CN104781391B

CN104781391B - 鼠疫疫苗

Info

Publication number: CN104781391B
Application number: CN201280076217.XA
Authority: CN
Inventors: E·卡尔涅尔; C·德默尔; A·德尔比斯
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2012-08-07
Publication date: 2018-01-02
Anticipated expiration: 2032-08-07
Also published as: IN2015DN00944A; US9492524B2; CN104781391A; EP2882845A1; US20150202275A1; ES2655421T3; WO2014023992A1; WO2014023992A8; EP2882845B1

Abstract

本申请涉及假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)细胞，其包含编码用于表达至少一种鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)Caf1多肽或者鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段的核酸，更具体地涉及一种减毒假结核耶尔森菌细胞，其表达鼠疫耶尔森菌的荚膜。所述假结核耶尔森菌细胞在抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的保护上异常高效。

Description

鼠疫疫苗

技术领域

本申请涉及尤其用于抗淋巴腺鼠疫和抗肺鼠疫的疫苗接种的方法，以及涉及其生物技术和医学应用。本申请的方法尤其包含假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)细胞或者株，其表达至少一种鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)Caf1多肽或者鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段。更具体地，本申请的方法包含假结核耶尔森菌细胞或株，其表达鼠疫耶尔森菌F1蛋白或者荚膜。

背景技术

鼠疫耶尔森菌，鼠疫的病原体，是影响人类的最致命传染性病原体之一。鼠疫耶尔森菌通过被感染的跳蚤进行传播，其主要引起淋巴腺鼠疫。这种疾病偶尔发展成肺鼠疫，这是感染的最致命且最具传染性的形式，其然后通过气溶胶进行人之间的传播。

自九十年代初，鼠疫已经被列入重新出现的疾病名单，并且鼠疫耶尔森菌被列为潜在的恐怖分子使用的生物武器。由于已经观察到鼠疫耶尔森菌的抗生素耐受株或者可以经过工程改造用于犯罪用途，抗鼠疫的疫苗接种可能成为对抗疾病的唯一手段。

近年来，所做的努力大多集中在组合荚膜F1抗原和V抗原(LcrV)的亚单位制剂。然而，这种疫苗需要使用佐剂和重复注射，以赋予主要为抗体依赖性的保护。

其它策略包括通过遗传工程对活鼠疫耶尔森菌进行减毒、在沙门氏菌或者病毒载体中引入鼠疫耶尔森菌抗原、以及DNA疫苗接种。

然而，这些疫苗不够安全和/或高效对抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫。

Derbise等人2012[参考文献(1)]，发表于2012年2月14日，描述了抗鼠疫活疫苗的构建。更精确地说，它描述了鼠疫耶尔森菌caf操纵子(所述caf操纵子编码用于表面表达低聚鼠疫耶尔森菌F1抗原)的克隆，以及将所述操纵子插入到质粒上用于电穿孔到假结核耶尔森菌的减毒株中。在所得的假结核耶尔森菌株(株V674pF1)中，编码用于表面表达鼠疫耶尔森菌F1单体单元(即，至少Caf1多肽)的核酸包含在所述质粒中。

在本申请的假结核耶尔森菌细胞或株中，编码用于表面表达Caf1多肽的核酸包含在所述假结核耶尔森菌细胞或者株的染色体中。本申请显示出非常高的抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的疫苗接种效果。本申请还提供了比较实验数据，其尤其显示出本申请的细胞或者株比Derbise等人2012中描述的V674pF1株更高效。

发明内容

本申请涉及提交的权利要求中所限定的以及如此处所述的主题。

更具体地，本申请涉及细胞、株、组合物、药物组合物、免疫原性组合物、疫苗、及其生物技术和医学应用，更具体地涉及其体外和体内应用，更具体地涉及其免疫原性和/或疫苗应用。

本申请的细胞是假结核耶尔森菌细胞，更具体地一种重组假结核耶尔森菌细胞。

当用于治疗目的时，本申请的假结核耶尔森菌细胞是无毒力的，更具体地是减毒的，更具体地是遗传减毒的。

本申请的假结核耶尔森菌细胞包含编码至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽或鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段的核酸。更具体地，所述核酸编码鼠疫耶尔森菌F1蛋白，更具体地编码鼠疫耶尔森菌的荚膜。

所述编码核酸被包含在，更具体而言被整合到本申请假结核耶尔森菌细胞的染色体中。

本申请的细胞尤其用作抗鼠疫的免疫原，更具体地抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的免疫原。

所述编码核酸的染色体插入出乎意料地导致更高水平的抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的保护，更具体地是抗淋巴腺鼠疫。

本申请的遗传减毒的假结核耶尔森菌尤其具有以下优点：

-遗传稳定性：所述假结核耶尔森菌细胞的基因组比鼠疫耶尔森菌的基因组更稳定；

-无毒：所述假结核耶尔森菌细胞可以是高度减毒的，例如通过(部分或者完全)删除一个或更多毒力机制所必须的基因，更具体地，不同毒力机制所必须的三个基因；

-分子多样性：当用作活的全细胞疫苗时，它提供高的抗原性复杂性，这保证了对抗广泛抗原性靶的反应；只要细菌存在，抗原就以其天然形式被充分加工并从头生产；

-容易制造：一旦开发和验证，活疫苗并不需要生产复杂的设备和技术；

-免疫原性：因为细菌抗原(LPS和其它病原体相关的标志(signatures))触发固有免疫系统，因此不需要佐剂；除了鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌的常见抗原，所述假结核耶尔森菌细胞可以稳定地生产鼠疫耶尔森菌F1荚膜，这是抗鼠疫耶尔森菌的主要疫苗靶；

-单剂量施用：这是一个主要的优势，因为它极大地方便了疫苗接种活动并允许快速保护；

-能够通过两种途径进行疫苗接种：根据上下文，优选皮下或者口服途径的疫苗接种。

本发明人认为，通过本申请的方法所达到的抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的保护水平是以往报道的最高效之一，并且可能是最高效的。

附图说明

图1：重组质粒pUC18R6KTn7-caf-Cm^R的遗传图谱，其携带插入在Tn7迷你转座子中的caf操纵子[caf1M、caf1A和caf1(在作为调控序列的caf1R的控制下)]。

图2：整合到减毒假结核耶尔森菌株染色体中的迷你Tn7-caf-Cm^R转座子的遗传图谱。

图3：检测减毒假结核耶尔森菌株的鼠疫耶尔森菌F1生产，其中caf操纵子已被插入到基因组中(株V674TnF1)。V674是不具有caf操纵子的亲本株。CO92是用于克隆caf操纵子的鼠疫耶尔森菌株。

图4：检测包围减毒假结核耶尔森菌细胞的F1荚膜，所述减毒假结核耶尔森菌细胞包含在质粒上的(假结核耶尔森菌株V674pF1；左图)或者插入到染色体中的(假结核耶尔森菌V674TnF1；右图)鼠疫耶尔森菌caf操纵子。在V674pF1中，许多细菌未被荚膜包围(一些实例用箭头显示)，而所有V674TnF1细胞均被包囊。

图5A、5B和5C：携带鼠疫耶尔森菌caf操纵子的减毒假结核耶尔森菌细胞，存在于口服疫苗接种有10⁸或者10⁹CFU的小鼠肠道菌群(图5A)、派伊尔斑(peyer's patches)(图5B)和脾脏(图5C)中。

方形＝减毒假结核耶尔森菌细胞，其中鼠疫耶尔森菌caf操纵子携带在质粒上(假结核耶尔森菌株V674pF1)。

三角形＝减毒假结核耶尔森菌细胞，其中鼠疫耶尔森菌caf操纵子被插入到染色体中(假结核耶尔森菌株V674TnF1)。

图6A和6B：用鼠疫耶尔森菌(肺鼠疫)进行中度(图6A)或者重度(图6B)鼻内攻击后，单次口服疫苗接种减毒假结核耶尔森菌细胞所赋予的抗肺鼠疫保护，其中减毒假结核耶尔森菌细胞将鼠疫耶尔森菌caf操纵子携带在质粒上(株V674pF1)或者插入到染色体中(株V674TnF1)。

图7A和7B：用鼠疫耶尔森菌(淋巴腺鼠疫)进行中度(A)或者重度(B)皮下攻击后，单次口服疫苗接种减毒假结核耶尔森菌细胞所赋予的抗淋巴腺鼠疫保护，其中减毒假结核耶尔森菌细胞将鼠疫耶尔森菌caf操纵子携带在质粒上(株V674pF1)或者插入到染色体中(株V674TnF1)。

图8：采用鼠疫耶尔森菌(株CO92)进行重度攻击，单次皮下接种10⁷或者10⁸CFU减毒假结核耶尔森菌细胞所赋予的抗淋巴腺鼠疫(皮下感染)的保护，其中鼠疫耶尔森菌caf操纵子插入到染色体中(株V674TnF1)。

图9：采用鼠疫耶尔森菌(株CO92)进行重度攻击，单次皮下接种各种剂量的减毒假结核耶尔森菌细胞所赋予的抗肺鼠疫(鼻内感染)的保护，其中鼠疫耶尔森菌caf操纵子插入到染色体中(株V674TnF1)。

具体实施方式

本申请涉及假结核耶尔森菌细胞。

所述假结核耶尔森菌细胞是重组细胞。

所述假结核耶尔森菌细胞可以是任何血清型，例如血清型I、II、III、IV或者V，例如血清型I。所述假结核耶尔森菌细胞可以是任何假结核耶尔森菌株的细胞。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞或者株是血清型I。

假结核耶尔森菌株是本领域普通技术人员可获得的，例如来自微生物的采集(例如，CRBIP、DSMZ、ATCC、NCTC)、来自商业来源或者通过分离自污染的生物材料(如来自污染的水或者土壤)或者来自污染的有机体(如被感染的人或者被感染的非人动物)。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞或者株是来自耶尔森菌研究单位和国家参考实验室(Yersinia Research Unit and National Reference Laboratory)收集的假结核耶尔森菌IP32953(以登录号NC_006155，更具体地NC_006155.1，可以获得株IP32953的基因组序列)。

假结核耶尔森菌是肠病原体。假结核耶尔森菌感染(或假结核病)导致急性消化性疾病，有时随后是败血症，以及有时但很少见的是关节和/或皮肤症状。

人类感染假结核耶尔森菌通常会导致肠胃炎。在一些国家如俄罗斯和日本，假结核耶尔森菌的特定株引起远东猩红样发热(FESLF)，其特点是红斑皮疹、脱屑、疹子、舌头充血、反应性关节炎、中毒性休克综合征、败血症。

在非人动物中，假结核耶尔森菌是发病率以及有时是死亡率的常见原因。

因此，当本申请的假结核耶尔森菌细胞意图用于治疗性应用时，它是(或已经制成)无毒力的，即无论对于接受者还是对于接受者的任何接触而言，所述假结核耶尔森菌细胞是足以安全地用于没有任何临床感染危险的施用。换句话说，假如不能完全消除与施用所述假结核耶尔森菌相关的风险，则其被最小化。

更具体地，所述假结核耶尔森菌细胞已丧失导致假结核病的能力，更通常而言已丧失导致肠疾病和败血症的能力。

根据本申请的实施方式，所述无毒力的假结核耶尔森菌细胞仍然能够生长，更具体而言能够在宿主有机体(如人或者非人的哺乳动物)中复制，但是已经丧失在所述宿主有机体中导致所述疾病的能力。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞对于健康哺乳动物，更具体而言对于健康人类，是无毒力的。

所述假结核耶尔森菌细胞可以是天然无毒力的，或者它可以通过遗传和/或化学减毒而成为无毒力的。

致病性细菌的减毒方法是本领域已知的。可以通过失活一个或更多参与细菌代谢途径的基因，更具体地通过失活一种或更多细菌致病性机制，和/或通过失活一个或更多参与或者负责产生细菌毒力因子的基因，来实现遗传减毒。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞是遗传减毒的。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞是不可逆减毒的。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞是遗传地且不可逆地减毒的。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞是通过部分或者完全删除一个或者更多基因而减毒的，更具体而言通过部分或者完全删除一个或者更多参与或者负责产生假结核耶尔森菌毒力因子的基因而减毒的。这样的基因包括高致病岛基因(HPI)、yopK基因和psaA基因。

例如通过同源重组随后的等位基因交换能够实现基因的部分或者完全删除(参见参考文献(1)和(8)，即Derbise等人2012和2003)。

部分删除实现到足以失活基因功能的程度。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞是通过部分或者完全删除一个或更多选自HPI基因、yopK基因和psaA基因的基因而减毒的，例如通过部分或者完全删除两个或更多选自HPI基因、yopK基因和psaA基因的基因而减毒的。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞是减毒的：

-通过部分或者完全删除yopK基因和psaA基因中的至少一个，更具体而言

-通过部分或者完全删除HPI基因中的至少一个，还更具体而言

-通过部分或者完全删除至少一个HPI基因，其是YPTB基因，还更具体而言

-通过部分或者完全删除至少HPI基因YPTB1585至YPTB1602(假结核耶尔森菌株IP32953中鉴定的YPTB基因，以NC_006155更具体而言以NC_006155.1可获得其基因组序列)，还更具体而言

-通过部分或者完全删除一些HPI基因，使得足以减弱HPI诱导的毒力，还更具体而言

-通过部分或者完全删除所有HPI基因，还更具体而言

-通过部分或者完全删除yopK和psaA基因中的至少一个，以及通过部分或者完全删除HPI基因中的至少一个、至少两个或全部、或者至少YPTB1585至YPTB1602，还更具体而言

-通过部分或者完全删除yopK和psaA基因中的至少一个，以及通过部分或者完全删除至少YPTB1585至YPTB1602，还更具体而言

-通过部分或者完全删除yopK和psaA基因，以及通过部分或者完全删除至少一个、至少两个或所有HPI基因；

-通过部分或者完全删除yopK和psaA基因，以及通过部分或者完全删除至少YPTB1585至YPTB1602。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞是通过部分或者完全删除HPI基因YPTB1585至YPTB1602、yopK基因和psaA基因而减毒的，更具体而言通过部分删除HPI基因、yopK基因和psaA基因而减毒的。

在假结核耶尔森菌株IP32953的基因组序列中(基因组序列NC_006155，更具体而言NC_006155.1)可获得并鉴定示例性的假结核耶尔森菌HPI基因序列。例如，YPTB1585直至YPTB1602序列从所述基因组序列的位置1,914,026延伸到位置1,949,600。

在假结核耶尔森菌IP32953的pYV质粒序列中(质粒序列NC_006153，更具体而言NC_006153.2)可获得并鉴定示例性的假结核耶尔森菌yopK基因序列。例如，yopK序列从所述假结核耶尔森菌质粒序列的位置28,491延伸至位置29,039(互补序列)。

在假结核耶尔森菌株IP32953的基因组序列中(基因组序列NC_006155，更具体而言NC_006155.1)可获得并鉴定示例性的假结核耶尔森菌psaA基因序列。例如，psaA序列从所述基因组序列的位置1,588,872延伸到位置1,589,348。

根据本申请的替代或者补充实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞被强烈减毒，例如通过口服途径其对小鼠的LD₅₀高于10¹⁰CFU。

所述假结核耶尔森菌细胞可以是死细胞或者活细胞。

根据本申请有利的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞是活细胞。根据本申请有利的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞保留在体外和/或体内复制的能力，例如在培养基如Luria Bertani肉汤(LB)介质上进行体外复制和/或在非人哺乳动物如鼠或在人中进行体内复制。

本申请的假结核耶尔森菌细胞包含编码至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽或者编码至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1的抗原性片段的核酸。

更具体地，本申请的假结核耶尔森菌细胞包含编码表面表达至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽或者表面表达鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段的核酸。

鼠疫耶尔森菌Caf1是由天然存在的鼠疫耶尔森菌细胞表达的多肽。

鼠疫耶尔森菌Caf1是形成病原体荚膜主要组成的单体亚基，即鼠疫耶尔森菌部分1抗原(F1)。

已知鼠疫耶尔森菌F1在鼠疫耶尔森菌中参与吞噬抗性。

天然存在的生物合成过程遵循伴侣蛋白/引领蛋白(chaperone/usher)通路，通过这一通路鼠疫耶尔森菌Caf1多肽从内膜输送到外膜，并且在细菌表面组装成低聚体形式，由此形成F1蛋白。

在周质中，伴侣蛋白(Caf1M)结合Caf1多肽并将其运送到外膜。伴侣蛋白:Caf1复合物然后被靶向至位于外膜的引领蛋白(Caf1A)，在外膜Caf1信号肽被切割并且成熟Caf1多肽连接在一起以形成不断增长的链，其随后穿过外膜易位至细菌的表面上。

切割信号肽之前，Caf1单体分子量(MW)约17.6kDa。

切割信号肽序列之后，成熟Caf1单体具有约15.5-16.5kDa的MW。计算得出的pI约4.3。

在细菌表面形成的Caf1低聚体通常具有高于1,000kDa的分子量。

基于它们利用甘油和还原硝酸盐(酯)的能力，鼠疫耶尔森菌可被分成至少三种生物型[古代型(Antiqua)(A)、中世纪型(Mediaevalis)(M)或者东方型(Orientalis)(O)]。

在本申请中，鼠疫耶尔森菌可以是任何生物型，例如A生物型、或者M生物型或者O生物型，例如M或O生物型，更具体地O生物型。

鼠疫耶尔森菌株是本领域普通技术人员可获得的，例如来自微生物的采集、来自商业来源或者通过分离自污染的有机体(例如来自被感染的人、或者来自被感染的非人动物或哺乳动物、或来自被感染的昆虫比如被感染的跳蚤)。

示例性的鼠疫耶尔森菌，例如包含：

-CO92株(O生物型)；

-KIM10+株(M生物型)；

-以n°NCTC 5923从NCTC可获得的鼠疫耶尔森菌株；

-以n°NCTC 2868从NCTC可获得的鼠疫耶尔森菌株；

-以n°NCTC 10329从NCTC可获得的鼠疫耶尔森菌株；

-以n°NCTC 10330从NCTC可获得的鼠疫耶尔森菌株；

用于从鼠疫耶尔森菌细胞中克隆caf1基因(和/或用于克隆caf1操纵子)的方法是已知的，并且是本领域普通技术人员可获得的。这种方法例如包括下文实施例中描述的那些。

示例性鼠疫耶尔森菌Caf1序列是：

-以登录号P26948可获得的序列(170个氨基酸)，其包含Caf1信号肽(头21个N端氨基酸)和成熟Caf1(氨基酸22-170)，即SEQ ID NO：10的序列，它是：

MKKISSVIAIALFGTIATANAADLTASTTATATLVEPARITLTYKEGAPITIMDNGNIDTELLVGTLTLGGYKTGTTSTSVNFTDAAGDPMYLTFTSQDGNNHQFTTKVIGKDSRDFDISPKVNGENLVGDDVVLATGSQDFFVRSIGSKGGKLAAGKYTDAVTVTVSNQ；或者

-对应的成熟Caf1蛋白序列，即SEQ ID NO：12的序列，它是删除了肽信号序列的SEQ IDNO：10，即：

ADLTASTTATATLVEPARITLTYKEGAPITIMDNGNIDTELLVGTLTLGGYKTGTTSTSVNFTDAAGDPMYLTFTSQDGNNHQFTTKVIGKDSRDFDISPKVNGENLVGDDVVLATGSQDFFVRSIGSKGGKLAAGKYTDAVTVTVSNQ

在鼠疫耶尔森菌caf操纵子(操纵子序列X61996.1)中可获得并鉴定编码鼠疫耶尔森菌Caf1的示例性序列。例如，caf1序列从所述鼠疫耶尔森菌caf操纵子序列的位置4618延伸到位置5130，即SEQ ID NO：9的序列(其编码SEQ IDNO：10的序列)，它是：

ATGAAAAAAATCAGTTCCGTTATCGCCATTGCATTATTTGGAACTATTGCAACTGCTAATGCGGCAGATTTAACTGCAAGCACCACTGCAACGGCAACTCTTGTTGAACCAGCCCGCATCACTCTTACATATAAGGAAGGCGCTCCAATTACAATTATGGACAATGGAAACATCGATACAGAATTACTTGTTGGTACGCTTACTCTTGGCGGCTATAAAACAGGAACCACTAGCACATCTGTTAACTTTACAGATGCCGCGGGTGATCCCATGTACTTAACATTTACTTCTCAGGATGGAAATAACCACCAATTCACTACAAAAGTGATTGGCAAGGATTCTAGAGATTTTGATATCTCTCCTAAGGTAAACGGTGAGAACCTTGTGGGGGATGACGTCGTCTTGGCTACGGGCAGCCAGGATTTCTTTGTTCGCTCAATTGGTTCCAAAGGCGGTAAACTTGCAGCAGGTAAATACACTGATGCTGTAACCGTAACCGTATCTAACCAATAA；

或者SEQ ID NO：11的序列(其编码SEQ ID NO：12的序列)，它是删除了信号肽序列的SEQ ID NO：9，即：

GCAGATTTAACTGCAAGCACCACTGCAACGGCAACTCTTGTTGAACCAGCCCGCATCACTCTTACATATAAGGAAGGCGCTCCAATTACAATTATGGACAATGGAAACATCGATACAGAATTACTTGTTGGTACGCTTACTCTTGGCGGCTATAAAACAGGAACCACTAGCACATCTGTTAACTTTACAGATGCCGCGGGTGATCCCATGTACTTAACATTTACTTCTCAGGATGGAAATAACCACCAATTCACTACAAAAGTGATTGGCAAGGATTCTAGAGATTTTGATATCTCTCCTAAGGTAAACGGTGAGAACCTTGTGGGGGATGACGTCGTCTTGGCTACGGGCAGCCAGGATTTCTTTGTTCGCTCAATTGGTTCCAAAGGCGGTAAACTTGCAGCAGGTAAATACACTGATGCTGTAACCGTAACCGTATCTAACCAATAA

所述鼠疫耶尔森菌Caf1的抗原性片段尤其包含那些Caf1片段，其保留了在人或者非人哺乳动物中诱导或者刺激细胞介导的免疫应答的能力，更具体地在人或者非人哺乳动物中诱导或者刺激T细胞的能力。

所述鼠疫耶尔森菌Caf1的抗原性片段还包含那些Caf1片段，当偶联至免疫原性载体时其显示所述能力，免疫原性载体如匙孔血蓝蛋白、鲎血蓝蛋白、牛血清白蛋白。

编码至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽及其输出机制或鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段的所述核酸，被包含在(更具体地，插入或者整合入)所述假结核耶尔森菌细胞的染色体中，更具体地在所述假结核耶尔森菌细胞的染色体DNA中。

根据本申请的实施方式，所述核酸稳定地包含在(更具体地，插入或者整合入)所述染色体或者染色体DNA中。

根据本申请的实施方式，所述核酸不可逆地包含在(更具体地，插入或者整合入)所述染色体或者染色体DNA中。

根据本申请的实施方式，所述核酸是稳定地和/或不可逆地包含在(更具体地，插入或者整合入)所述染色体或者染色体DNA中。

用于将所述核酸插入或者整合入所述假结核耶尔森菌细胞的染色体中的方法，更具体地用于将所述核酸稳定地和/或不可逆地插入或者整合入所述假结核耶尔森菌细胞的染色体中的方法是本领域普通技术人员可获得的。

示例性方法包括：

-逆转录病毒整合方法；

-转座子的方法。

有利的是，所述方法是转座子方法，更具体而言DNA转座子方法，更具体而言迷你转座子方法，更加具体地是Tn7迷你转座子方法。

示例性转座子方法包括载体或者递送质粒，其中待转座的核酸被插入转座子末端之间(例如，Tn7L和Tn7R之间，它们是Tn7迷你转座子的末端)。示例性转座子方法可以进一步包括携带转座酶基因(例如，Tn7易位基因tnsABCDE)的辅助质粒用于在目标染色体中插入转座子。

示例性转座子方法是例如如下描述的：

-在参考文献(2)中，即Choi等人2005，和/或

-如下实施例中，和/或

-图1中，和/或

-图2中，和/或

-在参考文献(10)中，即Grinter 1983，和/或

-在参考文献(11)中，即Barry等人1986，和/或

-在参考文献(12)中，即Bao等人1991，和/或

-在参考文献(13)中，即等人1999，和/或

-在参考文献(14)中，即Koch等人2001。

根据本申请有利的实施方式，编码至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽或鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段的所述核酸，通过核酸易位(nucleic acid transposition)被插入或者整合入所述假结核耶尔森菌细胞的染色体中，更具体地在所述假结核耶尔森菌细胞的染色体DNA中。

根据本申请有利的实施方式，至少一个携带caf操纵子的转座子被整合在所述假结核耶尔森菌细胞的染色体中。

根据本申请有利的实施方式，假结核耶尔森菌细胞的染色体包含所述编码核酸(例如，编码F1蛋白或者荚膜的鼠疫耶尔森菌操纵子)和两个转座子末端(例如Tn7L和Tn7R，它们是Tn7转座子和Tn7迷你转座子的末端)。

编码至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽(如编码F1蛋白或者荚膜的鼠疫耶尔森菌操纵子)或鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段的所述核酸，插入减毒的假结核耶尔森菌株的染色体中，如上述中的以及如下实施例和/或附图中的。

根据本申请的实施方式，编码至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽或鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段的所述核酸，是编码用于在所述遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞表面表达所述至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽或鼠疫耶尔森菌Caf1的所述至少一种抗原性片段的核酸。

所述至少一种表面表达的鼠疫耶尔森菌Caf1多肽包含于低聚体中，更具体而言包含在基本上由鼠疫耶尔森菌Caf1单体组成的低聚体中。

有利的是，所述低聚体是鼠疫耶尔森菌F1蛋白。

因此，所述至少一种表面表达的鼠疫耶尔森菌Caf1多肽例如可以被包含在或者以鼠疫耶尔森菌F1蛋白的形式表达。

所述至少一种表面表达的鼠疫耶尔森菌Caf1多肽例如可以作为包围所述假结核耶尔森菌细胞的荚膜的组分而被表达。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞表达或者能在其表面表达鼠疫耶尔森菌F1蛋白。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞表达或者能表达鼠疫耶尔森菌的荚膜，即鼠疫耶尔森菌F1荚膜。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞是被包囊的。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞被鼠疫耶尔森菌的荚膜或其组分所包围。

根据本申请的实施方式，所述假结核耶尔森菌细胞被抗鼠疫耶尔森菌F1的单克隆抗体所识别(即结合)，更具体地被抗鼠疫耶尔森菌F1的单克隆抗体(如Chanteau等人2003[参考文献3]中描述的单克隆抗体、或者以目录号n°18740(YBF19)可获自QED Bioscience，Inc.；10919Technology Place，Suite C，U.S.A.的单克隆抗体)所特异性识别(即结合)。

根据本申请的实施方式，编码所述至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽或者所述鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段(例如，至少一种鼠疫耶尔森菌F1蛋白，或者鼠疫耶尔森菌的荚膜)的所述核酸还包含一个或者更多基因)，更具体而言一个或者更多结构基因：

-按照伴侣蛋白/引领蛋白通路用于表达所述至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽或所述鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段(例如，至少一种鼠疫耶尔森菌F1蛋白，或者鼠疫耶尔森菌的荚膜)；和/或

-用于表面表达所述至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽或所述鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段(例如，至少一种鼠疫耶尔森菌F1蛋白，或者鼠疫耶尔森菌的荚膜)，更具体而言用于在所述假结核耶尔森菌细胞的表面上表达。

这样的其它基因例如能够是：

-至少一个基因，其编码能够作为所述至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1或抗原性Caf1片段的伴侣蛋白而发挥作用的蛋白，如鼠疫耶尔森菌Caf1M，和/或，更具体地以及

-至少编码如下蛋白的基因，所述蛋白能够作为所述至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1或抗原性Caf1片段的引领蛋白而发挥作用，如鼠疫耶尔森菌Caf1A。

作为替代或者补充，编码所述至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽或所述鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段(例如，至少一种鼠疫耶尔森菌F1蛋白，或者鼠疫耶尔森菌的荚膜)的所述核酸还包含至少一个调控序列，如鼠疫耶尔森菌caf1R调控序列，其控制至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽或所述鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段(例如，至少一种鼠疫耶尔森菌F1蛋白，或者鼠疫耶尔森菌的荚膜)的表达和/或所述其它基因的表达。

根据本申请的实施方式，编码所述至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽或所述鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段(例如，至少一种鼠疫耶尔森菌F1蛋白，或者鼠疫耶尔森菌的荚膜)的所述核酸是操纵子。

有利地，所述操纵子包含所述其它基因和/或所述至少一个调控序列，更具体而言所述其它基因和所述至少一个调控序列。

例如，所述操纵子能够包含至少一个编码(至少一个)鼠疫耶尔森菌Caf1或者至少一个抗原性Caf1片段的基因，更具体而言(至少一个)鼠疫耶尔森菌Caf1，以及：

-至少一个基因，其编码能够作为所述鼠疫耶尔森菌Caf1的伴侣蛋白而发挥作用的蛋白，如鼠疫耶尔森菌Caf1M，和/或，更具体地以及

-至少编码下述蛋白的基因，所述蛋白能够作为所述鼠疫耶尔森菌Caf1的引领蛋白而发挥作用，如鼠疫耶尔森菌Caf1A。

例如，所述操纵子有利地包括至少一个编码鼠疫耶尔森菌Caf1的基因、至少一个编码鼠疫耶尔森菌Caf1M伴侣蛋白的基因以及至少一个编码鼠疫耶尔森菌Caf1A引领蛋白的基因。

所述操纵子还可以包括调控序列，如鼠疫耶尔森菌caf1R调控序列，来控制所述基因的表达。

示例性操纵子被包含在来自鼠疫耶尔森菌株CO92的pMT1质粒(登录号AL117211；96，210bp)中，该质粒(尤其)编码鼠疫耶尔森菌F1蛋白。

示例性鼠疫耶尔森菌Caf1M蛋白序列是登录号P26926(258个氨基酸)的序列，即SEQ ID NO：14的序列，它是：

MILNRLSTLGIITFGMLSFAANSAQPDIKFASKEYGVTIGESRIIYPLDAAGVMVSVKNTQDYPVLIQSRIYDENKEKESEDPFVVTPPLFRLDAKQQNSLRIAQAGGVFPRDKESLKWLCVKGIPPKDEDIWVDDATNKQKFNPDKDVGVFVQFAINNCIKLLVRPNELKGTPIQFAEKLSWKVDGGKLIAENPSPFYMNIGELTFGGKSIPSHYIPPKSTWAFDLPKGLAGARNVSWRIINDQGGLDRLYSKNVTL

编码鼠疫耶尔森菌Caf1M蛋白的示例性序列是SEQ ID NO：13的序列[CDS(AL117211.1：82567..83343)]，它是：

ATGATTTTAAATAGATTAAGTACGTTAGGAATTATTACTTTCGGCATGCTTAGTTTTGCTGCGAACTCTGCTCAACCAGATATCAAATTCGCAAGCAAAGAGTATGGCGTGACTATAGGTGAGAGTAGGATCATATACCCGTTAGATGCTGCTGGCGTTATGGTCTCGGTGAAAAACACCCAAGATTATCCGGTTCTCATTCAGTCTAGGATCTACGACGAGAATAAAGAAAAAGAATCAGAGGATCCTTTCGTGGTCACTCCGCCATTGTTTCGATTGGATGCTAAGCAACAAAATTCTTTGCGTATAGCTCAGGCTGGAGGTGTTTTCCCGCGAGATAAAGAGAGCCTAAAGTGGTTATGCGTAAAAGGGATTCCACCAAAGGATGAAGATATATGGGTTGATGATGCGACAAATAAGCAAAAATTCAATCCAGACAAAGATGTGGGAGTGTTCGTGCAATTCGCAATTAATAATTGCATTAAGCTTTTGGTTCGACCGAATGAATTAAAAGGAACCCCTATACAGTTTGCTGAAAACTTAAGCTGGAAAGTTGATGGGGGGAAGCTAATTGCTGAAAACCCCTCACCTTTCTACATGAACATAGGTGAATTAACATTTGGAGGGAAAAGTATTCCTTCTCACTATATTCCACCTAAATCGACGTGGGCTTTTGATTTGCCAAAAGGACTAGCGGGAGCACGTAATGTTTCGTGGAGAATAATTAATGATCAGGGAGGGTTGGATCGTTTGTATTCCAAAAATGTGACTTTATGA

示例性鼠疫耶尔森菌Caf1A蛋白序列是登录号P26949的序列(833个氨基酸)，即SEQ ID NO：16的序列，它是：

MRYSKLFLCAGLTLATLPCWGRAYTFDSTMLDTNSGESIDVSLFNQGLQLPGNYFVNVFVNGRKVDSGNIDFRLEKHNGKELLWPCLSSLQLTKYGIDIDKYPDLIKSGTEQCVDLLAIPHSDVQFYFNQQKLSLIVPPQALLPRFDGIMPMQLWDDGIPALFMNYNTNMQTRKFREGGKSLDSYYAQLQPGLNIGAWRFRSSTSWWKQQGWQRSYIYAERGLNTIKSRLTLGETYSDSSIFDSIPIKGIKIASDESMVPYYQWNFAPVVRGIARTQARVEVLRDGYTVSNELVPSGPFELANLPLGGGSGELKVIIHESDGTKQVFTVPYDTPAVALRKGYFEYSMMGGEYRPANDLTQTSYVGVFGMKYGLPRNFTLYGGLQGSQNYHAEALGIGAMLGDFGAISTDVTQADSQKNKQKKESGQRWRVRYNKYLQSGTSLNIASEEYATEGFNKLADTLNTYCKPNTRNDCRFDYAKPKNKVQFNLSQSIPGSGTLNFSGYRKNYWRDSRSTTSFSVGYNHFFRNGMSLTLNLSKTQNINKYGEKTSELLSNIWLSFPLSRWLGNNSINSNYQMTSDSHGNTTHEVGVYGEAFDRQLYWDVRERFNEKGRKYTSNALNLNYRGTYGEISGNYSYDQTQSQLGIGVNGNMVITQYGITAGQKTGDTIALVQAPDISGASVGYWPGMKTDFRGYTNYGYLTPYREYKVEINPVTLPNDAEITNNIVSVIPTKGAVVLAKFNARIGGRLFLHLKRSDNKPVPFGSIVTIEGQSSSSGIVGDNSGVYLTGLPKKSKILVKWGRDKNQSCSSNVVLPEKTDISGAYRLSTTCILNN

编码鼠疫耶尔森菌Caf1A蛋白的示例性序列是SEQ ID NO：15的序列[CDS(AL117211.1：83368..85869)]，它是：

ATGAGGTATTCAAAGCTGTTCCTGTGTGCAGGGTTAACTTTGGCAACATTGCCTTGTTGGGGACGCGCATATACTTTTGACTCTACTATGCTTGATACGAATAGTGGAGAGAGTATAGATGTATCTCTTTTTAATCAAGGACTTCAACTTCCAGGTAATTATTTTGTTAATGTTTTTGTAAATGGTCGAAAGGTAGACTCTGGAAATATCGACTTCCGTCTAGAAAAACATAATGGAAAAGAACTTCTTTGGCCATGCCTATCATCCTTACAATTGACAAAGTATGGCATTGATATAGATAAATATCCTGATTTAATAAAATCTGGTACAGAGCAATGTGTTGATTTATTAGCAATACCACATTCAGATGTGCAGTTTTATTTTAATCAGCAGAAATTATCGTTAATTGTGCCACCACAGGCACTTTTACCTAGATTTGATGGCATTATGCCAATGCAATTGTGGGATGACGGCATTCCTGCTCTGTTCATGAATTATAATACGAACATGCAGACAAGAAAATTCAGAGAAGGAGGCAAGTCTCTGGACTCTTATTATGCTCAGTTGCAACCGGGATTAAACATAGGGGCTTGGCGCTTTCGTAGTTCAACCTCATGGTGGAAACAACAAGGATGG CAGCGTTCGTATATTTATGCCGAGCGAGGATTGAATACAATTAAGAGCCGTTTGACATTGGGGGAAACCTATTCTGATAGCAGTATCTTTGACAGTATCCCGATTAAGGGGATAAAAATTGCTTCAGATGAATCGATGGTTCCTTATTACCAATGGAATTTTGCTCCAGTTGTTCGCGGTATCGCACGTACACAAGCCAGGGTAGAGGTTTTAAGAGATGGCTACACTGTAAGTAATGAGTTGGTGCCCTCGGGACCATTTGAGTTAGCAAATCTTCCTCTGGGTGGGGGGAGTGGTGAGCTGAAAGTCATCATTCATGAAAGTGATGGAACAAAGCAAGTTTTTACAGTTCCATATGACACACCAGCAGTGGCATTACGGAAGGGCTATTTCGAATATTCAATGATGGGGGGAGAATATCGTCCAGCTAATGATCTTACACAAACATCGTATGTTGGCGCTCTTGGGATGAAATATGGTTTGCCAAGGAATCTTACGTTATATGGTGGACTACAAGGGTCCCAAAATTATCATGCCGCAGCTCTGGGTATCGGTGCTATGTTGGGTGATTTTGGTGCCATATCTACAGATGTTACTCAAGCAGACAGCCAGAAAAATAAACAAAAAAAAGAAAGCGGCCAACGTTGGCGCGTTCGATATAATAAGTACTTGCAGAGTGGAACATCGTTAAACATTGCTAGCGAGGAATACGCCACAGAAGGATTTAACAAACTCGCTGACACGTTAAATACTTATTGTAAACCTAATACTAGAAACGATTGCCGTTTTGATTATGCTAAACCCAAAAACAAAGTGCAATTCAATTTAAGTCAAAGCATACCTGGTTCGGGGACGCTTAATTTCAGTGGCTACAGAAAAAACTATTGGCGTGACAGTAGGAGCACAACTTCTTTTTCTGTAGGCTATAACCATTTTTTTAGGAATGGTATGTCATTGACTTTAAATTTATCGAAGACACAGAATATCAATAAGTATGGAGAAAAAACTAGTGAGCTATTATCTAATATCTGGTTGAGTTTTCCTCTCAGTCGCTGGCTAGGTAATAACTCAATAAATTCAAATTACCAAATGACATCAGATTCTCATGGTAACACTACCCATGAGGTAGGTGTGTACGGTGAAGCCTTTGATCGCCAATTATACTGGGACGTTCGCGAACGTTTTAATGAAAAGGGCAGAAAATATACCTCCAATGCACTGAATTTGAATTATCGAGGAACTTATGGGGAGATCAGTGGTAACTACAGCTACGATCAAACCCAAAGCCAACTTGGTATAGGTGTAAATGGCAATATGGTAATAACTCAGTACGGTATAACGGCTGGCCAAAAAACTGGAGATACTATTGCATTAGTACAAGCCCCTGATATAAGCGGTGCTTCAGTGGGATACTGGCCAGGCATGAAAACAGACTTTAGGGGGTACACCAATTATGGTTACTTAACCCCTTACAGAGAGAATAAGGTAGAAATTAACCCAGTTACTTTACCCAATGATGCAGAGATAACAAATAATATTGTTAGCGTGATCCCGACAAAGGGAGCTGTAGTATTAGCAAAATTTAACGCAAGGATTGGTGGACGATTGTTTTTACATTTAAAACGCTCTGACAATAAACCTGTTCCATTTGGTTCTATAGTTACCATTGAAGGGCAATCATCCAGCTCTGGCATTGTCGGAGATAATAGCGGTGTCTATTTGACTGGACTACCTAAAAAATCAAAAATACTTGTTAAGTGGGGGAGAGATAAAAATCAATCATGTTCATCTAATGTA GTTCTACCAGAAAAAACGGATATTTCTGGTGCTTATAGGTTATCCACAACCTGCATCTTAAATAACTGA

示例性鼠疫耶尔森菌Caf1R蛋白序列是登录号P26950的序列(301个氨基酸)，即SEQ ID NO：18的序列，它是：

MLKQMTVNSIIQYIEENLESKFINIDCLVLYSGFSRRYLQISFKEYVGMPIGTYIRVRRASRAAALLRLTRLTIIEISAKLFYDSQQTFTREFKKIFGYTPRQYRMIPFWSFKGLLGRREINCEYLQPRICYLKERNIIGQCFNFRDLVFYSGIDSKCRLGKLYDSLKKNTAITVSNRIPFHDKTNDIIARTVVWDRNKHFSDSEIKVDKGLYAYFFFNDTYDQYVHHMYNIYYNSLPIYNLNKRDGYDVEVIKRRNDNTIDCHYFLPIYCDDMEFYNEMQVYHNNIVKPEMSVTLGLPKS

编码鼠疫耶尔森菌Caf1R蛋白的示例性序列是SEQ ID NO：17的序列[互补(AL117211.1：81352..82257)]，它是：

ATGCTAAAACAGATGACTGTAAATTCAATTATTCAATATATAGAAGAGAATCTCGAGTCGAAATTCATTAACATTGACTGTTTGGTTTTGTATTCAGGATTCAGCAGAAGGTATTTGCAAATTTCCTTTAAGGAATATGTCGGAATGCCTATTGGAACATATATTAGAGTTAGAAGGGCTAGTAGAGCTGCTGCACTATTACGGCTTACCAGGCTGACAATAATAGAGATATCAGCAAAGCTTTTTTATGATTCGCAACAGACATTCACCAGAGAATTTAAGAAAATATTTGGTTATACCCCACGGCAGTATAGGATGATCCCTTTTTGGTCCTTTAAAGGTTTGTTGGGTAGAAGGGAAATTAACTGTGAATACCTTCAACCACGAATCTGTTACCTTAAAGAGAGAAATATAATTGGTCAATGCTTTAATTTTAGGGATTTAGTGTTCTACTCTGGGATAGATTCAAAATGTAGATTGGGTAAGTTATATGATTCGTTGAAGAAAAATACAGCTATAACAGTATCAAACAGAATCCCCTTTCATGATAAAACGAATGACATTATTGCAAGAACGGTTGTTTGGGATAGGAATAAGCATTTCAGCGATAGTGAAATAAAGGTAGATAAAGGCCTGTATGCTTATTTTTTCTTCAATGATACATATGATCAGTATGTTCATCACATGTACAACATATATTATAACTCTTTGCCTATTTATAATTTAAATAAGCGGGATGGTTACGATGTGGAGGTCATAAAAAGACGAAATGACAATACTATTGATTGTCATTATTTTCTCCCGATTTATTGTGATGACATGGAGTTTTACAATGAAATGCAGGTATATCACAATAATATTGTGAAGCCGGAAATGTCAGTAACATTAGGATTACCAAAGAGTTAA

根据实施方案，所述核酸包含至少一个编码(至少一个)鼠疫耶尔森菌Caf1或者至少一个抗原性Caf1片段的基因，更具体而言(至少一个)鼠疫耶尔森菌Caf1，以及(例如，组织在一个操纵子中)：

-至少一个编码SEQ ID NO：14的鼠疫耶尔森菌Caf1M蛋白的基因，如SEQ ID NO：13的鼠疫耶尔森菌caf1M核酸，和/或，更具体地以及

-至少编码SEQ ID NO：16的鼠疫耶尔森菌Caf1A蛋白的基因，如SEQ ID NO：15的鼠疫耶尔森菌caf1A核酸。

-至少编码SEQ ID NO：16的鼠疫耶尔森菌Caf1A蛋白的基因，如SEQ ID NO：15的鼠疫耶尔森菌caf1A核酸，和/或，更具体地以及

-至少编码SEQ ID NO：18的鼠疫耶尔森菌Caf1R蛋白的基因，如SEQ ID NO：17的鼠疫耶尔森菌caf1R核酸。

根据一个实施方式，本申请涉及一种无毒力的假结核耶尔森菌细胞，更具体地涉及遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其源自假结核耶尔森菌细胞，更具体地源自假结核耶尔森菌株IP32953的细胞(其染色体序列是以登录号NC_006155可获得的序列)，通过如下：

-删除或者失活选自HPI、yopK和psaA的一个或者更多基因(如上述和/或如下所示)，以及通过

-染色体插入编码用于在所述假结核耶尔森菌细胞的表面上表达至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽或抗原性片段的所述核酸(如上述和/或如下所示)。

本申请还涉及多个细胞，其包含至少一种本申请的假结核耶尔森菌细胞，以及涉及一种假结核耶尔森菌株，其包含至少一种本申请的细胞，或者其由或者基本上由本申请的细胞组成。

本申请还涉及假结核耶尔森菌株，其中超过50％，更具体而言超过55％，还更具体而言超过60％，还更具体而言超过65％，还更具体而言超过70％，还更具体而言超过75％，还更具体而言超过80％，还更具体而言超过85％，还更具体而言超过90％，还更具体而言超过95％的所述株的细胞被鼠疫耶尔森菌的假荚膜所包囊。

有利地，所述假结核耶尔森菌株是如本文所述和/或所示的无毒力的假结核耶尔森菌株。所述假结核耶尔森菌株可以由或者基本上由本申请的细胞组成。

本申请还涉及所述细胞、所述多个细胞以及所述株，用作免疫原，更具体而言用作抗鼠疫的免疫原，还更具体而言抗淋巴腺鼠疫和/或肺鼠疫，还更具体而言抗淋巴腺鼠疫或肺鼠疫，还更具体而言抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫。

在本申请中，编码所述至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽(例如，鼠疫耶尔森菌F1蛋白或者荚膜)或者所述至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1的抗原性片段的所述核酸或者操纵子，更具体而言编码其表面表达的所述核酸或者操纵子，被插入(或者整合入)假结核耶尔森菌的染色体中。

所述核酸或者操纵子的染色体插入出乎意料地导致更高水平的抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的保护，更具体地是抗淋巴腺鼠疫。

例如，单次口服疫苗接种活的、减毒的假结核耶尔森菌，在其中鼠疫耶尔森菌F1操纵子插入到染色体中，能够实现：

用3,300xLD₅₀鼠疫耶尔森菌攻击之后，100％的抗肺鼠疫保护，以及

用100xLD₅₀鼠疫耶尔森菌攻击之后，100％的抗淋巴腺鼠疫保护[LD₅₀＝50％致死量]。

通过比较，当鼠疫耶尔森菌F1操纵子没有插入假结核耶尔森菌染色体时，但通过包含在假结核耶尔森菌中的质粒而提供时，在相同的实验条件下，疫苗接种的保护是：

用3,300xLD₅₀鼠疫耶尔森菌攻击之后，80％的抗肺鼠疫，以及

用100xLD₅₀鼠疫耶尔森菌攻击之后，81％的抗淋巴腺鼠疫的保护。

认为通过本申请的方法所达到的抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的保护水平是以往报道的最高效之一，并且可能是最高效的。

本申请的细胞可以同免疫佐剂一起使用或者不同免疫佐剂一起使用，更具体而言同佐剂一起使用，佐剂加速、延长、或者增强对本申请假结核耶尔森菌细胞表面表达的鼠疫耶尔森菌多肽或者蛋白的免疫反应的质量。

免疫佐剂是本领域的普通技术人员已知的。示例性免疫佐剂包括弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Ribi佐剂系统、基于铝盐的佐剂(例如，明矾)和/或脂质体、细菌LPS。

有利的是，可以使用没有免疫佐剂的本申请的细胞。

可通过本领域普通技术人员可发现的任何合适途径施用所述细胞、所述多个细胞或所述株。

根据本申请的实施方式，所述施用途径是一种非侵入性的途径，更具体地是一种不需要使用任何套管或者其它高度侵入设备的途径。

根据本申请的实施方式，所述施用途径是口服途径、鼻内途径、皮下途径、皮内途径、肌肉内途径。

根据本申请的实施方式，所述施用途径是一种非口服途径，更具体而言鼻内途径、皮下途径、皮内途径、肌内途径，更具体而言是皮下途径。

根据本申请的实施方式，通过喷雾(例如，鼻和/或口腔喷雾)和/或通过注射(例如，皮下和/或肌内注射)施用所述细胞、多个细胞或株，更具体而言通过注射(例如，皮下和/或肌内注射)，更具体而言通过皮下注射。

此外，当经由口服途径以外的途径施用疫苗接种的细胞或者株时，更具体地经由皮下施用时，所述核酸或者操纵子的染色体插入可能导致特别高的疫苗接种效果。通过这样的非口服，需要更低剂量来实现相同的疫苗接种效果和/或相同的剂量实现对抗更高鼠疫耶尔森菌剂量的保护。

可按照本领域普通技术人员发现的任何合适剂量施用所述细胞、所述多个细胞或所述株，同时要考虑预期的施用途径并考虑预期接受者的年龄、体重和健康状况。

根据本申请的实施方式，以足以在接受者有机体内，更具体而言在人或者非人动物或者非人哺乳动物中，诱导免疫应答的剂量施用所述细胞、多个细胞或者株。

例如，所述免疫应答可以包括体液应答和/或细胞介导的免疫反应，有利的是体液应答和细胞介导的免疫应答。

根据本申请的实施方式中，施用所述细胞、多个细胞或者株的剂量，足以诱导两种免疫应答，以及在系统水平(例如，IgG和Th1细胞)和粘膜水平(例如，IgA和Th17细胞)的细胞介导的免疫应答。

本申请还涉及一种组合物，更具体而言涉及一种药物组合物，还更具体而言一种免疫原性组合物或者疫苗，其包含至少一种如下元素：

-至少一种本申请的细胞，

-至少一种本申请的多个细胞，

-至少一种本申请的假结核耶尔森菌株。

根据本申请的实施方式，所述组合物、药物组合物、免疫原性组合物或者疫苗是喷雾、小瓶或者预充式注射器，更具体而言是小瓶或者预充式注射器，更具体而言是小瓶，更具体而言，是适于存储可注射产品以及将所述产品从所述小瓶无菌递送至注射器的密封小瓶(例如，通过隔膜或者通过隔膜和盖密封的小瓶)。

所述组合物，更具体而言药物组合物，还更具体而言免疫原性组合物或者疫苗，可以进一步包含至少一种药学和/或生理上可接受的载体(稀释剂、赋形剂、添加剂、pH调节剂、乳化剂或者分散剂、防腐剂、表面活性剂、胶凝剂、以及缓冲剂和其它稳定剂和增溶剂等)，更具体而言至少一种适于疫苗施用至人或者非人动物或者非人哺乳动物的载体。

合适的药学上可接受的载体和制剂包括所有已知的药学上可接受的载体和制剂，例如“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”第20^th版，Mack PublishingCo.；以及“Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems"Ansel,Popovichand Allen Jr.,Lippincott Williams and Wilkins中描述的那些。

在一般情况下，载体的性质将取决于所用的特定施用模式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射液体，其包含药学上和生理学上可接受的液体，包括水、生理盐水、平衡盐溶液、缓冲液、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇、芝麻油、其组合、或者等等作为载体。介质还可以含有常规的药物辅助材料如，例如药学上可接受的盐以调节渗透压、缓冲液、防腐剂等。载体和组合物可以是无菌的，并且制剂适合施用的模式。

一种本申请组合物、药物组合物、免疫原性组合物或者疫苗可以例如是液体溶液、悬浮液、乳液、持续释放制剂、或者粉末。

所述组合物，更具体地所述药物组合物，还更具体而言是所述免疫原性组合物或者疫苗，还可包含免疫佐剂，例如上述。但是，本申请的细胞、多个细胞和株的有利特征是不一定需要这样的佐剂来诱导保护作用。

本申请还涉及一种治疗有此需要的受试者例如人、非人动物或者非人哺乳动物的方法，其包括向所述受试者，更具体而言以足以诱导如上所述的免疫应答的剂量，施用至少一种本申请的细胞、多个细胞或株。

本申请涉及一种用于预防或者治疗哺乳动物中鼠疫耶尔森菌感染的方法，其包括向所述哺乳动物施用至少一种本申请的无毒力假结核耶尔森菌细胞、多个细胞或株，更具体而言至少一种本申请的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞、多个细胞或株。可以向所述哺乳动物以足以诱导如上述的免疫应答的剂量施用所述至少一种本申请的无毒力的或者遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞、多个细胞或者株，更具体而言以单次的单位剂量。所述哺乳动物可以是人或者非人哺乳动物，更具体而言是人。

本申请还涉及一种施用抗鼠疫免疫原性组合物或者疫苗的方法，其包括施用至少一种本申请的细胞、多个细胞或者株，或者至少一种组合物、药物组合物、免疫原性组合物或者疫苗。

本申请的细胞、多个细胞、株、组合物、药物组合物、免疫原性组合物、疫苗都更特别适合施用至：

-人，其处于待接触或者暴露于鼠疫耶尔森菌的风险，更具体而言实验室的研究人员、医生、健康治疗师、在医学分析实验室当中或者为医学分析实验室工作的人、在军队中或者为军队工作的或者在军事环境中工作的人；

-非人动物，更具体而言是非人哺乳动物，更具体而言是啮齿动物，还更具体地是大鼠或者小鼠。

本申请还涉及用途，更具体地涉及假结核耶尔森菌细胞作为宿主细胞用于表达至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽或者鼠疫耶尔森菌Caf1的至少一种抗原性片段的体外用途，其中编码所述至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽的核酸被包含在所述假结核耶尔森菌细胞的染色体中。

在本申请中，CNCM是指国家培养物和微生物保藏中心。CNCM的地址是：法国；巴黎75724邮编15；Dr Roux大街，28号；巴斯德研究所；国家培养物和微生物保藏中心(CNCM)。

在本申请中，CRBIP是指巴斯德研究所生物资源中心。CRBIP的地址是：法国；巴黎75015；Docteur Roux大街25-28；生物资源中心；巴斯德研究所。

在本申请中，NCTC是指国家典型培养物保藏中心。NCTC的地址是：英国；SP40JG；索尔兹伯里；波顿镇；微生物服务机构；健康保护局；健康保护局培养物保藏中心。

在本申请中，DSMZ是指德国微生物和细胞培养物保藏中心GmbH。DSMZ的地址是：德国；布伦瑞克D-38124；Inhoffenstr 7B；莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心。

在本申请中，ATCC是指美国典型培养物保藏中心。ATCC的地址是：美国；弗吉尼亚20110-2209；马纳萨斯；大学大道10801；美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

在本申请中，除非另有规定或者除非上下文另有指明，所有的术语具有相关领域中的普通含义。

术语“包含”，是“包括”或者“含有”的同义词，是开放式的，并且不排除其它、未记载的元素、成分或者方法步骤，而术语“由...组成”是封闭的术语，不包括未明确记载的任何其它元素、步骤或者成分。

术语“基本上由...组成”是部分开放式术语，并不排除其它、未记载的元素、步骤或者成分，只要这些其它元素、步骤或者成分不实质上影响本发明的基本和新颖特性。

因此术语“包含”(或“包括”)包括术语“由...组成”(“由组成”)以及术语“基本上由...组成”(“基本上由组成”)。因此，在本申请中术语“包含”(或“包括”)更具体而言意图涵盖术语“由...组成”(“由组成”)以及术语“基本上由...组成”(“基本上由组成”)。

为了帮助本申请的读者，说明书被分成多个段落或章节和/或多个实施方式。这些分开的部分不应认为是段落或章节和/或实施方式的内容脱离于另一段落或章节和/或另一实施方式的内容。与此相反，本申请包括所考虑的各个章节、段落和句子的所有组合。本申请包括此处所述各个实施方式的所有组合。

此处引用的所有参考文献的每个相关公开通过参考特意并入此处。以说明的方法提供下列实施例，而不是通过限制的方式。

实施例

实施例1：

我们生产了假结核耶尔森菌株，所述假结核耶尔森菌株既是无毒力的也是遗传上确定的用作抗鼠疫的疫苗。为此，我们通过删除编码三个重要毒力因子的基因(高致病岛、YopK和pH6Ag/PsaA)不可逆地对假结核耶尔森菌IP32953株进行了减毒。

我们在质粒中克隆了编码鼠疫耶尔森菌F1的caf操纵子，并将其引入减毒的假结核耶尔森菌株，从而产生减毒的假结核耶尔森菌株的包囊衍生物。所得的株命名为V674pF1(1)，在体外和体内产生F1荚膜。口服接种V674pF1允许肠道定植，而不会引起派伊尔斑和脾脏的病变。疫苗接种V674pF1在系统(IgG和Th1细胞)和粘膜水平(IgA和Th17细胞)诱导免疫的体液和细胞成分。单口服剂量(10⁸CFU)保护100％的动物抵抗肺鼠疫(攻击剂量10⁵CFU，即33xLD₅₀)以及更高剂量时(10³CFU，即3,300xLD₅₀)94％的保护(1)。

然而，这种疫苗接种规程仅保护81％的动物抵抗低攻击剂量(10³CFU，即100xLD₅₀)的淋巴腺鼠疫(参见下面的结果和图7A)。此外，我们观察到F1荚膜的生产不稳定。

我们使用Tn7迷你转座子，通过将编码F1的鼠疫耶尔森菌caf操纵子插入减毒假结核耶尔森菌株的染色体产生包囊衍生物的另一种形式。比较所得的命名为V674TnF1的株，和株V674pF1的F1生产稳定性、株的潜在残留毒力和保护效果。

伦理

动物被饲养在由法国农业部认可的巴斯德研究所动物机构在活小鼠上进行实验(认证资格B 7515-01，发布于2008年5月22日)，符合关注实验室动物保护的法国和欧洲法规(ED指令86/609，发布于2001年6月6日的法国法律2001-486)。由巴斯德研究所动物机构的兽医人员批准规程，并且按照2007年2月7日发布的NIH动物福利保险#A5476-01进行规程。

鼠疫耶尔森菌株

鼠疫耶尔森菌株CO92是东方生物型的野生型株(5)。

可以以登录号AL590842获得鼠疫耶尔森菌株CO92的全基因组序列。此外，鼠疫耶尔森菌株CO92包含三个质粒：pMT1(又名pFra；登录号AL117211)、pCD1(又名pYV；登录号AL117189)、以及pPCP1(又名pPLa；登录号AL109969)。质粒pMT1包含caf操纵子并编码F1荚膜。

假结核耶尔森菌株

假结核耶尔森菌IP32953株是野生型血清型I株(6)。以NC_006155从NCBI可获得假结核耶尔森菌IP32953的全基因组序列。

通过电穿孔将质粒pKOBEG-sacB引入株IP32953生产株IP32953p(7)。载体pKOBEG-sacB(8)包含在阿拉伯糖诱导的pBAD启动子控制下表达的Red操纵子和固化质粒所需的sacB基因(8、9)。

如(1)中所述，株V674通过删除HPI、yopK和psaA产生自株IP32953p。

V674TnF1的构建和F1荚膜生产的验证

caf基因座的克隆：

在迷你转座子Tn7中克隆鼠疫耶尔森菌caf基因座按照如下进行：

通过PCR用引物A(5'-ATAAGAATGAATTCGTGACTGATCAA TATGTTGG-3'；SEQ ID NO：1)和B(5'-CGTTAGGGCCCGTCAGTCTTGCTAT CAATGC-3'；SEQ ID NO：2)扩增编码鼠疫耶尔森菌F1荚膜的5kb的caf基因座，在基因座的末端添加ApaI和EcoRI位点。将PCR产物连接到pUC18R6KTn7-Cm^R质粒携带的迷你转座子Tn7中的相应位点(图1)，产生质粒pUC18R6KTn7-Cm^R-caf。通过PCR使用caf1基因内部的引物157A(5’-CAGGAACCACTAGCACATC-3’；SEQ IDNO:3)和157B(5’-CCCCCACAA GGTTCTCAC-3’；SEQ ID NO:4)验证caf基因座的存在。

将caf基因座插入假结核耶尔森菌的染色体

为了将caf基因座插入假结核耶尔森菌V674染色体，我们使用迷你Tn7工具(2)。质粒pUC18R6KTn7-Cm^R-caf和pTNS2(转座酶提供者)一起使用来电穿孔假结核耶尔森菌疫苗株V674(1)，并且在含有氯霉素的LB琼脂板上选择转座体(transposant)。

使用两对引物：针对左侧接合处(junction)的744(5’-CACAGCATAACTGGACTGATTTC-3’；SEQ ID NO:5)和747(5’-GCTATACGTGTTTGCTGATCAAGATG-3’；SEQ ID NO:6)，以及针对右侧接合处的745(5’-ATTAGCTTACGACGCTACAC CC-3’；SEQ ID NO:7)和746(5’-ACGCCACCGGAAGAACCGATACCT-3’；SEQ ID NO:8)，通过PCR验证包含caf基因座的转座子(命名为“迷你Tn7-caf-Cm^R转座子”，图2)的存在。在其染色体中包含Tn7-caf-Cm^R区域的重组假结核耶尔森菌株命名为V674TnF1。

由于重组V674TnF1不带有编码转座酶的质粒，不会发生通过移位(transposition) 进行的Tn7-caf-Cm^R区域切除。

F1荚膜生产的验证

为了评估重组V674TnF1疫苗的F1荚膜生产，在37℃在LB肉汤中培养株，在细胞悬浮液中进行F1的试纸(dipstick)测试(3)。如图3中所示，用CO92(阳性对照)观察到和阳性鼠疫耶尔森菌对照相同位置的条带，而用V674亲本株(阴性对照)没有检测到信号，从而表明V674TnF1合成F1荚膜。

为了进一步观察F1荚膜，我们显微镜检验了在37℃生长的V674TnF1株。V674TnF1细菌细胞周围所排斥的印度墨(India ink)证实了荚膜的存在(图4)。

此外，所有的细菌细胞被晕所包围，这表明不同于V674pF1，所有的细菌产生F1荚膜。在LB中进行两次亚培养后，所有的细菌细胞不断产生F1。因此，在V674TnF1中F1的合成比V674pF1更稳定。

毒力的减弱

已通过遗传工程通过删除三个毒力因子(高致病岛、pH6Ag/PsaA菌毛和YopK因子)修饰了用于构建V674pF1和V674TnF1的V674株以减弱其毒力(1)。

胃内施用后测试V674pF1和V674TnF1株的毒力。在两种情况下，LD₅₀>10¹⁰CFU，表明很强的毒力衰减。然而，我们注意到胃内疫苗接种后偶发的小鼠死亡，这与所用的疫苗剂量不相关(见下文表1)，并且最有可能是因为用于施用疫苗的胃内导管造成的意外损伤。

皮下(SC)施用后测试V674TnF1株的毒力。皮下注射剂量高达10⁹CFU的V674TnF1株后，未见死亡。在所有疫苗接种有10⁹CFU的V674TnF1的小鼠中观察到皮疹，在10⁸CFU时约50％以及在10⁷CFU时<10％。

表1:

通过口服接种的V674TnF1在小鼠中的持续性

口服接种10⁸或者10⁹CFU后，在D20天8只小鼠中仅有3只在排泄物中检测到V674TnF1细菌细胞，并且仅在使用了10⁹CFU的疫苗剂量(图5A)，表明疫苗从肠腔相对快速的清除。

在派伊尔斑(Peyer’s patch)和脾脏中，5天后检测到V674TnF1，但无论施用剂量如何在15天后都被清除(图5B和5C)。

与此相反，D15天在1/5小鼠的派伊尔斑和脾脏中仍然可检测到V674pF1细菌细胞，表明V674TnF1比V674pF1株更迅速地从接种的动物清除。

总之，我们的观察表明口服施用的V674TnF1能够定植肠道、派伊尔斑和脾脏，但是这种定植仅仅是短暂的，D15之前细菌从深部的器官清除。

赋予抗淋巴腺和肺形式鼠疫的保护

为了评估和比较V674pF1和V674TnF1的保护效果，疫苗接种小鼠，并在一个月后用全毒力的鼠疫耶尔森菌株CO92鼻内(IN，肺鼠疫)或者皮下(SC，淋巴腺鼠疫)感染(4)。对于每种感染途径，用中度和高剂量的全毒力鼠疫耶尔森菌株CO92，测试两种CO92的致命攻击。

表2:

口服疫苗接种

-抗肺鼠疫的保护：

10⁷CFU剂量的V674pF1或者V674TnF1株不能赋予抗中度的鼠疫耶尔森菌IN攻击的充分保护(图6A)。

与此相反，10⁸CFU剂量的各株保护100％的动物对抗相似的攻击(图6A)。

由于10⁸CFU的剂量是有效的，测试了重度的细菌攻击(图6B)。高度攻击之后，只有80％的疫苗接种有V674pF1的小鼠存活，而疫苗接种有V674TnF1的所有动物存活。

我们的结果表明V674TnF1比V674pF1更高的保护效果，并表明即使暴露于高载量的鼠疫耶尔森菌，V674TnF1的单次口服剂量足以充分保护对抗肺鼠疫。

-保护对抗淋巴腺鼠疫：

单次口服施用10⁷CFU的V674pF1或V674TnF1不足以获得100％的抗鼠疫耶尔森菌中度SC攻击的保护(图7A)。

在10⁸CFU的剂量下，V674pF1赋予86％的保护，而V674TnF1保护100％的经疫苗接种的小鼠(图7A)。

当攻击剂量增加到10,000xLD₅₀时，单次口服施用10⁸CFU的V674TnF1仍然保护93％的动物(图7B)。

因此，在抗淋巴腺鼠疫的保护方面，V674TnF1比V674pF1更有效。

总之，我们的结果表明，单次口服接种10⁸CFU的V674TnF1在疫苗接种小鼠以对抗肺鼠疫和淋巴腺鼠疫方面是非常高效的，甚至当用非常高剂量的全毒力鼠疫耶尔森菌株CO92攻击动物时。

皮下疫苗接种

由于疫苗接种有V674TnF1的15只小鼠中有一只在重度SC攻击之后没有存活，我们考虑是否有可能通过另一种疫苗接种途径提高甚至促进保护。

-SC疫苗接种后的抗肺鼠疫保护

为了测试SC接种V674TnF1的保护效果，注射10⁵到10⁹CFU的单次疫苗剂量，用鼠疫耶尔森菌CO92的高IN接种物(10⁷CFU＝3,300×LD₅₀)攻击动物。用10⁷CFU和更高的疫苗剂量获得充分的保护(图8)。

-SC疫苗接种后的抗淋巴腺鼠疫保护

然后评估单次SC注射V674TnF1(10⁷或者10⁸CFU)所赋予的抗淋巴腺鼠疫(重度攻击：10,000xLD₅₀)保护。

用任一剂量单次疫苗接种保护100％的动物对抗SC施用的鼠疫耶尔森菌CO92的重度攻击剂量(10,000x LD₅₀)(图9)，这表明效率高于抗淋巴腺鼠疫的口服疫苗接种。

结论

在染色体中插入编码鼠疫耶尔森菌荚膜抗原F1的操纵子的V674TnF1假结核耶尔森菌株，是一种抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的高效疫苗。

V674TnF1假结核耶尔森菌株尤其具有以下优点：

-遗传稳定性：V674TnF1是其基因组比鼠疫耶尔森菌的基因组更稳定的假结核耶尔森菌株；

-无毒：因为不可逆地删除不同毒力机制所必须的三个基因：粘附(pH6Ag/PsaA)、铁的捕获(HPI)、Yop毒素的分泌(YopK)，V674TnF1是高度减毒的；

-容易制造：一旦开发和验证，活疫苗并不需要复杂的设备和技术来生产；

-免疫原性：因为细菌抗原(LPS和其它病原体相关的标志)触发固有免疫系统，因此不需要佐剂；除了鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌的常见抗原，V674TnF1稳定地生产F1荚膜，这是抗鼠疫耶尔森菌的主要疫苗靶；

-能够通过两种途径进行疫苗接种：根据上下文，优选SC或者口服途径的疫苗接种。

此外，V674TnF1具有非常高的疫苗效果。甚至当暴露于非常高剂量的鼠疫杆菌时，疫苗接种有V674TnF1的动物被充分保护对抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫。

相反的是，V674pF1实现了较低的疫苗效果，更具体而言在淋巴腺鼠疫方面。

据我们所知，通过单次剂量V674TnF1疫苗所赋予的抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的保护水平是以往报道的最高效之一，并且可能是最高效的。

我们还观察到，令人惊讶地V674TnF1比V674pF1更迅速地从接种动物的肠道清除，并且根据预防或紧急治疗的预期用途，V674TnF1的皮下或者口服施用是高效的施用途径。

参考文献

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Claims

1.一种遗传减毒的假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)细胞，其中删除或者失活HPI基因、yopK基因和psaA基因中的全部，其中编码在所述假结核耶尔森菌细胞的表面上表达的至少一种鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)Caf1多肽的核酸被整合到所述假结核耶尔森菌细胞的染色体中，并且其中至少一个携带caf操纵子的转座子被整合到所述假结核耶尔森菌细胞的染色体中。

2.根据权利要求1所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其是活细胞或者是死细胞。

3.根据权利要求1或2所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其表达至少一种表面表达的低聚体形式的鼠疫耶尔森菌Caf1。

4.根据权利要求1-2任一项所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，在其表面上表达鼠疫耶尔森菌F1蛋白。

5.根据权利要求3所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，在其表面上表达鼠疫耶尔森菌F1蛋白。

6.根据权利要求1-2任一项所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其被鼠疫耶尔森菌的荚膜所包围。

7.根据权利要求3所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其被鼠疫耶尔森菌的荚膜所包围。

8.根据权利要求4所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其被鼠疫耶尔森菌的荚膜所包围。

9.根据权利要求5所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其被鼠疫耶尔森菌的荚膜所包围。

10.根据权利要求1-2任一项所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其源自假结核耶尔森菌IP 32953株的细胞，所述假结核耶尔森菌IP 32953株染色体序列是以登录号NC_006155公开的序列，其中所述假结核耶尔森菌IP 32953株通过以下修饰：

-删除或者失活HPI基因、yopK基因和psaA基因中的全部，以及通过

-染色体插入编码用于在所述假结核耶尔森菌细胞的表面上表达至少一种鼠疫耶尔森菌Caf1多肽的核酸。

11.根据权利要求3所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其源自假结核耶尔森菌IP32953株的细胞，所述假结核耶尔森菌IP 32953株染色体序列是以登录号NC_006155公开的序列，其中所述假结核耶尔森菌IP 32953株通过以下修饰：

12.根据权利要求4所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其源自假结核耶尔森菌IP32953株的细胞，所述假结核耶尔森菌IP 32953株染色体序列是以登录号NC_006155公开的序列，其中所述假结核耶尔森菌IP 32953株通过以下修饰：

13.根据权利要求5所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其源自假结核耶尔森菌IP32953株的细胞，所述假结核耶尔森菌IP 32953株染色体序列是以登录号NC_006155公开的序列，其中所述假结核耶尔森菌IP 32953株通过以下修饰：

14.根据权利要求6所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其源自假结核耶尔森菌IP32953株的细胞，所述假结核耶尔森菌IP 32953株染色体序列是以登录号NC_006155公开的序列，其中所述假结核耶尔森菌IP 32953株通过以下修饰：

15.根据权利要求7所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其源自假结核耶尔森菌IP32953株的细胞，所述假结核耶尔森菌IP 32953株染色体序列是以登录号NC_006155公开的序列，其中所述假结核耶尔森菌IP 32953株通过以下修饰：

16.根据权利要求8所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其源自假结核耶尔森菌IP32953株的细胞，所述假结核耶尔森菌IP 32953株染色体序列是以登录号NC_006155公开的序列，其中所述假结核耶尔森菌IP 32953株通过以下修饰：

17.根据权利要求9所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞，其源自假结核耶尔森菌IP32953株的细胞，所述假结核耶尔森菌IP 32953株染色体序列是以登录号NC_006155公开的序列，其中所述假结核耶尔森菌IP 32953株通过以下修饰：

18.根据权利要求1-17任一项所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞在制备用作抗淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的免疫原的试剂中的用途。

19.根据权利要求18所述的用途，其中通过口服、皮下、皮内、鼻内、或者肌肉内施用来施用所述免疫原。

20.一种免疫原性组合物或者疫苗，其包含至少一种权利要求1-17任一项所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞。

21.根据权利要求20所述的免疫原性组合物或者疫苗，其包含单次单位剂量的权利要求1-17任一项所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞。

22.根据权利要求20或21所述的免疫原性组合物或者疫苗，其配制成用于口服、皮下、皮内、鼻内、或者肌肉内施用。

23.根据权利要求1-17任一项所述的遗传减毒的假结核耶尔森菌细胞、或者根据权利要求20-22任一项所述的免疫原性组合物或者疫苗在制备用于治疗或预防哺乳动物中鼠疫耶尔森菌感染的药物中的用途。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述哺乳动物是人。