CN104744439A - 8-羟基喹啉类ntr1小分子拮抗剂及应用 - Google Patents

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徐峰
张果
李晓丹
王坤
田园诗
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    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
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Abstract

8-羟基喹啉类NTR1小分子拮抗剂及应用。本发明涉及药物设计学和药物学领域。本发明通过虚拟筛选和细胞活性测试以及基于受体的结构修饰，提供了具有下列通式的8-羟基喹啉类化合物，在制备与NTR1蛋白相关的疾病的药物中具有重要用途：其中，R1是氢或体积较大的疏水性基团，R2是芳香环。所述化合物对NTR1具有抑制活性。

Description

8-羟基喹啉类NTR1小分子拮抗剂及应用
技术领域
本发明涉及药物设计学和药物学领域，具体而言，涉及经虚拟筛选及细胞活性测试，并进行基于受体的结构修饰得到的一系列8-羟基喹啉类NTR1小分子抑制剂的结构。
背景技术
G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptor，GPCR)具有七次跨膜结构，在体内广泛分布，参与对各种信号分子的应答活动。GPCR及其信号转导系统通常处于动态平衡，并根据各种生理因素的改变而启动下游信号通路的调节，维持细胞内环境的稳定；在病理条件下，细胞同样通过GPCR接受外界信号对细胞生命活动进行调节。尤其在恶性肿瘤细胞中，GPCR通过介导肿瘤细胞的信号转导过程，对肿瘤细胞的发生、生长、侵袭与转移等过程进行调节，几乎在所有的恶性肿瘤细胞中，都能够检测到某类GPCR分子的非正常表达。GPCR的过度激活或抑制均可能导致细胞内信号转导途径的失调，从而引起紊乱的生理反应，导致异常的生理现象。
GPCR超家族中A类成员神经降压素受体1(NTR1)蛋白主要分布在中央神经系统和肠胃系统中，介导细胞内Gq蛋白信号传导通路，调控细胞内钙离子的浓度水平。该蛋白的天然激动剂神经降压素(NT)是一个13肽，其中六个氨基酸Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu起关键作用。近年来发现NT和NTR1在多种恶性肿瘤(乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌等)的生长、增殖、侵袭、转移中起到关键的作用。有文献报道在正常乳腺上皮细胞和浸润性乳腺癌的癌组织中均有NT的表达，而NTR1只在乳腺癌的癌组织和肿瘤细胞系中高表达，在乳腺浸润性导管癌中NTR1表达率高达91％。动物实验研究证实NTR1能够促进移植瘤细胞的生长并且能缩短瘤细胞倍增时间，诱导移植瘤的侵袭和转移。因此，NTR1的拮抗剂会对肿瘤的发生发展起到一定的抑制作用，有望成为治疗肿瘤等疾病的有效药物。鼠源NTR1的晶体结构于2012年被成功解析出来，这为基于受体的药物设计和化合物的优化改造提供了有利条件。
本实验室前期已建立一个针对NTR1的含有10000个小分子的数据库，有效地提高了筛选速度。目前，文献中已报道多个针对NTR1靶标的拮抗剂，从已知的拮抗剂出发，有助于建立药效团模型和2D-Fingerprint的筛选方法，从而寻找新型小分子拮抗剂。
发明内容
现有的以NTR1为靶点的新药研发尚未出现上市药物，且由于那时NTR1的晶体结构未被解析，只能根据同源建模得到的三维结构进行药物筛选和设计。本发明目的是基于已经解析得到的鼠源NTR1蛋白的三维晶体结构，对整合了多个化合物数据库得到的NTR1小分子数据库进行虚拟筛选并对筛选结果进行细胞活性测试，对具有活性的小分子进行基于受体的结构修饰，以寻求对NTR1具有抑制活性的小分子化合物，用于制备与NTR1相关的疾病的药物。
本发明经过虚拟筛选和细胞活性测试及结构修饰，得到的8-羟基喹啉类NTR1小分子拮抗剂化合物如通式Ⅰ所示，
其中：
R1是氢，或二环[2,2,2]辛烷基、金刚烷基、苯基、萘基、C3-C6烃基或环烷烃基体积较大的疏水性基团；
R2是甲基或三氟甲基等取代的苯环或吡啶环芳香环；
本发明筛选并经细胞活性测试得到的具有抑制活性的小分子化合物(1)为R1是氢，R2是甲基取代的吡啶环，其结构如下，IC50值为36.84μM。
本发明提供的8-羟基喹啉类化合物可应用于与NTR1蛋白相关疾病的药物制备中。
本发明的优点和有益效果：
本发明通过虚拟筛选及细胞活性测试，结果证明，本发明所述筛选得到NTR1小分子拮抗剂——化合物(1)对细胞内钙离子浓度有较好抑制活性。进而通过对NTR1与配体结合的口袋的亲疏水性、氢键供受体、电荷性质等进行分析，根据化合物(1)与NTR1对接的结果及打分，在某些部位进行基团的增删及替换，并进行对接验证，从而对化合物(1)进行结构改造及修饰，得到一系列8-羟基喹啉类化合物，这些化合物可通过作用于体内的NTR1从而参与其调节机制，用于制备治疗或辅助治疗肿瘤、帕金森疾病、精神分裂症等疾病的药物，具有良好的药物应用前景。
附图说明
图1是化合物(1)与NTR1的相互作用示意图。
图2是修饰后化合物(2)与NTR1的相互作用示意图
图3是化合物(1)的Ca2+荧光值对化合物浓度对数的曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。但这些实施例不意味着对本发明有任何限制。
实施例1、NTR1小分子抑制剂的虚拟筛选和细胞活性测试
一、本发明的虚拟筛选的方法包括以下4个步骤：
步骤1：NTR1小分子数据库的构建
整合多个商业小分子数据库(包括ZINC、SPECS、J&K Screening Library、InterBioScreening、Timtec、Msdiscove、Iris-biotech、TCM Database、Ambinter NaturalProducts、AnalytiCon Discovery NP、Princeton NP、Molecular Diversity PreservationInternational、PUBCHEM)，用Pipeline pilot软件从中剔除重复的分子和结构相似的分子，并根据计算的分子的ADMET性质挑选出吸收好、毒性低的化合物进行Cluster，得到100万个小分子的数据库。用Schrodinger中的Glide模块将这些小分子与NTR1进行SP精度的对接，选取结果中打分前10000的小分子，构成NTR1小分子数据库。
步骤2：药效团模型的构建及筛选
从BindingDB数据库中找出6个活性较好、结构差异较大的化合物(如下所示)作为训练集，利用Discovery Studio3.5中的Create Pharmacophore Automatically模块建立药效团模型，经测试集验证及FitValue值确定最合适的药效团模型，该模型包括2个疏水中心、1个芳香环中心、1个氢键供体。采用Search 3D Database对NTR1小分子数据库进行筛选。
训练集分子
步骤3：Fingerprint筛选
将BindingDB中得到的3个活性化合物(结构式如下)和11个非活性化合物分别采用Discovery Studio3.5中的Fingerprint模块，同NTR1小分子数据库进行2D-Fingerprint，将活性化合物Fingerprint结果中结构与非活性化合物Fingerprint结果中结构相似的化合物除去，再从中挑选结构未经发表和报道的化合物。
3个活性化合物
11个非活性化合物
步骤4：聚类分析
将步骤2中药效团模型筛选和步骤3中Fingerprint筛选得到的结果用DiscoveryStudio3.5中的Design and Analyze Libraries下的Cluster模块进行聚类分析，共分成99类，从每一类中选出1个分子，得到99个化合物。购买这些化合物并对其进行细胞活性测试。
二、本发明的细胞活性测试方法包括以下2个步骤：
步骤1：NTR1稳转CHO细胞表达体系的构建
用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃，5％CO2，饱和湿度的条件下培养CHO细胞。将含有PUC57-NTR1重组质粒(酶切位点为EcoR Ⅰ和HindⅢ)的DH5α甘油菌，转化，扩增，提取重组质粒PUC57-NTR1，双酶切PUC57-NTR1和表达载体pcDNA3.1(+)，回收目的基因NTR1和表达载体pcDNA3.1(+)，将NTR1和pcDNA3.1(+)连接，连接产物转化DH5α感受态细菌，用氨苄青霉素筛选出阳性克隆，扩增，提取质粒，命名为pcDNA3.1(+)-NTR1。用pcDNA3.1(+)-NTR1重组质粒转染CHO细胞，同时用只转染pcDNA3.1(+)表达载体的CHO细胞作阳性对照。用G418筛选稳定转染的CHO细胞进行克隆，传代扩大培养，得到单克隆化的人源系。
步骤2：化合物对NTR1稳转CHO细胞的活性测试
NT是NTR1的天然配体，NT与NTR1结合后，通过偶联的Gq蛋白激活的信号传递途径可以引起细胞内钙离子浓度的升高，而对NTR1具有抑制活性的小分子化合物则能够抑制细胞内钙离子浓度的升高，因此可以通过检测加入NT和小分子化合物后细胞内的钙离子浓度是否升高，来判断小分子化合物是否对NTR1具有抑制活性。SR48692是已报道的NTR1的选择性拮抗剂，可拮抗NT的活性。
采用钙6试剂盒，首先进行预实验。在96孔板中加入1nM的NT后，分别加入10μM和100μM待测化合物，测定每个化合物在10μM和100μM浓度下的钙流值，选取在10μM有抑制活性的化合物，初步推测其大概的IC50值。然后以此IC50值为中心，按1:2的比例等比拉8个浓度梯度，测定不同浓度下化合物的钙流值，并分别以NT和SR48692作为阴性和阳性对照，得到钙离子荧光值-化合物浓度曲线。根据该曲线采用GraphPad Prismversion5.0软件计算各个小分子化合物的IC50值。
用上述虚拟筛选和细胞测活方法，筛选得到了对NTR1具有抑制活性的小分子化合物：7-[(3-乙氧基-4-羟基苯基)[(4-甲基-2-吡啶基)氨基]甲基]-8-羟基喹啉，即化合物(1)，其IC50值为36.84μM(图3)。
实施例2、基于小分子与受体NTR1的作用方式进行结构修饰。
首先在Discovery Studio3.5中打开NTR1蛋白的三维晶体结构，该结构来自PDB(ProteinData Bank)，PDB号为4GRV。对其进行加氢，去水，删去插入的T4溶菌酶结构，采用Prepare Protein模块对蛋白进行准备，并用Define Site根据配体中的NT找到活性位点。采用Prepare Ligands模块对小分子进行准备。准备完毕，采用Dock Ligands模块的Libdock方法进行对接，对接结果如图1所示。根据该对接结果可知，在喹啉环的4位引入疏水性基团——丙基，即化合物(2)。该修饰能够更好的占据结合口袋，使配体分子与之更加契合，如图2所示。采用实施例1中的细胞活性测试方法对修饰后得到的化合物(2)进行测活，并用计算其IC50值。得到的化合物(2)IC50值为32.54μM。
这里以此修饰为例，在于说明具体的实施方法，但并不能作为限制。

Claims (5)

1.8-羟基喹啉类NTR1小分子拮抗剂的化合物，具有如式Ⅰ所示的结构，
其中，R1是氢或体积较大的疏水性基团；R2是芳香环。
2.根据权利要求书1所述的化合物，其特征在于，所述体积较大的疏水性基团是二环[2,2,2]辛烷基、金刚烷基、苯基、萘基、C3-C6烃基或环烷烃基。
3.根据权利要求书1或2所述的化合物，其特征在于，所述芳香环是甲基或三氟甲基取代的苯环或吡啶环。
4.根据权利要求书3所述的化合物，其特征在于，所述化合物中R1是氢，R2是甲基取代的吡啶环，其结构如下，
5.权利要求1所述化合物在制备与NTR1蛋白相关疾病的药物中的应用。
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