。
附图说明
图1为FSHR荧光定量PCR标准曲线；
图2为GAPDH荧光定量PCR标准曲线；
图3为FSHR和GAPDH的溶解曲线，如图所示两对引物特异性较高；
图4为FSHR和GAPDH的扩增曲线；
图5为发情期产单羔和双羔黔北麻羊各组织的相对表达谱。
具体实施方式
本发明的实施例：基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法，
实时荧光定量PCR引物合成和质粒测序送英维捷基（上海）贸易有限公司测序；大肠杆菌感受态细胞DH5α购自大连Takara公司；质粒小量抽提试剂盒、T-载体PCR产物克隆试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；MMLV反转录试剂盒、SYBR Green                                                荧光定量试剂盒购于北京康为试剂生物科技有限公司；采用美国伯乐公司CFX96实时荧光定量PCR仪。
（1）山羊各组织RNA提取
分别提取3头发情期产单羔和产双羔母羊5种组织（下丘脑、垂体、卵巢、输卵管和子宫）样品50-100 mg，迅速置于液氮遇冷的玻璃匀浆器中，迅速研磨成粉末状。吸取1000 μl Trizol 于匀浆管中，吹打均匀后吸出于离心管中。多个样品如此重复，然后加入200 μL氯仿。
震荡混匀30s，室温静置5 min以上；12000 rpm 4℃离心15 min，吸取上清液转移到新的离心管中，加入500 μl异丙醇，震荡30 s，室温静置10 min，12000 rpm 4 ℃离心10 min。
弃除上清液，加入1ml预冷75％乙醇，震荡混匀沉淀。12000rpm室温离心2 min后，再吸弃上清液，加入1ml预冷75％乙醇；震荡后12000rpm室温离心2 min。
弃除上清液，倒置于滤纸后常温10 min晾干；用30μL DEPC处理水溶解。
（2）cDNA的反转录合成
按照HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书合成cDNA第一链，体系为20 μL：dNTP Mix(2.5mMEach) 4 μL，Primer Mix 2 μL，5×RT Buffer 4 μL，DTT(0.1M) 2 μL，HiFiScript (200U/μL)1 μL，RNA Template 2 μL，RNase-Free Water 5 μL。42℃孵育45 min后，85孵育5 min，置于冰上冷却，-20℃长期保存。
（3）引物设计
参照GenBank收录的FSHR mRNA基因序列（NM_001009289.1），运用Primier 5.0和Oligo软件设计跨外显子2、3的荧光定量引物和GAPDH。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
FSHR:上游引物5’ CGAGTCATCCCAGAAGGAG3’
FSHR:下游引物5’ GGCAGGTTGGAGAACACATT 3’
GAPDH:上游引物5’ CTGACCTGCCGCCTGGAGAAA 3’
GAPDH:下游引物5’ GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTT 3’
（4）标准曲线的建立
以某一头山羊垂体组织cDNA为模板，分别对FSHR和GAPDH进行常规PCR扩增。PCR反应条件为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min，34个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。反应体系为20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL, DNA模板2 μL，上、下游引物各1.5 μL，加水至20 μL。
 将PCR产物目的条带的切割和称重，并按每100 mg琼脂糖中加入300-600 μL的溶胶液Buffer B2，充分混匀；50℃水浴5~10 min，直至胶完全熔化，将所得溶液转移至吸附柱中，8000×g室温离心30s，弃上清；将吸附柱中加入500 μL漂洗液，9000×g室温离心30 s，弃上清；重复步骤(3)一次；将吸附柱于9000×g室温离心1 min，除去残留的漂洗液，将吸附柱室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；取出吸附柱，放入一个新的1.5 ml离心管中，向吸附柱中间滴加15-40 μl ddH2O，室温静置1-2 min。9000×g室温离心1 min洗脱DNA，收集管中溶液，将所得到的DNA溶液置于-20度保存或用于后续试验。
利用T-载体PCR产物克隆试剂盒进行山羊FSHR基因T载体重组质粒的构建，反应体系如下：胶回收的PCR产物3 μL；pUCm-T载体1 μL；10×Ligation Buffer 1 μL；50%PEG 4000 μl；Sterilized ddH2O 3 μl；T4 DNA Ligation 1 μL；混匀，16 ℃连接过夜。
连接产物转化DH5α菌株，转化的步骤如下：取100 μL感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮；将上述的连接液全部加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30 min；42℃水浴热激90 s，冰上放置15~20 min；加400 μL SOC培养基，37℃200~250 rpm振荡培养1小时；室温下4000rpm离心5 min，用枪头吸掉400 μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；将细菌涂布在预先用20 μL 100Mm IPTG和100 μL 20mg/ml X-gal涂布的氨苄青霉素平板上；平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。
挑取白色单菌落于装有5 ml含有终浓度为20mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃200rpm/h的培养箱中摇菌培养16h。经PCR鉴定后，将阳性重组质粒送英维捷基（上海）贸易有限公司测序。提取测序鉴定正确的重组质粒，将重组质粒进行10倍梯度稀释，将其作为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，获得标准曲线。
（5）荧光定量PCR检测方法的优化和建立
由标准曲线可见，FSHR基因的扩增效率E=96.3℅，相关系数R2=0.999（图1）；GAPDH基因扩增效率E=100.5℅，相关系数R2=0.998（图2）。说明FSHR和GAPDH基因扩增效率基本相同，可用于△△Ct相对定量PCR分析。由溶解曲线表明，FSHR和GAPDH基因片段溶解曲线均出现单峰，溶解温度分别为78.5 ℃和83 ℃（图3），无非特异性扩增产物及引物二聚体峰出现，说明引物特异性好，可用于后续试验。
（6）检测山羊FSHR基因在不同组织中的表达差异
20 μL反应体系：SYBR Rremix Ex TaqTM （北京康为世纪科技有限公司）10 μL，上游引物0.75 μL，下游引物0.75μL，ddH2O 7.5 μL，cDNA 1μL，使用荧光定量PCR仪进行定量分析。荧光定量PCR反应程序：95 ℃预变性30 s，然后95 ℃ 10 s，56℃所列退火温度退火30 s读板收集荧光，39个循环；最后从55 ℃到95 ℃，按0.5 ℃增值进行溶解曲线分析,荧光采集时间为5 s。荧光定量PCR每个样品设3次重复，并用ddH2O做阴性对照。
（7）采用2-△△Ct定量分析方法对山羊FSHR基因在发情期不同组织进行差异表达量分析，构建组织表达谱。首先计算各组织样品的目的基因与内参基因的Ct差值（△Ct=△Ct目的基因-△Ct内参基因），然后计算每个组织样品△Ct平均值，选取垂体组织为对照，用其它组织样△Ct减去垂体组织的△Ct，即△△Ct=（△△Ct目的基因-△△Ct内参基因）试验组-（△△Ct目的基因-△△Ct内参基因）对照组。本发明所述并不限于具体实施方式中所述的实施例，本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。显然本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术范围内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
SEQUENCE LISTING
序列表
<110>  贵州大学
<120>  基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法
<130>  nm:
<160>  4
<170>  PatentIn version
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223>参照GenBank收录的FSHRmRNA基因序列（NM_001009289.1），运用Primier 5.0和Oligo软件设计,以用于PCR扩增。
 
<400> 1
CGAGT CATCC CAGAA GGAG 19
 
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223>参照GenBank收录的FSHRmRNA基因序列（NM_001009289.1），运用Primier 5.0和Oligo软件设计,以用于PCR扩增。
 
<400> 2
GGCAG GTTGG AGAAC ACATT  20
 
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223>参照GenBank收录的FSHRmRNA基因序列（NM_001009289.1），运用Primier 5.0和Oligo软件设计,以用于PCR扩增。
 
<400> 3
CTGAC CTGCC GCCTG GAGAA A  21
 
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
 
<220>
<223>参照GenBank收录的FSHRmRNA基因序列（NM_001009289.1），运用Primier 5.0和Oligo软件设计,以用于PCR扩增。
 
<400> 3
GTAGA AGAGT GAGTG TCGCT T  21

Claims (5)

1.一种基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法，其特征在于：采用Trizol法分别提取已屠宰的发情期产单羔和产双羔母羊的5种组织的总RNA，所述的5种组织包括下丘脑、垂体、卵巢、输卵管和子宫；并对提取的总RNA进行cDNA的反转录合成；以上述cDNA为模板，分别对FSHR和GAPDH进行常规PCR扩增；FSHR上游引物的序列为5’- CGAGTCATCCCAGAAGGAG-3’， FSHR下游引物的序列为5’- GGCAGGTTGGAGAACACATT- 3’； GAPDH上游引物的序列为5’ -CTGACCTGCCGCCTGGAGAAA -3’， GAPDH:下游引物的序列为5’ -GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTT- 3’； 回收相应条带并与T-载体连接，转化DH5α感受态细胞，将鉴定为阳性的重组质粒进行测序，并将获得的重组质粒进行10倍比稀释后，将其作为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，获得标准曲线；荧光定量PCR每个样品，并用ddH2O做阴性对照；采用2-△△Ct定量分析方法对山羊FSHR基因在发情期不同组织进行差异表达量分析，构建组织表达谱。
2.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法，其特征在于：所述的对对FSHR和GAPDH进行常规PCR扩增时，PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min，34个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；反应体系为20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL, DNA模板2 μL，上、下游引物各1.5 μL，加水至20 μL。
3.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法，其特征在于：所述的回收相应条带并与T-载体连接，具体反应体系如下：胶回收的PCR产物3 μL；pUCm-T载体1 μL；10×Ligation Buffer 1 μL；50%PEG 4000 μl；Sterilized ddH2O 3 μl；T4 DNA Ligation 1 μL；混匀，16 ℃连接过夜。
4.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法，其特征在于：所述的转化DH5α感受态细胞的转化步骤如下：取100 μL感受态细胞，置于冰上，完全解冻后将细胞均匀悬浮；将上述的连接液全部加入感受态细胞中混匀，冰上放置30 min；42℃水浴热激90 s，冰上放置15～20 min；加400 μL SOC培养基，37℃200～250 rpm振荡培养1小时；室温下4000rpm离心5 min，用枪头吸掉400 μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；将细菌涂布在预先用20 μL 100Mm IPTG和100 μL 20mg/ml X-gal涂布的氨苄青霉素平板上；平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。
5.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立方法，其特征在于：所述的构建组织表达谱，具体是：首先计算各组织样品的目的基因与内参基因的Ct差值（△Ct=△Ct目的基因-△Ct内参基因），然后计算每个组织样品△Ct平均值，选取垂体组织为对照，用其它组织样△Ct减去垂体组织的△Ct，即△△Ct=（△△Ct目的基因-△△Ct内参基因）试验组-（△△Ct目的基因-△△Ct内参基因）对照组。
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