CN104787742A - 一种自发反应制备荧光碳纳米粒子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种简易荧光碳纳米粒子的制备方法及在细胞成像中的应用，属于纳米碳材料制备工艺技术领域。采用化学氧化法，以环糊精为碳源，配制环糊精溶液，加入到氧化剂中，一步法制备具有荧光性质的碳纳米粒；此制备过程是一个自发反应的过程，无需外部加热也不需要复杂的操作，反应物混合后即有白雾生成，反应结束后，离心即能够得到大量的碳纳米粒子；本制备方法无污染，简单可靠，价格低廉，原材料易得，在环境中重金属离子的检测及细胞成像等领域具有广阔的应用前景。

Description

一种自发反应制备荧光碳纳米粒子的方法
技术领域
本发明属于纳米碳材料制备工艺技术领域，具体涉及新型荧光碳纳米粒子的制备，并把其应用做生物荧光探针在体内或体外细胞成像。
背景技术
环糊精(Cyclodexdrin，CD)又名环链淀粉团，是D-葡萄糖6-8个分子利用α-1，4链进行环状联结而成的化合物，是由环糊精葡萄糖基转移酶(CGT)作用于淀粉所产生的一组环状低聚糖。首次发现于1891年。薛定锷完成了确定CD结构的研究，由于CD具有“内疏水，外亲水”的分子结构，又因CD是手性化合物，这种特殊分子结构赋予CD与多种客体化合物形成包合物的能力，由此而形成主客体分子化学，从而使CD在各个领域中得以应用。
天然常见的环糊精有三种，即β-CD、α-CD、γ-CD。含6个葡萄糖单位的α-CD因环筒太小，不适于大多数药物分子被包合；β-CD、γ-CD则有足够的环筒空间来包合体积相对较大一些的客体，因而能与许多药物分子形成稳定的包合物。其中，又以β-CD应用最广，这是因为目前只有β-CD可进行工业化大规模生产。
碳纳米粒(又称荧光碳量子点)是荧光碳纳米材料中最主要的一种，广义上来讲，可以分为三种：纳米金刚石、荧光碳颗粒和石墨烯量子点。目前，研究工作主要集中于荧光碳纳米粒，其粒径一般小于10nm。此后，碳纳米粒由于其强荧光性能、良好的水溶性、化学惰性、低毒性、易官能团化和抗光漂白等性能，逐渐获得越来越多的关注。
近年来，碳纳米粒已成功应用于光催化、光电学、传感、能量转换方面以及作为生物荧光探针在体内和体外成像。与传统的染料分子和半导体量子点相比，碳纳米粒无毒或低毒特性，良好的生物相容性和环境安全性以及水溶性确保了碳纳米粒可以放心地应用于活体细胞的检测，不用担心荧光材料对活体细胞的影响而导致误诊，也可以长时间研究细胞中生物分子之间的相互作用。目前，已有多篇文献报道碳量子点被用作荧光探针应用于细胞和活体的荧光观测。
合成碳纳米粒的方法可以分成两类：化学和物理方法。化学方法包括电化学方法、燃烧/热解/水热/酸氧化法、支持物合成法、微波/超声合成法、溶液化学方法等等。物理方法包括电弧放电、激光剥蚀表面钝化、等离子处理。上述方法制备碳量子点往往需要高温加热，或需要电压、强酸等条件，操作较为繁琐，产率较低，不能大量制备碳量子点；制备的碳量子点的荧光发射波长随激发波长的改变而改变，荧光发射波长不能稳定。
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种荧光碳纳米粒子制备的简易方法。制备的碳纳米粒子在生物样品中具有较好的相容性、光学性能优良，可通过细胞的内吞作用转运至细胞内部，用于体外细胞成像。此方法的优势在于：反应过程简单、操作简便、快捷，条件温和。
发明内容
本发明提供了一种荧光碳纳米粒子制备的简易方法，制备的荧光碳纳米粒具有细胞毒性低、生物相容性好、光学性能优良和成本低廉等优点。
本发明所述荧光碳纳米粒子的制备是通过如下的技术方案实现的，具体包括如下步骤：
(1)环糊精水溶液制备：称取一定量的环糊精于5mL EP管中，用移液枪加入2mL蒸馏水于EP管，超声约10min，形成均匀透明的环糊精溶液；加入的环糊精和溶液的质量比为1∶15～2∶1；
(2)荧光碳纳米粒子制备：称取2.5g氧化剂于50mL锥形瓶中，振摇使之平铺于瓶底，以增大氧化剂与溶液接触面积，使反应充分；将步骤(1)得到的环糊精溶液迅速倒入到盛有2.5g氧化剂的锥形瓶中，发生放热反应，有白雾生成，瓶底形成棕黑色粘稠液体，然后逐渐冷却至室温；环糊精溶液与氧化剂的质量比为：4∶1～1∶3；
(3)离心分离荧光碳纳米粒子：加入10mL蒸馏水于步骤(2)的锥形瓶内，振摇混合，用移液枪将混合溶液加入1.5mLEP管中；将加入液体后的EP管用天平称量，平衡后对称放入离心机中，开始离心(转速13000r/min，时间20min)；离心后，用移液枪将上清液收集加入小瓶中，从而除去杂质沉淀；
(4)荧光碳纳米粒子透析：剪取长度为6-9cm的透析袋，放入盛有蒸馏水的烧杯中，置电炉上煮沸约10min，待冷却后取出透析袋，用夹子夹紧一端后，加入上述步骤(3)得到的上清液，再用夹子夹紧另一端；将透析袋放入盛有500mL蒸馏水的大烧杯中，用绳套住使之悬浮于水中，加入转子磁力搅拌约24h，透析完毕后，用移液枪将透析袋内液体取出加入玻璃小瓶，冷暗处保存；透析袋的截留分子量为：3000～4000。
本发明中，步骤(1)中所述制备澄清溶液的环糊精为β-CD、α-CD、γ-CD中的任意一种。
本发明中，步骤(1)所述配制溶液的溶剂为去离子水或蒸馏水，优选去离子水。
本发明中，步骤(2)所述的氧化剂为强氧化剂五氧化二磷或三氧化二磷，优选五氧化二磷。
本发明中，步骤(1)和(2)中所述的环糊精和氧化剂的纯度都为分析纯。
本发明中，步骤(4)最终产物荧光碳纳米粒子的直径为3～5nm，可用做生物荧光探针在体内和体外细胞成像。
本发明的有益效果：
本发明采用化学氧化法，一步法制备具有较强荧光性质的碳纳米粒子。该制备过程是一个自发反应的过程，无需外部加热也不需要复杂的操作，即能够快速制备大量的碳纳米粒子；本制备方法成本低，绿色无污染，制备的荧光碳纳米粒子具有优良的光学性能，在体内外细胞成像方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为荧光碳纳米粒子的合成过程示意图。
图2为本发明实施例1中所得荧光碳纳米粒子的透射电镜(TEM)图。
图3为本发明实施例1中所得荧光碳纳米粒子的紫外吸收光谱图和荧光发射光谱图(激发波长为364nm，374nm，384nm，394nm)。
具体实施方式
下面给出本发明的具体实施例：
实例1：
本发明荧光碳纳米粒子的制备如下：
(1)环糊精水溶液制备：称取0.2gβ-CD于5mL EP管中，用移液枪加入2mL蒸馏水于EP管，超声使之分散；
(2)荧光碳纳米粒子制备：称取2.5g P2O5于50mL锥形瓶中，振摇使之平铺于瓶底；以增大P2O5与β-CD溶液接触面积，使反应充分；将步骤(1)得到的EP管中的β-CD水溶液迅速倒入锥形瓶中，发生放热反应，有白雾生成，瓶底形成棕黑色粘稠液体，10min后混合物逐渐冷却至室温；
(3)离心分离荧光碳纳米粒子：加入10mL蒸馏水于步骤(2)的锥形瓶内，振摇混合，用移液枪将混合溶液加入6只1.5mL EP管中；将加入液体后的EP管放上天平称量，平衡后对称放入离心机中，开始离心(转速13000r/min，时间20min)；离心后，用移液枪将上清液收集加入小瓶中，从而除去杂质沉淀；
(4)荧光碳纳米粒子透析：取截留分子量为3500的透析袋6～9cm，放入盛有蒸馏水的烧杯中，置电炉上煮沸约10min，待冷却后取出透析袋，用夹子夹紧一端后，加入上述步骤(3)得到的上清液，再用夹子夹紧另一端；将透析袋放入盛有500mL蒸馏水的大烧杯中，用绳套住使之悬浮于水中，磁力搅拌约24h，透析完毕后，用移液枪将透析袋内液体取出加入玻璃小瓶，冷暗处保存。
实例2：
(1)环糊精水溶液制备：称取0.4gα-CD于5mL EP管中，用移液枪加入4mL蒸馏水于EP管，超声使之分散；
(2)荧光碳纳米粒子制备：称取4.0g P2O5于50mL锥形瓶中，振摇使之平铺于瓶底；以增大P2O5与α-CD溶液接触面积，使反应充分；将步骤(1)得到的EP管中的β-CD水溶液迅速倒入锥形瓶中，发生放热反应，有白雾生成，瓶底形成棕黑色粘稠液体，10min后混合物逐渐冷却至室温；
(3)离心分离荧光碳纳米粒子：加入20mL蒸馏水于步骤(2)的锥形瓶内，振摇混合，用移液枪将混合溶液加入12只2mL EP管中；将加入液体后的EP管放上天平称量，平衡后对称放入离心机中，开始离心(转速13000r/min，时间20min)；离心后，用移液枪将上清液收集加入小瓶中，从而除去杂质沉淀；
(4)荧光碳纳米粒子透析：取截留分子量为5000的透析袋5-15cm，放入盛有蒸馏水的烧杯中，置电炉上煮沸约5min，待冷却后取出透析袋，用夹子夹紧一端后，加入上述步骤(3)得到的上清液，再用夹子夹紧另一端；将透析袋放入盛有500mL蒸馏水的大烧杯中，用绳套住使之悬浮于水中，磁力搅拌约24h，透析完毕后，用移液枪将透析袋内液体取出加入玻璃小瓶，冷暗处保存。
对合成的荧光碳纳米粒子进行表征：
荧光碳纳米粒子的制备路线如图1所示，得到的荧光碳纳米粒子在紫外可见光范围内激发，激发波长为370nm，375nm，380nm，385nm，390nm，395nm，400nm，随激发波长的增大，其荧光强度逐渐减弱，但荧光最大发射波长不变，为436nm；上述实施例1制备的荧光碳纳米粒子表面形态如图2所示，纳米粒子呈规则的球形，粒径范围为3～5nm。
实例3：
将实施例1得到的荧光碳纳米粒子用聚乙二醇功能化修饰后与人乳腺癌MCF-7细胞共孵育后，通过双光子荧光显微镜观察，发现MCF-7细胞的细胞膜和细胞质部位的荧光最为明显，推测该碳纳米粒子可通过细胞的内吞作用转运至细胞内部，可作为生物荧光探针在体外细胞成像；此外，将碳纳米粒子键合到膜转位肽如HIV-1反式转录激活因子(TAT)上，可使碳纳米粒在细胞核内良好地成像。

Claims (6)

1.一种荧光碳纳米粒子制备的新方法，包括如下步骤：
(1)环糊精水溶液制备：称取一定量的环糊精于5mL EP管中，用移液枪加入2mL蒸馏水于EP管，超声约10分钟，形成均匀透明的环糊精溶液；加入的环糊精和溶液的质量比为1∶15～2∶1；
(2)荧光碳纳米粒子制备：称取2.5g氧化剂于50mL锥形瓶中，振摇使之平铺于瓶底，以增大氧化剂与溶液接触面积，使反应充分；将步骤(1)得到的环糊精溶液迅速倒入到盛有2.5g氧化剂的锥形瓶中，发生放热反应，有白雾生成，瓶底形成棕黑色粘稠液体，然后逐渐冷却至室温；环糊精溶液与氧化剂的质量比为：4∶1～1∶3；
(3)离心分离荧光碳纳米粒子：加入10mL蒸馏水于步骤(2)的锥形瓶内，振摇混合，用移液枪将混合溶液加入1.5mL EP管中；将加入液体后的EP管放上天平称量，平衡后对称放入离心机中，开始离心(转速13000r/min，时间20min)；离心后，用移液枪将上清液收集加入小瓶中，从而除去杂质沉淀；
(4)荧光碳纳米粒子透析：剪取长度为6-9cm的透析袋，放入盛有蒸馏水的烧杯中，置电炉上煮沸约10min，待冷却后取出透析袋，用夹子夹紧一端后，加入上述步骤(3)得到的上清液，再用夹子夹紧另一端；将透析袋放入盛有500mL蒸馏水的大烧杯中，用绳套住使之悬浮于水中，磁力搅拌约24h，透析完毕后，用移液枪将透析袋内液体取出加入玻璃小瓶，冷暗处保存；透析袋的截留分子量为：3000～4000。
2.根据权利要求1所述荧光碳纳米粒子的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述制备澄清溶液的环糊精为β-CD、α-CD、γ-CD中的任意一种。
3.根据权利要求1所述荧光碳纳米粒子的制备方法，其特征在于步骤(1)所述配制溶液的溶剂为去离子水或蒸馏水，优选去离子水。
4.根据权利要求1所述荧光碳纳米粒子的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的氧化剂为强氧化剂五氧化二磷或三氧化二磷，优选五氧化二磷。
5.根据权利要求1所述荧光碳纳米粒子的制备方法，其特征在于步骤(1)和(2)中所述的环糊精和氧化剂的纯度都为分析纯。
6.根据权利要求1所述荧光碳纳米粒子的制备方法，其特征在于步骤(4)最终产物荧光碳纳米粒子的直径为3～5nm，可用做生物荧光探针在体内和体外细胞成像。
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