CN104755088A - 半乳凝集素-3的半乳糖苷抑制剂及其用于治疗肺纤维化的应用 - Google Patents

半乳凝集素-3的半乳糖苷抑制剂及其用于治疗肺纤维化的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于肺部给予的通式(I)的化合物。式(I)的化合物适于治疗肺纤维化，如哺乳动物中的特发性肺纤维化。此外，本发明涉及用于治疗肺纤维化如人类受试者中的特发性肺纤维化的方法。

Description

半乳凝集素-3的半乳糖苷抑制剂及其用于治疗肺纤维化的应用
技术领域
本发明涉及新化合物、所述化合物作为药物以及用于制造用于治疗肺纤维化、如哺乳动物中的特发性肺纤维化的药物的应用。本发明还涉及包含所述新化合物的药物组合物。另外，本发明涉及肺部给予，特别是雾化器用于提供IPF的优化治疗的用途。
背景技术
特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)代表巨大的全球健康负担。它是未知病因的慢性疾病，其中重复的急性肺损伤引起进行性纤维化，其导致肺部结构的破坏，使肺功能恶化与随之而来的呼吸衰竭和死亡。尽管特发性肺纤维化(IPF)是原型的(典型的，archetypal)并且是肺纤维化的最常见的原因，但是众多呼吸系统疾病可以发展成肺纤维化，并且这通常表示更差的预后。从诊断到死亡的中值时间是2.5年，并且IPF的发病率和患病率继续上升。它仍然是为数不多的呼吸系统疾病中的一个：对该疾病来说没有有效的治疗方法，并且没有可靠的生物标志物来预测疾病进展。导致肺纤维化的机制是不清楚的，但是集中于由于仍未知的原因造成的重复的上皮损伤的异常的伤口愈合。IPF的特点是包括成纤维细胞/肌成纤维细胞的成纤维细胞灶，该成纤维细胞/肌成纤维细胞显示出对纤维化细胞因子如转化生长因子-β1(TGF-β1)的增强的活化反应。考虑到IPF对目前的抗炎治疗的许多情况无反应性，在成纤维细胞灶内的肌成纤维细胞代表潜在的新的治疗靶点。存在对用于治疗特发性肺纤维化的药物的巨大的未满足的需求。
肺纤维化的博来霉素模型是最好表征的啮齿动物模型并且是行业标准模型。博来霉素处理引起氧化剂介导的DNA损伤并且诱导最初的肺部炎症，然后是2-4周内的进行性纤维化。当在损伤的晚期阶段给予时，可以评估新化合物的抗纤维化潜能。
在早前公开的专利申请中，已由当前的一些发明人描述了半乳凝集素抑制剂，尤其Gal-3抑制剂。这些半乳凝集素抑制剂均未在博来霉素模型中测试。现有技术半乳凝集素抑制剂中的一些具有以下通式：
如在WO/2005/113568中描述的：
和如在WO/2005/113569中描述的，其中RI可以是D-半乳糖：
以及如在WO/2010/126435中描述的：
发明内容
半乳凝集素-3是在不同病因的纤维化的组织中高度表达的β-半乳糖苷结合凝集素。检查小鼠中半乳凝集素-3在博来霉素和TGF-β1-诱导的肺纤维化的作用，并且确定了其在人类IPF中的相关性。在MacKinnon等人,“Regulation of TGF-β1driven lung fibrosis by galectin-3”，Am.J.Respir.Crit.Care Med.185:537-546(2012，最早在2011年11月17日可在线获得)中描述用半乳凝集素-3的研究。特别地，示出半乳凝集素-3抑制可以代表用于治疗肺纤维化的新的治疗策略。已经测试了新的化合物并且示出是半乳凝集素-3的抑制剂，特别地，该化合物在体外阻断了TGF-β诱导的β-连环蛋白活化，并且在体外减弱博来霉素之后的肺纤维化的晚期进展。
在本文中用来说明本发明并且特别地用来提供关于实践的其他细节的包括专利的出版物和其他材料通过引用将其全部并入。
因此，提供的是通式(I)的化合物：
在另外的方面中，提供的是组合物，特别是包含式(I)的化合物和可选地药学上可接受的添加剂如载体或赋形剂的药物组合物。
式(I)的化合物适于在治疗肺纤维化、如哺乳动物中的特发性肺纤维化的方法中使用。通常，此类哺乳动物是人类受试者。给予模式通常选自口服、静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)和肺部。特别地，在小鼠中已经示出肺部途径提供比i.v.或s.c.途径长得多的半衰期。当治疗肺纤维化特别地是IPF时，获得治疗剂在肺部组织的最狭隘的部分中(包括细支气管和肺泡)的足够高的局部浓度是重要的。进一步地，治疗剂获得在肺部组织中作用部位的足够的停留时间是重要的。此外，因为在IPF患者中的纤维化仅存在于肺中，所以优选在具有最小或没有全身暴露的情况下获得高的肺暴露，并且使用雾化器特别是超声波型电子雾化器是有效的。然而，对于患有肺纤维化尤其是IPF的患者来说，咳嗽是主要症状，如果刺激物被引入肺中，该症状有可能加重。因此，用干粉，如用干粉吸入器或类似物的治疗不适于这些患者。然而，使用雾化器如电子雾化器递送化合物是特别有益的，因为其允许化合物递送到肺中的最小的腔，而不引起肺中的任何刺激。
此外，在又一个方面中提供用于治疗肺纤维化、如特发性肺纤维化的方法，包括将治疗有效量的式(I)的化合物给予至需要其的哺乳动物。
在另一个方面中，提供制备式I的化合物的方法，包括下面步骤：使双-(3-脱氧-3-叠氮基-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷与3-氟苯基乙炔和胺(如三乙胺)、可选地在催化剂如Cu(I)存在下、在溶剂如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中反应，得到式I的化合物。
在另外的方面中，本发明涉及用于在人类受试者中治疗肺纤维化如特发性肺纤维化的方法，所述人类受试者具有指示肺纤维化或症状加重的半乳凝集素-3水平，该方法包括将治疗有效量的半乳凝集素-3抑制剂给予至人类受试者。
上述方法中的任何一个可包括以下步骤：将涉及受试者中发展肺纤维化的可能性或用于表征所述受试者中的肺纤维化的严重程度的信息传送、显示、存储或打印；或者输出到用户界面设备、计算机可读存储介质、本地计算机系统或远程计算机系统。
因此，除其他外，在本文中公开下面的实施方式：
1.通式(I)的化合物：
2.根据实施方式1所述的化合物，选自为游离形式的双(3-脱氧-3-(3-氟苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷。
3.根据实施方式1-2中任一项所述的化合物，用于作为药物使用。
4.一种药物组合物，包含实施方式1-3中任一项所述的化合物和可选地药学可接受的添加剂，如载体或赋形剂。
5.根据实施方式4所述的药物组合物，其中，通过肺部途径给予该组合物。
6.根据实施方式5所述的药物组合物，其中，通过肺部途径给予选自雾化器如超声雾化器或喷射式雾化器。
7.根据实施方式1-3中任一项所述的化合物，用于在治疗肺纤维化、如哺乳动物中的特发性肺纤维化的方法中使用。
8.根据实施方式7所述的化合物，其中，通过肺部途径给予该化合物。
9.根据实施方式8所述的化合物，其中，通过肺部途径给予选自雾化器如超声雾化器或喷射式雾化器。
10.根据实施方式7、8或9所述的化合物，其中，所述哺乳动物是人类受试者。
11.一种用于肺纤维化如特发性治疗肺纤维化的方法，其包括将治疗有效量的实施方式1-3中任一项所述的化合物给予至需要其的哺乳动物。
12.根据实施方式11所述的方法，其中，通过肺部途径给予实施方式1-3中任一项所述的化合物。
13.根据实施方式12所述的方法，其中，通过肺部途径给予选自雾化器如超声雾化器或喷射式雾化器。
14.一种制备式I的化合物的方法，包括以下步骤：使双-(3-脱氧-3-叠氮基-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷与3-氟苯基乙炔和胺在溶剂中反应，得到式I的化合物。
15.根据实施方式14所述的方法，其中，胺是三乙胺，存在催化剂，如Cu(I)，并且溶剂是有机溶剂，如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
16.一种用于肺部给予的雾化器设备，包含实施方式1-3中任一项所述的化合物。
17.根据实施方式16所述的雾化器设备，其中，化合物是为游离形式的双(3-脱氧-3-(3-氟苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷。
18.根据实施方式16或17所述的雾化器，其选自超声雾化器或喷射式雾化器。
19.一种用于肺部给予的干粉设备，包含实施方式1-3中任一项所述的化合物。
20.根据实施方式19所述的干粉设备，其中，化合物是为游离形式的双(3-脱氧-3-(3-氟苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷。
21.一种诊断人类受试者中的肺纤维化的方法，包括a)使用合适的测试方法测量来自人类受试者的身体样本中的半乳凝集素-3水平(例如浓度)，b)将半乳凝集素-3水平与预定的参考水平比较，以及c)确定半乳凝集素-3水平是否指示诊断该受试者患有肺纤维化。
22.根据实施方式21所述的方法，其中，半乳凝集素-3的指示水平是至少22ng/ml、如至少25ng/ml、如至少30ng/ml、至少40ng/ml、至少50ng/ml、至少60ng/ml、至少70ng/ml。
23.一种预测在人类受试者中的肺纤维化的预后的方法，包括a)使用合适的测试方法测量来自人类受试者的身体样本中的半乳凝集素-3水平(例如浓度)，并且b)确定半乳凝集素-3水平是否指示不良预后或不适用于人类受试者。
24.根据实施方式23所述的方法，其中，半乳凝集素-3的指示水平是至少22ng/ml、如至少25ng/ml、如至少30ng/ml、至少40ng/ml、至少50ng/ml、至少60ng/ml、至少70ng/ml。
25.一种监测人类受试者中的肺纤维化的发展或进展的方法，包括a)以足够的间隔测量来自受试者的身体样本中的半乳凝集素-3水平至少两次以测量临床相关变化，b)将半乳凝集素-3水平与预定的参考水平比较，并且重复步骤a)和b)一次或多次以监测人类受试者中肺纤维化的发展或进展。
26.根据实施方式25所述的方法，其中，在两次测量间的时间段独立选自约2周到2年，如2周、4周、1月、2月、3月、6月、1年或2年。
27.根据实施方式25所述的方法，其中，当半乳凝集素-3的指示水平低于22ng/ml时，可以停止、调整或搁置(中断，put on hold)治疗肺纤维化。
28.根据实施方式25所述的方法，其中，当半乳凝集素-3的指示水平是至少22ng/ml，如至少25ng/ml、如至少30ng/ml、至少40ng/ml、至少50ng/ml、至少60ng/ml、至少70ng/ml时，可以开始或增强治疗肺纤维化。
29.一种监测或预测在患有肺纤维化的患者中的症状加重的方法，包括a)使用合适的测试方法测量来自人类受试者的身体样本中的半乳凝集素-3水平(例如浓度)，b)将半乳凝集素-3水平与预定的参考水平比较，b)确定指示症状加重的发展或进展的半乳凝集素-3水平的存在或不存在，并且c)重复步骤a)和b)以监测或预测人类受试者中的症状的加重的发展或进展。
30.根据实施方式29所述的方法，其中，当半乳凝集素-3的指示水平低于22ng/ml时，可以停止、调整或搁置治疗肺纤维化。
31.根据实施方式29所述的方法，其中，当半乳凝集素-3的指示水平是至少22ng/ml，如至少25ng/ml、如至少30ng/ml、至少40ng/ml、至少50ng/ml、至少60ng/ml、至少70ng/ml时，开始或增强治疗肺纤维化。
32.根据实施方式29所述的方法，其中，当半乳凝集素-3的指示水平是至少50ng/ml、至少60ng/ml、至少70ng/ml时，开始或增强症状加重的预防性治疗。
33.根据实施方式17-28中任一项所述的方法，其中，肺纤维化是特发性肺纤维化。
34.根据实施方式21-33中任一项所述的方法，其中，根据半乳凝集素-3的水平将受试者诊断为患有轻度、中度或侵略形式(aggressiveforms)的肺纤维化。
35.根据实施方式21-34中的任一项所述的方法，其中，在步骤a)中测量另外的生物标志物，该标志物与肺纤维化相关，包括与半乳凝集素-3水平相连的(linked)标志物，产生更加精确的诊断、预后和/或监测。
36.根据实施方式35所述的方法，其中，生物标志物选自MMP7、perDLCO、KL-6、SP-A、MMP-7、CCL-18、IL13、CC-趋化因子、IL10、IL1受体拮抗剂、CCL2、钙粒蛋白B(S100A9或MRP 14)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、前胶原、前胶原3。
37.根据实施方式35所述的方法，其中，生物标志物选自来自所述人类受试者的体液中的某些细胞类型的存在和频率的分析。
38.根据实施方式36所述的方法，其中，生物标志物选自来自所述人类受试者的体液中的纤维细胞和T-细胞亚群体的存在和频率的分析。
39.根据实施方式21-38中任一项所述的方法，其中，半乳凝集素-3的预定的参考水平在从约10.0ng/mL到约25.0ng/mL范围内，如在从约13.0ng/mL到约19.2ng/mL的范围内。
40.根据实施方式21-39中任一项所述的方法，其中，身体样本选自血液、血清、血浆、支气管-肺泡灌洗液、肺组织。
41.根据实施方式21-40中任一项所述的方法，其中，合适的测试方法选自免疫测定法、免疫组化法、比色测定法、比浊法和流式细胞术。
42.根据实施方式17或29所述的方法，其中，受试者具有确定在目标范围内的半乳凝集素-3血液浓度。
43.根据实施方式42所述的方法，其中，目标范围是约10ng/ml到约70ng/ml。
44.一种用于治疗人类受试者中的肺纤维化、如特发性肺纤维化的方法，所述人类受试者具有指示肺纤维化或症状加重的的半乳凝集素-3，该方法包括将治疗有效量的半乳凝集素-3抑制剂给予人类受试者。
45.根据实施方式40所述的方法，其中，半乳凝集素-3抑制剂选自实施方式1-3中任一项所述的化合物。
46.根据实施方式44所述的方法，其中，半乳凝集素-3的指示水平是至少22ng/ml，如至少约25ng/ml、如至少约30ng/ml、至少约40ng/ml、至少约50ng/ml、至少约60ng/ml、至少约70ng/ml。
47.根据实施方式44所述的方法，包括另外的步骤：监测治疗开始后的受试者的半乳凝集素-3血液水平。
因此，除其他外，也公开下面的实施方式：
1.通式(I)的化合物：
2.根据实施方式1所述的化合物，选自为游离形式的双(3-脱氧-3-(3-氟苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷。
3.一种组合物，包含实施方式1所述的化合物和可选地药学可接受添加剂。
4.一种用于治疗肺纤维化的方法，包括将有效治疗所述肺纤维化的实施方式1所述的化合物的量给予至需要其的哺乳动物。
5.根据实施方式4所述的方法，其中，通过肺部途径给予所述化合物。
6.一种制备式I的化合物的方法，包括以下步骤：使双-(3-脱氧-3-叠氮基-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷与3-氟苯基乙炔和胺在溶剂中反应，得到式I的化合物。
7.根据实施方式5所述的方法，其中，胺是三乙胺，存在催化剂，如Cu(I)，并且溶剂是有机溶剂，如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
8.一种用于肺部给予的设备，其中，所述设备是包含实施方式1所述的化合物的雾化器或干粉设备。
9.根据实施方式8所述的设备，其中，所述设备是雾化器，其选自超声雾化器或喷射式雾化器。
10.一种检测人类受试者中的肺纤维化的存在和/或程度以诊断肺纤维化和/或预测肺纤维化的预后的方法，包括a)使用合适的测试方法测量来自人类受试者的身体样本中的半乳凝集素-3水平，b)将半乳凝集素-3水平与预定的参考水平比较，以及c)确定半乳凝集素-3水平是否指示诊断受试者患有肺纤维化。
11.根据实施方式10所述的方法，其中，半乳凝集素-3的指示水平为至少约22ng/ml。
12.一种监测人类受试者中的肺纤维化的发展或进展或症状的加重的方法，包括a)以足够的间隔测量来自受试者的身体样本中的半乳凝集素-3水平至少两次以测量临床相关变化，b)将半乳凝集素-3水平与预定的参考水平比较，并且重复步骤a)和b)一次或多次以监测人类受试者中的肺纤维化的发展或进展。
13.根据实施方式12所述的方法，其中，在两次测量间的时间段独立选自约2周到2年。
14.根据实施方式12所述的方法，其中，当半乳凝集素-3的水平低于约22ng/ml时，停止、调整或搁置肺纤维化的治疗。
15.根据实施方式12所述的方法，其中，肺纤维化是特发性肺纤维化。
16.根据实施方式12所述的方法，其中，根据半乳凝集素-3的水平将受试者诊断为患有轻度、中度或侵略形式的肺纤维化。
17.根据实施方式12所述的方法，其中，在步骤a)中测量另外的生物标志物，其中，所述标志物与半乳凝集素-3水平相连。
18.根据实施方式17所述的方法，其中，生物标志物选自MMP7、perDLCO、KL-6、SP-A、MMP-7、CCL-18、IL13、CC-趋化因子、IL10、IL1受体拮抗剂、CCL2、钙粒蛋白B(S100A9或MRP 14)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、前胶原、前胶原3。
19.根据实施方式17所述的方法，其中，生物标志物选自来自所述人类受试者的体液中的某些细胞类型的存在和频率的分析。
20.根据实施方式17所述的方法，其中，生物标志物选自来自所述人类受试者的体液中的纤维细胞和T-细胞亚群体的存在和频率的分析。
21.根据实施方式12所述的方法，其中，半乳凝集素-3的预定参考水平在从约10.0ng/mL到约25.0ng/mL的范围内。
22.根据实施方式12所述的方法，其中，身体样本选自血液、血清、血浆、支气管-肺泡灌洗液、肺组织。
23.根据实施方式10所述的方法，其中，合适的测试方法选自免疫测定法、免疫组化法、比色测定法、比浊法和流式细胞术。
24.根据实施方式10所述的方法，其中，受试者具有确定在从约10ng/ml到约70ng/ml的目标范围内的半乳凝集素-3血液浓度。
25.根据实施方式12所述的方法，其中，受试者具有确定为目标范围的半乳凝集素-3血液浓度选自约10ng/ml到约70ng/ml。
具体实施方式
在一个宽的方面中，提供通式(I)的化合物：
在进一步的方面中，本发明涉及用于肺部给予的组合物，其中所述组合物包含式(I)的化合物。
式(I)的化合物具有化学名称(IUPAC)双(3-脱氧-3-(3-氟苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷，并且如本文所用其意在包括任何可能形式的式(I)的化合物，如固体或液体、盐、溶剂化物或游离形式。
通常，式(I)的化合物是为游离形式的双(3-脱氧-3-(3-氟苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷。
在进一步的实施方式中，式(I)的化合物是没有任何溶剂化物，如脱水的为游离形式的双(3-脱氧-3-(3-氟苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷。
在另外的实施方式中，式(I)的化合物是无定形形式的双(3-脱氧-3-(3-氟苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷。
在进一步的实施方式中，式(I)的化合物是晶体形式的双(3-脱氧-3-(3-氟苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷。
在又一实施方式中，式(I)的化合物有用于治疗肺纤维化，并且因此适于作为药物使用。
在另外的实施方式中，通过雾化器，如选自超声雾化器或喷射式雾化器的雾化器进行肺部给予。当通过雾化器进行给予时，式(I)的化合物可以在溶液中、在悬浮液如纳米悬浮液中、或在脂质体制剂中。
在另外的实施方式中，通过干粉吸入器进行肺部给予。当通过干粉吸入器进行给予时，式(I)的化合物可以作为纳米粒子或作为脂质体制剂存在。
在又一实施方式中，通过加压计量吸入器进行肺部给予。当通过加压计量吸入器进行给予时，式(I)的化合物可以在溶液中或在悬浮液如纳米悬浮液中存在。
在进一步的实施方式中，用于肺部给予的组合物用于在肺纤维化如IPF的治疗方法中使用。
当式(I)的化合物是在悬浮液或纳米悬浮液或脂质体制剂中时，它可以以合适的粒径存在：合适的粒径选自具有以下的颗粒：在0.1μm和20μm之间的平均质量气体动力学直径，如在0.5μm和10μm、如在1μm和5μm之间的MMAD。选择的范围不排除在这些范围之外的粒径的存在，但是选择的范围是提供如本文所述的所需效果的那些范围。
在又一实施方式中，用于肺部给予的组合物是药物组合物。
药物组合物包含本领域技术人员所知的药学可接受的添加剂，如赋形剂和/或载体。
在另外的方面中，本发明涉及包含用于肺部给予的组合物的用于肺部给予的装置。通常，此类设备是雾化器，如选自超声雾化器或喷射式雾化器的雾化器；或干粉吸入器。
在进一步的方面中，提供在治疗肺纤维化如哺乳动物中的特发性肺纤维化的方法中使用的式(I)的化合物。此类哺乳动物通常是人类受试者，优选地是诊断患有IPF的人类受试者。
在又一方面中，提供的是用于治疗肺纤维化如特发性肺纤维化的方法，包括将治疗有效量的式(I)的化合物给予至哺乳动物。
当本文公开的化合物和药物组合物被用于上述治疗时，将治疗有效量的至少一种化合物给予需要所述治疗的哺乳动物。
如本文所使用的，术语“疗法”和“治疗”意指对于与病症如疾病或失调抗争的目的对患者的管理和护理。该术语旨在包括对于患者所患的给定病症的全局(full spectrum)治疗，如给予活性化合物以减轻症状或并发症，以延缓疾病、失调或病症的进展，以减轻或缓解病症和并发症，和/或以治愈或消除疾病、失调或病情以及防止病症，其中防止将被理解为为了与疾病、病症或失调抗争对患者的管理和护理，并且其包括给予活性化合物以防止病症或并发症的开始。该治疗可用急性或慢性方式进行。待治疗的患者优选地是哺乳动物；尤其是人类，但是其也可包括动物，如狗、猫、牛、养和猪。
本文所使用的本发明的式(I)的化合物的术语“治疗有效量”意指足够于治疗、减轻或部分阻止给定疾病和其并发症的临床表现的量。适于实现其的量被定义为“治疗有效量”。用于每个目的的有效量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的体重和一般状况。应当理解，可以使用常规实验通过构建数值的矩阵并且测试矩阵中不同的点而实现确定合适的剂量，该方式属于受过训练的医师或兽医的普通技能。
在又一方面中，本发明涉及包含式(I)的化合物和可选地药学上可接受的添加剂，如载体或赋形剂的药物组合物。
如本文所使用的“药学上可接受的添加剂”旨在不限制地包括载体、赋形剂、稀释剂、佐剂、着色剂、芳香剂、防腐剂等，当配制本发明的化合物以制成药物组合物时，技术人员会考虑使用上述添加剂。
可用于本发明的组合物中的佐剂、稀释剂、赋形剂和/或载体从与式(I)的化合物和药物组合物的其他成分相容且对其接受者无毒的意义上来说，必须是药学上可接受的。优选组合物不应该包含可能引起不良反应如过敏反应的任何材料。可用于本发明的药物组合物中的佐剂、稀释剂、赋形剂和载体对于本领域人员来说是众所周知的。
如上所述，除本文公开的化合物之外，如本文公开的组合物和特别是药物组合物可另外包含至少一种药学上可接受的佐剂、稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，药物组合物包含从1重量％到99重量％的所述至少一种药学上可接受的佐剂、稀释剂、赋形剂和/或载体和从1重量％到99重量％的如本文公开的化合物。活性成分的结合量和药学上可接受的佐剂、稀释剂、赋形剂和/或载体的合并的量不可以构成按重量计多于100％的组合物，特别是药物组合物。
在一些实施方式中，为了上述目的，使用如本文公开的仅一种化合物。
在一些实施方式中，为了上述目的，组合使用如本文公开的两种或更多种化合物。
包含在本文中列出的化合物的组合物，特别是药物组合物可适于口、静脉内、局部、腹膜内、鼻、颊、舌下或皮下给予，或适于以例如气雾剂或空气悬浮细粉的形式的通过呼吸道给予。因此，药物组合物可以以例如片剂、胶囊剂、粉末剂、纳米颗粒、晶体、无定形物质、溶液、透皮贴剂或栓剂的形式存在。
因此，在又一个方面提供用于肺内给予的组合物，特别是药物组合物。通常，此类组合物通过雾化器或吸入器，优选地通过雾化器被递送。
Boehringer Ingelheim在1997年提供了名为Raspimat的新技术，其为软雾吸入器型机械雾化器。该机械雾化器通过手动操作而不需要任何气体推进剂且不需要电力。另一个机械雾化器是由来自Marquette大学的团队开发的人力雾化器。该雾化器可通过电气压缩机操作，但是它也适于简单的机械泵以便提供薄雾到患者的肺中。电气型的另外的雾化器是基于尤其由PARI、Respironics、Omron、Beurer、Aerogen开发的振动筛网技术的超声雾化器，或基于产生尤其由Omron和Beurer开发的高频超声波的电子振荡器的超声雾化器。另外的电子雾化器是又称为喷雾器的喷射式雾化器。
在另外的实施方式中，雾化器选自机械雾化器，如软雾吸入器或人力雾化器。在另一个实施方式中，雾化器选自电子雾化器，如基于超声波振动筛网技术的雾化器、喷射式雾化器或超声波雾化器。特别适合的雾化器基于振动筛网技术如来自PARL的eFlow。当治疗肺纤维化特别是IPF时，获得治疗剂在包括细支气管和肺泡的肺组织的最狭窄的部分中的足够高的局部浓度是重要的。进一步地，获得治疗剂在肺组织中作用部位处足够的停留时间是重要的。然而，咳嗽是对于患有肺纤维化特别是IPF的患者来说主要的症状，如果刺激物被引入肺中，该症状有可能加重。因此，用干粉，如用干粉吸入器或类似物的治疗不适于这些患者。然而，使用雾化器如电子雾化器递送化合物是特别有益的，因为其允许化合物递送到肺中的最小的腔而不引起肺中的任何刺激。此类相关的雾化器系统在公开的专利申请US20040089295、US20050056274、US20060054166、US20060097068、US20060102172、US20080060640、US20110155768和US20120167877中被描述，所有该专利申请通过引用并入于此。其他合适的雾化器是来自United Therapeutics的Tyvaso吸入系统、来自Gilead的Allera雾化器系统、来自Pharmaxis的Bronchitol吸入器、来自GSK的Diskhaler、来自Actelion and Profile Pharma的喷射式和超声雾化器。
以下特征对于肺部递送设备是必需的：它应该能够精确且重复地提供特定的剂量。它应该能够例如通过重复给药或通过调节提供给患者的剂量提供2种或更多种不同剂量水平。该设备应该确保药物被递送到肺的细支气管腔或优选地递送到肺的细支气管和肺泡腔、优选地在肺组织上均匀地。因此，该设备应该产生足够小尺寸的气雾剂或干粉以确保此次递送，而不是递送如此小的颗粒以使它们被立即呼出并且因此不在肺组织中停留。
吸入雾化器通过形成包括可易于吸入的尺寸的颗粒的气雾剂递送治疗有效量的药物。可以例如由在吸入治疗范围内的患者使用气雾剂，借此，在吸入时，治疗有效药物或药物到达患者的呼吸道。
具有在0.1μm和20μm之间，如在0.5μm和10μm之间，例如在1μm和5μm(微米)之间的平均质量气体动力学直径(MMAD)的颗粒具有在终端支气管和肺泡区域沉积的增加的概率，这对于本领域技术人员来说是众所周知的。在肺部药物递送中该粒径范围对于许多适应症来说是理想的，因为该材料的一部分将同样一直沉积在上呼吸道中(Cf.Controlled PulmonaryDrug Delivery,Smith and Hickey,Editors,Springer 2011,chapter 13)。
依据Controlled Pulmonary Drug Delivery,Smith and Hickey,Editors,Springer 2011，尤其是第13、14和15章，技术人员将知道如何去配制化合物，如用于肺部药物递送的式(I)的化合物。通常，脂质体、纳米颗粒和微粒适合于悬浮也适合于干粉。
各种各样的吸入雾化器是已知的。EP 0170715A1使用压缩气体流以形成气雾剂。喷嘴作为气雾剂发生器被设置在吸入雾化器的喷雾器腔中，并且其具有邻近压缩气体管道而设置的两个吸水管。当压缩气体流通过压缩气体管道时，从液体存储器中通过吸水管被吸入要成雾状的液体。
EP 0 432 992 A公开了包括具有液体存储器、穿孔膜和振动器的气雾剂发生器的雾化器。振动器是可操作的以振动膜使得它通过膜中提供的孔将从液体中分配气雾剂。
US专利5,918,593涉及通过一定量的液体和压电元件间的相互作用产生气雾剂的超声雾化器。当振动能从压电元件转移到液体时，从液体本体(bulk)的表面排出各种尺寸的液滴。因为必须从由表面排出的液滴中去除过大的液滴以便产生被患者吸入的气雾剂，在喷雾器腔中过滤由此产生的液滴。该雾化器代表连续操作吸入雾化器，其中气雾剂发生器不仅在吸入期间而且在患者呼气的同时产生气雾剂。实际上患者只在吸入阶段吸入由气雾剂发生器产生的气雾剂，而在其他时候产生的任何气雾剂都损失了。
干粉吸入器(DPI)，如定剂量药物吸入器对于把药物分配到患者的肺部是众所周知的。一些以前的吸入器已经包括加压气雾剂分配容器，其中气雾剂包含粉状的药物悬浮于其中的气体推进剂。一经致动，气雾剂成分通过计量阀排出并进入到患者的肺中。
目前的设计包括预计量和设备计量的DPI，这两者可以仅靠患者吸气或在一些类型的助力下驱动。预计量的DPI包括以前测量的剂量或在一些类型的单元(例如，以气泡、胶囊或其他腔的单个或多个呈现)中的剂量分数，其随后在操作期间或在使用前由患者插入到设备中。此后，剂量可直接从预计量单元吸入或者它可在被患者吸入之前转移到腔。设备计量的DPI具有包括对于多剂量来说足够的制剂的内部容器，该多剂量是在由患者致动期间由设备本身计量的。许多具有对设计来说是独特的特点的DPI设计的宽排列将呈现出在开发信息以支持应用方面的挑战。与DPI设计无关，最重要的属性是剂量和粒径分布的可重复性。通过有效期的期限维持这些质量并且确保设备贯穿其在患者使用条件下的使用寿命的功能性将很可能呈现出最难的挑战。
加压计量吸入器(pMDI)也可以是用于本式(I)的化合物的适合的递送设备，并且其在Controlled Pulmonary Drug Delivery,Smith and Hickey,Editors,Springer 2011的第8章中被描述。
因此已经提供非气雾剂、呼吸致动的干粉吸入器中的几个类型。例如，授予Bacon的U.S.专利5,503,144示出呼吸致动的干粉吸入器。该设备包括用于容纳干粉药物的干粉存储器、用于从存储器中以离散的量除去粉末药物的计量室和在患者吸入后通过喷口(mouthpiece)夹带除去的粉末药物的进气口。
U.S.专利5,458,135公开了用于生产药物的雾化剂量以供随后由患者吸入的方法和装置。该方法首先包括把药物的预选量分散在预定体积的气体通常为空气中。可由液体或干粉形成该分散体。该方法依赖于基本上把整个雾化剂量流动到腔中，该腔起初填充有空气并且通过喷口向周围环境开放。在雾化的药物已经被转移到腔后，患者将在单个呼吸中吸入整个剂量。
US 6,065,472公开了包括以下的粉末吸入设备：包含药学活性化合物的外壳；具有延伸到外壳中的出口的导管，通过其用户可吸气以形成通过导管的气流；用于递送化合物的剂量到导管中的计量单元以及设置在所述导管内以帮助夹带在所述气流中的粉末团聚体的破碎的挡板。
不管是否使用气雾剂或非气雾剂吸入器，最重要的是被分散的干粉药物的颗粒足够小以确保在吸入期间药物到患者肺的支气管区域的充分渗透。然而，因为干粉药物是由非常小的颗粒组成，并且其经常以包括载体如乳糖的组合物、非限定的团聚体或在被分散之前随机药物形式的聚合物的形式被提供。因此，已经优选地发现提供具有用于药物吸入前打碎药物的或药物和载体的团聚体的呼吸-致动的干粉吸入器。
组合物和特别是药物组合物可以可选地包含本发明的两种或更多种化合物。组合物也可以与在相关失调的治疗领域内的其他药物一起使用。
本文提出的化合物的典型剂量在宽的范围内变化，并且其取决于许多因素，如给予途径、需要治疗的个体的需求、个体的体重、年龄和一般状况。
可以如在下面的实验部分中所描述的制备式(I)的化合物。
因此，提供制备式I的化合物的方法，包括以下步骤：使双-(3-脱氧-3-叠氮基-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷与3-氟苯基乙炔和胺如三乙胺、可选地在催化剂如Cu(I)存在下、在溶剂如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中反应，得到式I的化合物。在特定的实施方式中提供制备式I的化合物的方法，包括如在实验部分的方案1中所述的步骤。此外，本发明涉及通过以下步骤可获得的式(I)的化合物：使双-(3-脱氧-3-叠氮基-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷与3-氟苯基乙炔和胺如三乙胺、可选地在催化剂如Cu(I)存在下、在溶剂如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中反应，得到式I的化合物，如通过如在实验部分的方案1中所述的步骤可获得。
通常，肺纤维化是特发性肺纤维化(IPF)。
在另外的实施方式中，根据半乳凝集素-3的水平将人类受试者诊断为患有轻度、中度或侵略形式的肺纤维化。
在另外的方面中，本发明涉及用于治疗具有指示肺纤维化或症状加重的半乳凝集素-3水平的人类受试者中的肺纤维化如特发性治疗肺纤维化的方法，包括向人类受试者提供治疗有效量的半乳凝集素-3抑制剂。在特定的实施方式中，半乳凝集素-3抑制剂选自式(I)的化合物。
在实施方式中，半乳凝集素-3的指示水平为至少约22ng/ml，如至少约25ng/ml、如至少约30ng/ml、至少约40ng/ml、至少约50ng/ml、至少约60ng/ml、至少约70ng/ml。
可以通过进行免疫分析定量半乳凝集素-3水平。半乳凝集素-3免疫分析包括在条件下将来自待测试的受试者的样本与合适的抗体接触，使得如果存在半乳凝集素-3可以发生免疫特异性结合，并且包括通过抗体检测或测量任何免疫特异性结合的量。可以使用任何合适的免疫分析，包括但不限于，使用如下列项的技术的竞争性和非竞争性的分析系统：蛋白质印迹、放射免疫测定、免疫组织化学、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“三明治”式免疫测定、免疫沉淀测定、免疫扩散测定、凝集试验、补体结合测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法和蛋白质A免疫测定法。
最常见的酶免疫测定法是“酶联免疫吸附测定法(ELISA)”。ELISA是使用抗体的标记的(例如，酶联的)形式检测和测量抗原的浓度的技术。存在对本领域技术人员来说众所周知的不同形式的ELISA。在“Methods inImmunodiagnosis”，第2版，Rose and Bigazzi,eds.John Wiley&Sons,1980；Campbell等人，“Methods and Immunology”，W.A.Benjamin,Inc.,1964；以及Oellerich,M.(1984),J.Clin.Chem.Clin.Biochem.22:895-904中描述标准的ELISA技术。用于检测半乳凝集素-3的优选的酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA)是商业可获得的(BG Medicine,Waltham,Mass.)。
可在本领域的众多文本中找到免疫测定设计、理论和方案的详细综述，包括Butt,W.R.,Practical Immunology,ed.Marcel Dekker,NewYork(1984)，以及Harlow等人，Antibodies,A Laboratory Approach,ed.ColdSpring Harbor Laboratory(1988)。
在本文的实验部分中描述本方法的另外实施方式，并且每个个别方法以及每个原材料构成了可以形成实施方式的部分的实施方式。
除非规定实施方式涉及某一方面或本发明的方面，否则上述实施方式应被看作是涉及本文所述的方面(如“治疗方法”、“药物组合物”、“用作药物的化合物”或“在方法中使用的化合物”)中的任何一个以及本文所述的实施方式中的任何一个。
本文引用的包括出版物、专利申请和专利的所有参考文献通过引用以相同的程度并入于此：如同每个参考文献被单独地且具体地指出通过引用并入并且在此阐述其全部。
所有标题和副标题仅为方便起见在本文中使用，并且不应该被解读为以任何方式限制本发明。
除非本文另外表明或与上下文明显矛盾，否则本发明包含在其所有可能的变体中上述要素的任何组合。
除非本文另外表明或与上下文明显矛盾，否则如在描述本发明的上下文中所使用的术语“一个(a)”和“一种(an)”和“该(the)”以及类似的引用将被解读成涵盖单数和复数。
除非本文另外表明，否者本文值的范围的列举仅旨在充当单独涉及落在该范围内的每个单独的值的速记方法，并且每个单独的值被并入到说明书中，好像它在本文中单独列举。除非另有说明，否者本文提供的所有精确值代表相应的近似值(例如，相对于特定因素或测量所提供的所有精确的示例性的值可被认为也提供相应的近似测量，在适当的情况下用“约”修饰)。
除非本文另外表明或其与上下文明显矛盾，否则可以以任何合适的顺序进行本文所述的所有方法。
除非另外表明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不构成在本发明的范围上的限制。除非尽可能明确陈述，否则本说明书中没有语言应当被解读为指示任何要素对本发明的实践是必要的。
本文专利文件的引用和结合仅为了方便起见而完成的，并且不反映该专利文件的有效性、可专利性和/或可进行性的任何观点。
除非另外陈述或与上下文明显矛盾，否则根据一个要素或多个要素使用术语如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”的本发明中的任何方面或实施方式的本文描述旨在提供对“由…组成”、“基本上由…组成”或“基本上包括”那个特定的要素或多个要素的发明的相似的方面或实施方式的支持(例如，除非本文另外陈述或与上下文明显矛盾，否则如本文所述为包含特定要素的组合物应当被理解为也描述由那个要素的组成组合物)。
本发明包括最大程度地被适用法律允许的在本文提出的方面或权利要求中叙述的主旨的所有修改和等价物。
本发明通过下面的实例进一步说明，然而，该实例不应被解读为限制保护的范围。在上面的描述和在下面的实例中分别公开的以及在其任意组合中公开的特点可以是以其多种形式实现本发明的材料。
实验
合成双(3-脱氧-3-(3-氟苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷一般方法
在Kofler装置(Reichert)上记录熔点并且未校正。在Bruker DRX400(Bruker DRX 400)或Bruker ARX 300(300MHz)分光仪上记录质子核磁共振(1H)光谱；多样性被引述为单峰(s)、双峰(d)、双二重峰(dd)、三重峰(t)、表观三重峰(at)或双峰的表观三重峰(atd)。在Bruker DRX 400(100.65MHz)分光仪上记录碳核磁共振(13C)。使用COSY、HMQC和DEPT实验确定光谱。以每百万份(ppm)在d-规模(d-scale)上引用所有的化学位移。使用JEOL SX-120仪器记录低分辨率和高分辨率(FAB-HRMS)快原子轰击质量谱，并且在Micromass Q-TOF仪器上记录低分辨率和高分辨率(ES-HRMS)。在具有1dm的路径长度的Perkin-Elmer 341旋光计上测量旋光度；以g/100mL给出浓度。在预涂有60F254二氧化硅的Merck Kieselgel板上进行薄层色谱(TLC)。使用10％的硫酸显影平板。在二氧化硅(Matrex,35-70μm,Grace Amicon)上进行快速柱色谱法。从氢化钙中蒸馏出乙腈并且存储在分子筛上。从分子筛中蒸馏出DMF并且存储在分子筛上。
根据下面的反应方案1制备双(3-脱氧-3-(3-氟苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷(TD139)：
化合物(1)(cf.上面的反应方案)商业购自Carbosynth Limited 8&9Old Station Business Park-Compton-Berkshire-RG206NE–UK或者在由D-半乳糖的三个近定量步骤中合成(cf.例如Li,Z.and Gildersleeve,J.C.J.Am.Chem.Soc.2006,128,11612-11619)。
苯基2-O-乙酰基-4,6-O-苯亚甲基-1-硫代-3-O-三氟甲磺酰基-β-D-半乳糖苷(2)
将化合物1(10.5g,29.2mmol)溶解在无水吡啶(4.73mL,58.4mmol)和无水CH2Cl2(132mL)中。该反应混合物在搅拌下冷却直到-20℃(冰和NaCl浴3:1)。在N2气氛下缓慢加入Tf2O(5.68mL,33.6mmol)。由TLC(庚烷:EtOAc，1:1以及甲苯:丙酮，10:1)监测反应混合物。当反应完成时，添加AcCl(2.29mL,32.1mmol)并且持续搅拌，温度升高到室温。也由TCL(庚烷:EtOAc，1:1以及甲苯:丙酮，10:1)监测该混合物。当它完成时，用CH2Cl2淬灭并且用5％的HC1、NaHCO3(饱和的，此后用sat表示)和NaCl(sat)洗涤。在MgSO4上干燥有机层、过滤并且在降低的压力下浓缩。
苯基2-O-乙酰基-4,6-O-苯亚甲基-1-硫代-β-D-古洛吡喃糖苷(Phenyl2-O-acetyl-4,6-O-benzyliden-l-thio-β-D-gulopyranoside)(3)
将四丁基亚硝酸铵(25.3g,87.7mmol)添加到化合物2(15.6g,29.2mmol)在DMF(110mL)中的溶液中，并且在50℃、N2气氛下持续搅拌。(该反应开始是紫色并且变成石榴红)。由TLC(庚烷:EtOAc，1:1以及甲苯:丙酮，10:1)监测该反应并且用CH2Cl2淬灭。用5％的HC1、NaHCO3(sat)和NaCl(sat)洗涤该混合物。在MgSO4上干燥有机层、过滤并且在降低的压力下浓缩，随后通过快速色谱(洗脱液庚烷:EtOAc，1:1以及庚烷:EtOAc，1:2)纯化并且从EtOAc和庚烷(1:3)的混合物中重结晶。1H NMR在CDC13中δ7.60-7.57(m,2H,Ar),7.43-7.40(m,2H,Ar),7.37-7.34(m,3H,Ar),7.29-7.25(m,3H,Ar),5.50(s,1H,PhCH),5.15(d,1H,J＝10.29Hz,H-l),5.10(dd,1H,J＝10.27Hz,2.85Hz,H-2),4.36(dd,1H,J＝12.49Hz,1.4Hz,H-6),4.18(br s,1H,H-3),4.08(dd,1H,J＝3.59Hz,1.04Hz,H-6),4.03(dd,1H,J＝12.53Hz,1.75Hz,H-4),3.88(s,2H,H-5+OH),2.12(s,3H,OAc)。
苯基2-O-乙酰基-4,6-O-苯亚甲基-1-硫代-3-O-三氟甲磺酰基-β-D-古洛吡喃糖苷(4)
将化合物3(1.00g,2.48mmol)溶解在无水CH2Cl2(12.5mL)和无水吡啶(0.40mL,4.96mmol)中。该反应混合物在搅拌下冷却直到-20℃(冰和NaCl浴3:1)。在N2气氛下缓慢加入Tf2O(0.48mL,2.85mmol)。由TLC(庚烷:EtOAc，1:1以及甲苯:丙酮，10:1)监测该反应混合物，并且当它完成时，用CH2Cl2淬灭并且用5％的HC1、NaHCO3(sat)和NaCl(sat)洗涤。在MgSO4上干燥有机层、过滤并且在降低的压力下浓缩直到变干。
苯基2-O-乙酰基-3-叠氮基-4,6-O-苯亚甲基-3-脱氧-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷(5)
将叠氮化四丁基铵(Tetrabutylammonium azide)(2.12g,7.44mmol)小心添加到化合物4(1.3256g,2.48mmol)在DMF(10mL)中的溶液，并且在50℃、N2气氛下持续搅拌。由TLC(E:H，1:1)监测该反应并且在降低的压力下浓缩，随后通过快速色谱(洗脱液庚烷:EtOAc，2:1以及庚烷:EtOAc，1:1)纯化。1H NMR在CDC13中δ7.61-7.58(m,2H,Ar)，7.44-7.41(m,2H,Ar),7.39-7.36(m,3H,Ar),7.30-7.24(m,3H,Ar),5.59(s,1H,PhCH),5.35(t,1H,J＝9.95Hz,H-2),4.73(d,1H,J＝9.63Hz,H-1),4.44(dd,1H,J＝6.24Hz,1.60Hz,H-6),4.35-4.34(dd,1H,J＝3.33Hz,0.88Hz,H-4),4.11(dd,1H,J＝12.48Hz,1.67Hz,H-6),3.57(d,1H,J＝1.15Hz,H-5),3.44(dd,1H,J＝10.21Hz,3.29Hz,H-3),2.17(s,3H,OAc)。
苯基2-O-乙酰基-3-叠氮基-3-脱氧-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷(6)
将化合物5(470mg,1.1mmol)溶解在80％的醋酸(75mL)中，并且在60℃加热该混合物。由TLC(庚烷:EtOAc，1:1)监测该反应。当该反应完成时，该混合物在降低的压力下浓缩并且加热。
苯基2,4,6-三-O-乙酰基-3-叠氮基-3-脱氧-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷(7)
将乙酸酐(30mL)添加到化合物6(373mg,1.1mmol)在无水吡啶(30mL)中的溶液中。由TLC(庚烷:EtOAc，1:1)监测该反应并且当它完成时，将它在降低的压力下浓缩。lH NMR在CDCl3中δ7.54-7.51(m,52H,Ar),7.35-7.30(m,3H,Ar),5.46(dd,1H,H-4),5.23(t,1H,H-2),4.73(d,1H,H-l),4.15(d,2H,H-6,H-6),3.94(dt,1H,H-5),3.68(dd,1H,H-3),2.18(s,3H,OAc),2.15(s,3H,OAc),2.06(s,3H,OAc)。
2,4,6-三-O-乙酰基-3-叠氮基-3-脱氧-α-D-半乳吡喃糖基溴化物(8)
将化合物7(237.4mg,560μmol)溶解在无水CH2Cl2(2mL)中，并且添加溴(32μl,620μmol)。由TLC(庚烷:EtOAc，1:1)监测该反应。当该反应完成时，将少量的环戊烯添加到反应混合物以去除剩下的Br2。该混合物在降低的压力下浓缩，并且通过快闪(quick Flash)色谱(洗脱液：500mL庚烷:EtOAc，2:1)纯化。
2,4,6-三-O-乙酰基-3-叠氮基-3-脱氧-α-D-半乳吡喃糖-1-异硫脲溴化物(9)
敏感的溴化物8(70.6mg,180μmol)被立即溶解在无水乙腈(1.7mL)中，并且在N2下用硫脲(13.7mg,180μmol)回流4小时。由TLC(庚烷:EtOAc，1:1)监测该反应，并且当它完成时，冷却该混合物。
双-(2,4,6-三-O-乙酰基-3-叠氮基-3-脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-硫烷(10)
将敏感的溴化物8(77.0mg,196μmol)和Et3N(60μl,430μmol)添加到最终混合物(9)。由TLC(庚烷:EtOAc，1:1)监测该反应。当它完成时，在降低的压力下并且不用加热而浓缩该反应混合物。通过快速色谱(洗脱液：庚烷:EtOAc，1:1)纯化残余物。1H NMR在CDCl3中δ5.50(dd,2H,H-4,),5.23(t,2H,H-2,H-2'),4.83(d,2H,H-l,H-l'),4.15(dd,4H,H-6，H-6,H-6',H-6')，3.89(dt,2H,H-5,H-5'),3.70(dd,2H,H-3,H-3'),2.19(s,6H,2OAc),2.15(s,6H,2OAc),2.18(s,6H,2OAc)。
双-(3-叠氮基-3-脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-硫烷(11)
将化合物(10)(160mg,0.00024mol)溶解在无水MeOH(2.6mL)和无水CH2Cl2(1.6mL)中，并且添加NaOMe(1M,24μL,24μmol)。由TLC(庚烷:EtOAc 1:1以及D:M 5:1)监测该反应。当该反应完成时，该混合物用Duolite C436中和直到pH为7，过滤并且用MeOH洗涤。在降低的压力下浓缩该过滤溶液。通过快速色谱(洗脱液：CH2Cl2:MeOH，5:1)纯化残余物从而给出纯的11(74.1mg,75％)。1H NMR在CDCl3中δ4.72(d,2H,J＝9.7Hz,H-l,H-l'),3.95(br s,2H,H-4,H-4'),3.84(t,2H,J＝9.8Hz,H-2,H-2'),3.74(dd,2H,J＝11.47Hz,7.23Hz,H-6,H-6')，3.64(dd,2H,J＝11.48Hz,4.72Hz,H-6,H-6')，3.60-3.55(ddd,2H,7.15Hz,4.67Hz,0.93Hz,H-5,H-5')，3.36(dd,2H,J＝10Hz,3.05Hz,H-3,H-3')。
双-{3-脱氧-3-[4-(3-氟苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基]-β-D-半乳吡喃糖基}硫烷(名为TD139)
在环境温度下由双-(3-叠氮基-3-脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-硫烷(11)和3-氟苯基乙炔(3eq.)至间连同Cu(I)(0.2eq)、三乙胺(2eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF,100mL/mmol硫烷)中的Cu(I)催化的环加成反应合成TD139。用tlc监测该反应直到完成，浓缩并且通过快速色谱(洗脱液：CH2Cl2:MeOH，8:1)第一次纯化，随后通过制备型hplc最后纯化从而以76％产率作为白色无定形固体给出TD139。1H-NMR(CD3OD,400MHz)d 8.59(s,2H,三唑-H),7.63(br d,2H,7.6Hz,Ar-H),7.57(br d,2H,8.4Hz,Ar-H),7.41(dt,2H,6,0和8.0Hz,Ar-H),7.05(br dt,2H,2.4和6.4Hz,Ar-H),4.93(dd,2H,2,4和10.4Hz,H3),4.92(d,2H,10.4Hz,H1),4.84(2H,10.4Hz,H2),4.18(d,2H,2.4Hz,H4),3.92(dd,2H,4.2和7.6Hz,H5),3.84(dd,2H,7.6和11.4Hz,H6),3.73(dd,2H,4.2和11.4Hz,H6)；FAB-HRMS m/z对于C28H30F2N6NaO8S(M+Na+)，计算为671.1712；发现为，671.1705。
博来霉素诱导的肺纤维化的模型
用氟烷(halothane)麻醉雌性C57/B16小鼠(10-14周龄)，气管内给予博来霉素或生理盐水(33μg溶于50μl的生理盐水中)，并且在第26天收获肺。在博来霉素诱导肺损伤的第18、20、22和24天将TD139缓缓滴入小鼠的肺中。通过胶原蛋白染色的肺切片的组织学评分并且通过Sircol分析的总胶原蛋白含量来评估纤维化。
用博来霉素(bleo)或生理盐水(对照)处理小鼠，并且在第18-24天用200mg/kg的吡非尼酮处理经博来霉素处理的小鼠每天两次。在第18、20、22和24天气管内给予TD139。在第26天收获肺。
图1示出(A)通过Sircol分析测量的总肺胶原蛋白；(B)纤维化评分；以及(C)炎症评分。结果代表每组n＝8只小鼠(n＝7bleo)的平均值和SEM(A)或箱(box)和须(whiskers)(中值、四分位差、最小到最大，B和C)。***P<0.005,**P<0.01,*P<0.05。图1E)通过评分用抗活化β-连环蛋白染色的博来霉素处理的小鼠肺(对照和10ug TD139处理)的切片来评估体内β-连环蛋白活化。
对肺泡上皮细胞的影响
来自WT小鼠的原代肺泡上皮细胞铺板并且在存在或不存在10μMTD139情况下用TGF-β1处理。图1D)细胞被裂解并且通过蛋白免疫印迹分析活化的β-连环蛋白、总β-连环蛋白和β-肌动蛋白。
总之，TD139是半乳凝集素-3抑制剂并且阻断体外TGF-β-诱导的β-连环蛋白活化和体内博来霉素诱导的肺纤维化，并且其被认为代表用于治疗哺乳动物特别是人的肺纤维化的新的治疗策略。
药物处理
小鼠被分成下面表1列出的组：
免疫组织化学
根据制造商的说明用马松(Masson)三色和苏木精-伊红(H&E)染色小鼠组织的石蜡包埋切片。切片被处理用于免疫组织化学并且使用下面的第一抗体：小鼠抗活化(ABC)β-连环蛋白(Millipore)并且可视化和量化切片。表1
分组 归纳 处理 剂量 给药天 给予
1 对照 媒介物 N/A
2 博来霉素 媒介物 18、20、22和24 气管内
3 博来霉素 TD139 10ug 18、20、22和24 气管内
4 博来霉素 TD139 3ug 18、20、22和24 气管内
5 博来霉素 TD139 1ug 18、20、22和24 气管内
6 博来霉素 TD139 0.1ug 18、20、22和24 气管内
7 博来霉素 吡非尼酮 200mg/kg 从第18天b.i.d. 口服
测定肺纤维化和炎症
在马松三色染色的切片中进行组织学肺部炎症和纤维化评分。使用以下系统在放大率X630、在>5的随机场中评分炎症(细支气管周围的、血管周围的和肺泡壁厚度)：细支气管周围的和血管周围的，1＝没有细胞，2＝<20个细胞，3＝20-100个细胞，4＝>100个细胞；肺泡壁厚度，1＝没有细胞，2＝2-3个细胞厚，3＝4-5个细胞厚，4＝>5个细胞厚。组合的炎症评分是这些评分的总和。纤维化评分被评价为对于胶原蛋白阳性染色的切片的面积(1＝没有，2＝<10％，3＝<50％，4＝>50％)。只有其中大部分视场由肺泡组成的视场被评分。
通过sircol分析测定肺胶原蛋白
根据制造商的说明通过sircol分析测定左肺叶中的胶原蛋白含量。在5mL的在0.5M的醋酸中的3mg/ml的胃蛋白酶中切碎左肺叶，并且在4℃振荡孵育24h。用0.8mL的sircol试剂室温孵育澄清的肺提取物(0.2mL)1h，并且在4℃、以10,000g离心沉淀的胶原蛋白5min。将颗粒溶解在1ml1M NaOH中，并且与胶原蛋白标准并排(alongside)在570nm测量吸光度。
原代II型肺泡上皮细胞分离
遵照标准方法提取经处理的和对照小鼠II型肺泡上皮细胞(AEC)。简略地，1ml的50U/ml的分散酶(BD Biosciences)气管内给予至灌注的肺中，随后滴注0.5ml的1％的低熔点琼脂糖。上呼吸道内的琼脂糖被允许放置在冰上2分钟并且肺被放置在4ml的50U/ml的分散酶中在室温45min。然后将减去上呼吸道的肺叶分散于包含50μg/ml的DNA酶I(Sigma-Aldrich,UK)的DMEM中。细胞悬液经过100μm的细胞过滤器并且在DMEM中洗涤细胞，随后在包含10％的FCS的DMEM中再悬浮。细胞悬液铺在组织培养塑料板上1h以允许任何受污染的成纤维细胞和巨噬细胞粘附。计数非粘附的上皮细胞，并且在预涂有5μg/ml的胶原蛋白(AMS Biotechnology)和10μg/ml的纤连蛋白(Sigma-Aldrich)的组织培养塑料板或者在盖片(cover-slip)上培养2天。在处理前在PBS中洗涤细胞三次。上皮细胞在包含10％的FCS、50U/ml的青霉素、50μg/ml的链霉素和5μg/ml的L-谷氨酰胺的DMEM中孵育，或者转移到完全小鼠培养基(DMEM/F-12，包含0.25％的BSA、10nM的氢化可的松、5μg/ml的胰岛素-转铁蛋白-钠-亚硒酸盐(ITS)并且补充有0.1mg/ml的琥珀酸钠、75μg/ml的琥珀酸和1.8μg/ml的酒石酸氢胆碱(choline bitartrate))。
蛋白免疫印迹
在25mM的HEPES pH 7.4、0.3M NaCl、1.5mM MgC12、0.2mMEDTA、0.5％triton X-100、0.5mM二硫苏糖醇、1mM原钒酸钠和蛋白酶抑制剂(Boehringer Mannheim,Sussex,UK；按照制造商的说明制备)中裂解细胞。使用Pierce BCA蛋白测定试剂(Pierce)针对蛋白质平衡裂解产物，并且在12％的SDS-PAGE胶上解析。使用下面的一抗进行蛋白免疫印迹：兔抗β-连环蛋白(BD Biosciences)、兔多克隆抗-β-肌动蛋白抗体(Sigma,UK)、鼠抗-活化(ABC)β-连环蛋白(Millipore)。
实施例1测量在人肺活组织检查中的半乳凝集素-3水平：
活组织检查采样自患有普通型间质性肺炎(UIP，IPF的最常见原因)的患者。在包埋到固体石蜡用于切片前，在中性缓冲的福尔马林中固定活组织检查12-24h。切下5um的切片并且转移到载玻片上。切片在二甲苯中脱蜡10min并且通过把载玻片置于梯度乙醇(100％-95％-80％-70％-50％-水)中每个2min再水化。在0.01M的柠檬酸pH 6.0中通过微波切片进行抗原修复15min。在流动的自来水中冷却后，通过在1％的过氧化氢溶液中孵育15min封闭过氧化物酶。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冲洗载玻片，并且使用无血清蛋白封闭以及亲和素/生物素封闭试剂盒(VectorLaboratories,USA)封闭非特异性结合。在4℃用来自Novocastra的小鼠单克隆抗人半乳凝集素-3克隆9C4(在抗体稀释液(DAKO,UK)中稀释至1:100)孵育切片过夜。在用PBS清洗3次后，用生物素化的兔抗小鼠IgG(H+L)二抗(在抗体稀释液中1:200稀释)室温孵育切片30分钟。用PBS冲洗载玻片3次，并且用3滴亲和素:生物素化的酶复合物(R.T.U.VectastainElite ABC Reagent,PK-7100,Vector Labs,Burlingame,CA,USA)孵育30min，随后用液体二氨基联苯胺(DAB)(液体DAB+Substrate ChromogenSystem,K3468,Dako UK Ltd,Cambridgeshire)在黑暗中孵育10分钟。
在PBS中冲洗载玻片3次，用Mayers苏木精(ThermoShandon,UK)复染色30秒，并且在Scotts自来水(83mM MgSO4,7.1mM NaHCO3溶于自来水)中30秒，经过梯度乙醇(70％、90％、100％每个2min)脱水，并且在二甲苯中清除。使用Pertex装片溶液(CellPath Hemel Hempstead,UK)装裱载玻片。
通过光学显微镜可视化切片。
在患有UIP的患者的肺中的纤维增生的区域中半乳凝集素-3明显上调。
实施例2测量在人血清或人支气管-肺泡灌洗液中半乳凝集素-3水平的方法：
1.用没有载体蛋白的PBS将捕获抗体稀释到工作浓度。用100μL/孔的稀释的捕获抗体立即涂布96孔微孔板。密封该板并且室温孵育过夜。
2.抽吸各孔并且用洗涤缓冲液洗涤，重复该过程两次以达到总共三次洗涤。使用喷瓶、歧管分液器或自动洗涤剂通过用洗涤缓冲液(400μL)装满每个孔洗涤。完全的除去每一步的液体对于良好的性能是必要的。在最后一次清洗后，通过抽气或通过颠倒板并且用干净的纸巾吸水来除去任何残留的洗涤缓冲液。
3.通过添加300μL的试剂稀释液到每个孔来封闭板。室温孵育至少1小时。
4.重复如在步骤2中的抽吸/洗涤。该板现在已经为样品加入做好准备。
测定方法
1.添加100μL/孔的试剂稀释液或合适的稀释液中的样品或标准品。用胶带覆盖并且室温孵育2小时。
2.重复如在准备板的步骤2中的抽吸/洗涤。
3.将100μL的稀释于试剂稀释剂中的检测抗体添加到每个孔。用新的胶带覆盖并且室温孵育2小时。
4.重复如在准备板的步骤2中的抽吸/洗涤。
5.将100μL的链霉亲和素-HRP的工作稀释液添加到每个孔。覆盖板并且室温孵育20分钟。避免将板放在直射光中。
6.重复如步骤2中的抽吸/洗涤。
7.将100μL的基质溶液添加到每个孔。室温孵育20分钟。避免将板放在直射光中。
8.将50μL的终止溶液添加到每个孔。轻拍板以确保充分混合。
9.使用设置到450nm的酶标仪立即测定每个孔的光密度。如果波长校正是可用的，则设置到540nm或570nm。如果波长校正是不可用的，则从450nm处的读数中减去在540nm或570nm处的读数。该减法将校正板中的光学不完整性(imperfection)。没有校正的直接在450nm处读出的读数可能较高或不精确。
实施例3测量来自患者和对照的血清中半乳凝集素-3水平：
血清采样自患有UIP的患者、患有非特异性间质性肺炎(NSIP)以及年龄匹配的对照。水平使用实施例2中描述的ELISA方法测量半乳凝集素-3。在测定之前采集血清并于-80℃存储。在测定之前样品通常按1:10稀释在PBS中。如制造商方案中所描述的进行ELISA：
在患有稳定的IPF(UIP)的6个患者的血清中的连续测量半乳凝集素-3(有时2-5次)。稳定的IPF被界定为在运动耐量、呼吸急促(气急。breathlessness)或肺功能方面无显著的变化。半乳凝集素-3在患有IPF的患者的血清中是升高的(对照17.9±0.95ng/ml n＝8，IPF 26.7±4.7ng/ml n＝6，P<0.05)，但是在患有非特异性间质性肺炎(NSIP)的患者中没有升高(血清浓度14.57±0.84ng/ml(n＝10))。
随着时间的推移在这些患者体内半乳凝集素-3的血清水平保持非常恒定(血清半乳凝集素-325.5±0.8ng/ml n＝23)。我们测试来自正在经历IPF的急性加重的患者的5个血清样品。这些患者被界定为具有由降低的运动耐受性、降低的肺功能和增加的呼吸急促的急性加重。在这些患者中，血清半乳凝集素-3急剧上升，73.8±12.2ng/ml。此外，我们发现2位患者，他们在其IPF的急性加重之前和期间具有连续的半乳凝集素-3测量。两位患者在当他们的肺功能稳定的时期期间表现出稳定的半乳凝集素-3血清水平。然而，在急性加重期间当肺功能下降时，在血清半乳凝集素-3大幅上升。
实施例4测量来自患者和对照的BAL液中的半乳凝集素-3水平：
使用标准技术，从IPF患者和年龄匹配的对照那采样支气管-肺泡灌洗(BAL)液。简略地，支气管窥镜通过嘴或鼻子进入肺中，并且用特定量的生理盐水冲洗小的肺切片。采集BAL液并且于-80℃存储。使用实施例2中描述的ELISA方法测量半乳凝集素-3的水平。
与年龄匹配的对照相比，在来自IPF患者的BAL样品中半乳凝集素-3水平显著提高(对照18.8±3.6ng/ml n＝16，IPF 39.7±3.7ng/ml n＝15，P<0.01)。

Claims (22)

1.一种用于肺部给予的组合物，其中，所述组合物包含式(I)的化合物
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述式(I)的化合物是为游离形式的双(3-脱氧-3-(3-氟苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)-β-D-半乳吡喃糖基)硫烷。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述式(I)的化合物是晶体形式。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述肺部给予是通过雾化器进行的。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述设备是雾化器，所述雾化器选自超声雾化器或喷射式雾化器。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述式(I)的化合物是在溶液中。
7.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述式(I)的化合物是在悬浮液如纳米悬浮液中。
8.根据权利要求4或5所述的组合物，其中，所述式(I)的化合物是脂质体制剂。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述肺部给予是通过干粉吸入器进行的。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述式(I)的化合物作为纳米粒子存在。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述式(I)的化合物是脂质体制剂。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述肺部给予是通过加压计量吸入器进行的。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述式(I)的化合物是在溶液中。
14.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述式(I)的化合物是在悬浮液如纳米悬浮液中。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的组合物，用于在治疗肺纤维化的方法中使用。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中，所述肺纤维化是IPF。
17.根据权利要求1-5、7-16中任一项所述的组合物，其中，所述式(I)的化合物以合适的粒径存在，所述合适的粒径选自具有0.1μm和20μm之间的平均质量空气动力学直径，如0.5μm和10μm之间、如1μm和5μm之间的MMAD的颗粒。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是药物组合物。
19.根据权利要求18所述的组合物，包含药学上可接受的添加剂。
20.一种用于肺部给予的设备，包含权利要求1-19中任一项所述的组合物。
21.根据权利要求20所述的设备，其中，所述设备是雾化器或干粉吸入器。
22.根据权利要求21所述的设备，其中，所述设备是雾化器，所述雾化器选自超声雾化器或喷射式雾化器。
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