CN104758286A - 1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的载体在制备用于预防或治疗与NEDD8激活酶异常有关疾病的药物中的应用。特别涉及1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶在制备抗肿瘤药物中的应用。药理结果显示，该化合物具有良好的NEDD8抑制活性、抗肿瘤细胞增殖作用、促进肿瘤细胞凋亡作用及体内抗肿瘤活性，是临床上可用于制备治疗肿瘤的药物。

Description

1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是一大类严重危害人类健康的常见多发疾病，其致死率高，仅次于心脑血管疾病。据世界卫生组织统计，2012年全世界约有820万人死于癌症，预计2030年因癌症死亡的人数将超过1100万。中国是癌症发病率和病死率较高的国家，每年因此造成的经济损失高达数千亿元，并且随着人口老龄化、生态及生活环境的恶化，这种趋势更有可能加剧。因此，寻找治疗肿瘤的有效药物备受关注。

在真核细胞中，泛素蛋白酶体系统(UPS)负责蛋白质的降解，并在维持细胞内蛋白质动态平衡中担当重要角色。UPS的底物蛋白参与诸如细胞周期调节、细胞生长及增殖、信号传导、DNA修复及细胞凋亡信号传导过程。因此，UPS失调则会导致一些信号通路的异常激活或抑制，进而可能发展成为肿瘤或其他相关疾病。在UPS中，泛素首先由泛素激活酶(E1)ATP依赖性激活；其次通过转硫醇作用转移至泛素结合酶(E2)上，形成泛素-E2复合物；然后在泛素连接酶(E3)的作用下转移至待降解底物的赖氨酸残基上；最后底物蛋白被多个泛素修饰后，经蛋白酶体26S识别并降解。

泛素化过程的3个酶中，E3具有严格的底物特异性。目前已知RING-finger E3s(CRLs)是UPS E3中最大的一个蛋白家族。它的底物蛋白包括很多与肿瘤相关的细胞调控蛋白,如Cdt-1,p27,pIκBα,NRF2,HIF-1α,Cyclin E,c-Jun,J-catenin,Cdc25A,Emi1,c-Myc,mTOR,BimEL等(Genes&Cancer.2012,1:708–716)。经研究发现只有当CRLs被一个类泛素NEDD8修饰后才具有催化活性(Mol Cell Biol 2000,20:2326–2333)。

NEDD8是由81个氨基酸残基组成的蛋白质，与泛素有60％的一致性和80％同源性。它通过级联酶促反应特异性与待修饰蛋白结合的过程被称为Neddylation。该过程与UPS类似：首先，成熟的NEDD8在NEDD8激活酶(E1)催化下，ATP依赖性激活；然后被转移至NEDD8结合酶(E2)；最后在NEDD8连接酶(E3)作用下，共价连接于被修饰蛋白上。NEDD8激活酶为NEDD8通路中的限速酶，因此可以通过调节NEDD8激活酶的活性，来调节NEDD8通路以及泛素蛋白酶体通路活性，从而达到治疗肿瘤的目的。由于NEDD8通路处于泛素蛋白酶体通路的上游，通过抑制NEDD8激活酶，降低Neddylation活性，特异性下调泛素蛋白酶体通路中相关E3(CRLs)的活性，从而特异性减少细胞内与肿瘤相关蛋白的降解。

WO2007092213A2公开了第一个NEDD8激活酶抑制剂MLN4924的结构、制备方法及其作为抗肿瘤药物的应用。MLN4924目前正处于I期临床研究。MLN4924在NEDD8激活酶催化下，与NEDD8形成NEDD8-MLN4924复合物，并由该复合物选择性抑制NEDD8激活酶活性，从而抑制NEDD8通路(Mol.Cell,2010,37:102-111)。除MLN4924外，目前没有其他类型的NEDD8激活酶抑制剂进入临床实验，更无任何NEDD8激活酶抑制剂上市，因此寻找及开发新型NEDD8激活酶抑制剂将对癌症治疗具有十分重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的NEDD8激活酶抑制剂用于制备抗肿瘤药物。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明应用分子对接技术，对含有50000个化合物的小分子库进行虚拟筛选，再根据ADME预测及经验原则，从打分评价前100个化合物中选择目标化合物。通过体外酶、细胞及体内抗肿瘤活性检测，我们获得了一个新型NEDD8激活酶抑制剂——1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶(本发明中简称M22)。

1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶的结构式如下：

1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶的合成方法参照文献WO9422826A1。

1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的载体在制备用于预防或治疗与NEDD8激活酶异常有关疾病的药物中的应用在本发明的保护范围之内。

其中，与NEDD8激活酶异常有关疾病优选为肿瘤。所述的肿瘤更优选为白血病、卵巢癌、结肠癌、肺癌、胃癌或前列腺癌。

其中，所述的药学上可接受的盐是1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸或杏仁酸形成的酸加成盐。

1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的载体作为NEDD8激活酶抑制剂的应用也在本发明的保护范围之内。

1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的载体在制备治疗肿瘤药物中的应用也在本发明的保护范围之内。其中，所述的肿瘤优选为白血病、卵巢癌、结肠癌、肺癌、胃癌或前列腺癌。

本发明化合物可以与其他抗肿瘤药物，例如烷化剂(如环磷酰胺或顺铂)、代谢拮抗剂(如5-氟尿嘧啶)、拓扑异构酶抑制剂(伊立替康)、有丝分裂抑制剂(如紫杉醇)、蛋白激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米)联合应用。这些联合治疗可以产生协同作用从而提高治疗效果。

有益效果：

生物活性检测结果显示，1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶具有NEDD8激活酶抑制活性，同时对多种肿瘤细胞株的增殖有一定抑制作用，并能诱导肿瘤细胞凋亡。体内检测数据显示该化合物就有一定体内抗肿瘤活性。因此，本发明化合物可用于抗肿瘤药物的制备。

附图说明

图1Western Blot法检测显示M22对NEDD8激活酶有较强的剂量依赖性抑制活性。

图2Western Blot法检测显示M22为ATP竞争性的NEDD8激活酶抑制剂。

图3Western Blot法检测显示M22能够抑制细胞内NEDD8激活酶的活性。

图4Western Blot法检测显示M22能够抑制细胞内CRLs E3s底物降解。

图5CCK-8法细胞增殖抑制实验显示M22对K562、A549、CaCO-2、SK-OV-3、BXPC-3及AGS细胞有较强的增殖抑制作用。

图6流式细胞检测显示M22具有促进细胞凋亡作用。

图7CCK-8法细胞增殖抑制实验显示M22及硼替佐米在抑制A549细胞增殖方面具有协同作用。

图8体内抗肿瘤活性检测显示M22在动物体内能有效抑制肿瘤的生长。

图9斑马鱼急毒模型实验表明M22具有低急性毒性性质。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：western blot检测M22对NEDD8激活酶的抑制活性。

100μL tube管中加入2μL NEDD8激活酶(2.5μM)、2μL NEDD8(250μM)、2μLUbc12(50μM)及10μL一系列浓度范围的M22水溶液(0-90μM)。将反应液混合均匀后，37℃温孵10min。再加入2μL Mg-ATP(1.25μM)溶液。反应液混合均匀后，37℃温孵1h。反应完毕后加入2μL EDTA(1mM)水溶液终止反应。收集蛋白样品，采用western blot法检测反应体系中Ubc12-NEDD8蛋白水平。结果显示M22有剂量依赖性抑制Ubc12-NEDD8的生成，有效抑制NEDD8激活酶的活性，见图1。

实施例2：ATP竞争性实验。

100μL tube管中加入2μL NEDD8激活酶(2.5μM)、2μL NEDD8(250μM)、2μLUbc12(50μM)及10μL M22水溶液(33.3μM)。将反应液混合均匀后，37℃温孵10min。再加入2μL不同浓度的Mg-ATP溶液(1.25-10000μM)。反应液混合均匀后，37℃温孵1h。反应完毕后加入2μL EDTA(1mM)水溶液终止反应。收集蛋白样品，采用western blot法检测反应体系中Ubc12-NEDD8蛋白水平。结果显示随着ATP浓度增加，Ubc12-NEDD8的含量逐渐增加，NEDD8激活酶活性恢复。说明M22为NEDD8激活酶的ATP竞争性抑制剂，见图2。

实施例3：Western Blot检测M22对细胞内NEDD8激活酶活性的影响。

Western Blot检测不同浓度的M22(0-90μM)对A549细胞作用24h后细胞内相关蛋白Uba3-NEDD8(NEDD8激活酶β亚基与NEDD8结合的复合物)、Ubc12-NEDD8含量影响。结果显示M22对肺癌A549有剂量依赖性抑制Uba3-NEDD8、Ubc12-NEDD8生成的作用，见图3。该化合物能在细胞水平上抑制NEDD8激活酶活性。

实施例4：Western Blot检测M22对细胞内泛素CRLs E3酶底物的影响。

M22在不同浓度下(0-90μM)对A549细胞作用24h后，用Western Blot检测细胞内泛素CRLs E3酶底物P53及P27的含量。结果显示随着M22的剂量升高，A549细胞内P53及P27含量水平逐渐上升，见图4。说明该化合物促进胞内泛素CRLs E3酶底物的积累。

实施例5：CCK-8法检测M22对K562、A549、CaCO-2、SK-OV-3、BXPC-3及AGS细胞增殖影响作用。

体外培养人慢性粒性白血病细胞K562、人肺腺癌细胞A549、人结肠癌细胞CaCO-2、人卵巢癌细胞SK-OV-3、人前列腺癌细胞BXPC-3及人胃腺癌细胞AGS，加入不同浓度(0-30μM)M22，作用48h，CCK-8法检测K562、A549、CaCO-2、SK-OV-3、BXPC-3及AGS细胞增殖抑制情况，并计算IC₅₀。结果显示M22对这6类细胞有良好的增殖抑制作用，其中对K562、A549、CaCO-2、SK-OV-3、及AGS的IC₅₀均小于10μM，且IC90小于20μM。详见表1及图5。

表1M22对人源性肿瘤细胞增殖的抑制活性。

实施例6：Annexin V-FITC/PI法检测M22的促凋亡作用。

A549细胞与不同浓度的M22(0、30μM)温孵36h后，用无EDTA的胰酶消化。收集细胞样品，用annexin V-FITC/PI试剂盒(BD Biosciences)染色后，流式细胞仪检测。结果显示经M22处理后，43％的细胞进入凋亡期，说明M22具有促A549细胞凋亡作用。见图6。

实施例7：M22与硼替佐米的抗肿瘤协同作用检测。

体外培养人肺腺癌细胞A549，分别加入不同浓度的硼替佐米(终浓度为25nM、12.5nM)、M22(终浓度为5μM、10μM)及两者的混合溶液(终浓度为12.5nM硼替佐米+5μM M22)。作用48h后，CCK-8法检测A549细胞增殖抑制情况。结果显示M22与硼替佐米联用具有明显的抑制细胞活性，其抑制率显著性高于25nM硼替佐米单给药组。说明M22与硼替佐米的抗肿瘤作用具有协同作用。见图7。

实施例8：M22的体内抗肿瘤活性检测。

饲养裸鼠，分为给药组和对照组(每组8只)，并皮下接种人肺腺癌细胞A549。待成瘤后，给药组腹腔注射M22给药治疗(60mg/kg)，对照组腹腔注射生理盐水。每天给药一次，隔天记录肿瘤体积，持续一周。结果如图8所示，经过一周治疗，治疗组肿瘤生长得到有效抑制，其体积显著小于对照组肿瘤体积。M22具有良好的体内抗肿瘤活性。

实施例9：斑马鱼模型检测M22急性毒性。

将孵化后72h的斑马鱼以每孔20条的密度培养于24孔板中，并给以不同浓度的M22(终浓度为0-90μM)或硼替佐米(终浓度为0-40μM)。培养24h后在显微镜下观察斑马鱼形态变化并统计存活率，计算半致死浓度LC₅₀。结果如图9所示，M22浓度高至90μM时，斑马鱼形态正常，并未出现死亡情况，而硼替佐米的LC₅₀为5.47μM。说明M22具有低急性毒性性质。

Claims (7)

1.1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的载体在制备用于预防或治疗与NEDD8激活酶异常有关疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，与NEDD8激活酶异常有关疾病为肿瘤。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为白血病、卵巢癌、结肠癌、肺癌、胃癌或前列腺癌。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药学上可接受的盐是1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸或杏仁酸形成的酸加成盐。

5.1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的载体作为NEDD8激活酶抑制剂的应用。

6.1-苄基-4-(2,4-二氯苯乙胺基)哌啶或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的载体在制备治疗肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为白血病、卵巢癌、结肠癌、肺癌、胃癌或前列腺癌。