CN104730123A - 基于“Y”结点探针的双通道传感器检测急早粒PML/RARα基因序列的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于“ Y ”结点探针的双通道传感器检测急早粒 PML/RARα基因序列的方法。待检测基因为急性早幼粒细胞白血病的PML/RARα融合基因的dsDNA片段，包括如下步骤：根据所选择的待检测APL基因型别通用引物序列的融合位点，对APL的特异性序列进行设计及合成两组特异性的“Y”结点探针；采用“Y”结点探针、内切酶特异性剪切作用与电化学酶联放大技术实现同时检测 APL的PML/RARα融合基因双链 DNA 中的两条互补链。采集两组探针与靶标dsDNA中相对应的互补ssDNA链杂交后催化产生的电流信号并进行计算处理，可定量检测靶标dsDNA。该法实现了对急性早幼粒细胞白血病的早期诊断，同时也有望应用于其它疾病相关基因dsDNA的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于“Y”结点探针的双通道传感器检测急早粒PML/RARα基因序列的方法，属于生物传感技术领域。
背景技术
急性早幼粒细胞白血病(APL)是急性髓细胞白血病(AML)FAB分型中的M3亚型，是严重危害人类健康的恶性血液病之一。它起病急，迅速恶化，表现十分凶险，出血倾向明显，易发生弥漫性血管内凝血，死亡率高，治疗比较困难。白血病早期诊断(基因诊断)水平将直接影响患者的治疗效果及生存质量，其重要意义不言而喻。
目前临床上常用的检测方法主要有流式细胞技术、FISH技术、染色体分析法、RT-PCR技术等，但都存在一定的局限性，如价格昂贵、操作繁琐、灵敏度不高等。因此，研发一种高敏感性、高选择性的APL相关基因的检测技术具有极其广阔的临床应用前景。
APL最为常见的染色体易位为t(15；17)(q22；q21)，其易位产物PML/RARα融合基因发生于95％的APL中，是恶性克隆的标志基因。
临床样品中，待测DNA通常以双链大片段形式存在，双链片段中与靶标ssDNA互补的另一条DNA序列容易对DNA探针分子的检测造成干扰。利用单通道电化学DNA生物传感器检测基因序列，其单探针捕获靶标dsDNA的过程存在干扰分子识别及降低杂交效率等不足。因此，为解决单通道电化学DNA生物传感器的局限性，对原有单组DNA探针分子进行优化，设计了基于双组探针检测的新型传感检测方法，即将两组分别与待测靶标dsDNA两条序列部分互补的捕获探针修饰在双通道电化学DNA阵列传感器不同通道的电极表面，通过双通道电化学阵列传感器实现对靶标dsDNA两条序列的同时检测，有利于提高探针与dsDNA的杂交效率，有助于阵列传感器日后实现对临床实际样品中dsDNA的直接检测。
DNA探针分子作为多通道电化学DNA阵列传感器设计的关键，其与待测靶标DNA之间的序列选择性对DNA阵列传感器的性能具有很大的影响，而经典传感器中，所设计的ssDNA探针多数存在稳定性差的问题。所以，研制高灵敏度和高特异性的DNA探针，并将其应用于与靶标DNA序列间杂交信息的检测具有重要意义。结点探针检测技术是一种新型的DNA探针检测技术。该检测技术包含有两条部分互补的探针，在特定的温度下，如果溶液中不存在靶标DNA，则这两探针互补序列间无法形成双链，当溶液中存在靶标DNA时，两条探针会与靶标DNA形成一种形似“Y”字型的三元结构，实现对靶标DNA的检测。该检测方法具有很强的特异性，能够很好的识别单碱基错配。而如何放大检测目标的量是影响传感器检测性能的另一个重要问题。限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，又被简称为内切酶。将其引入到电化学DNA生物传感器的设计中，构建了基于内切酶特异性剪切作用的超灵敏电化学DNA生物传感器，可以达到通过酶催化放大信号的目的。
下面所述的为本发明人率先将基于双“Y”结点探针的双通道电化学传感检测方法应用于快速检测PML/RARα融合基因dsDNA片段：本实验针对APL中PML/RARα融合基因dsDNA的相关碱基序列，设计了两组“Y”结点探针(包含了捕获探针和辅助探针)，并利用限制性内切酶循环剪切作用和酶联放大技术相结合构建一种新型的双通道电化学DNA阵列传感模式，并将其用于人工合成的PML/RARα融合基因dsDNA的检测。
该传感器包含有两组检测探针，每组探针各包含有一条两端分别修饰巯基和生物素的捕获探针(Capture probe,C)和一条存在部分序列与捕获探针相互互补的辅助探针(Assistantprobe,A)。且这两组探针(C1/A1和C2/A2)分别与靶标dsDNA中相应的两条序列(S1a和S1b)部分互补。以探针C1/A1/S1a为例，捕获探针C1的3’端和5’端分别修饰有生物素和巯基，其5’端半片段与靶标dsDNA中的S1a序列3’端部分互补且具有较高的解链温度，3’端半片段与辅助探针A1的5’端半片段序列互补且解链温度较低，内切酶酶切位点就在C1/A1的互补结构中。而辅助探针基因A1的3’端半片段又与靶标dsDNA中的S1a序列5’端序列互补。同样的探针C2/A2与S1b之间也存在着两两间互补，且C2与A2之间互补部分的解链温度远低于其它互补部分的解链温度，而C2/A2的互补结构中内切酶酶切位点序列与C1/A1相同。实验前，先把过量的辅助探针基因A1和A2加入到含有待测靶标dsDNA(S1a和S1b)的杂交溶液中进行热变性，然后置于冰浴中待测。接着通过巯基自组装过程将C1和C2分别固定到不同通道中的工作电极表面，然后将修饰了C1和C2的两个工作电极放入含有辅助探针基因A1、A2和靶标dsDNA(S1a和S1b)的待测溶液中进行杂交反应，同时在杂交溶液中加入限制性内切酶(Rsa I)。辅助探针基因A1和A2分别与靶标dsDNA中相应的S1a和S1b形成两个稳定杂交体，有效阻止了靶标DNA的自身复性，同时这两个杂交体(A1/S1a和A2/S1b)中各自一侧辅助探针与靶标DNA其余序列又可与固定在电极上的相应的捕获探针杂交，在两个工作电极表面分别形成特殊的“Y”结点构型，此时限制性内切酶Rsa I能够识别捕获探针基因与辅助探针基因(C1/A1和C2/A2)所形成的双链结构中特定的酶切位点，对其进行剪切，使得捕获探针修饰的生物素游离了出来，同时也破坏了“Y”结点构型的稳定性，S1a和S1b被释放到溶液中，开始新一轮的杂交过程。随着“杂交-剪切-释放”过程不断循环，经过一定时间后，电极表面上存在的生物素越来越少，进而使得能够固定到电极表面的亲和素修饰的辣根过氧化物酶(avidin-HRP)数量急剧减少，因此，双通道电化学DNA阵列传感器检测到的电流信号也随之降低。若溶液中不存在靶标dsDNA，则无法形成稳定的“Y”结点构型，由于捕获探针基因与辅助探针基因(C1/A1和C2/A2)之间的互补序列解链温度较低，因此无法进行杂交，Rsa I寻找不到酶切位点就无法将生物素从电极表面剪切下来，于是avidin-HRP能够固定到电极面上产生较大的电流信号。该传感模式通过“Y”结点检测探针、限制性内切酶特异性循环剪切作用和酶的催化功能，极大地增强了该检测方法测定双链DNA的特异性及灵敏度，从而建立了高灵敏度、高特异性的急性早幼粒细胞白血病基因检测方法，应用于有效解决急性早幼粒细胞白血病早期诊断这一临床迫切的实际问题，无疑具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于双“Y”结点探针的双通道电化学传感器以及检测急性早幼粒细胞白血病双链PML/RARα融合基因序列的方法，旨在解决临床实际样品中DNA多以双链片段形式存在，双链片段中与靶标单链DNA相互补的另一条DNA链容易对探针的检测造成干扰，影响检测效果，且现有检测方法灵敏度低、检测周期长、价格昂贵等。
本发明的目的是这样实现的，所述的基于“Y”结点探针的双通道电化学传感器，包含有两组检测探针，其特征在于1)所述两组检测探针采用两组“Y”结点检测探针，其中一组是捕获探针和辅助探针，另一组是捕获探针和辅助探针，所述一组捕获探针的基因采用，3’修饰生物素，5’端巯基标记：5’-SH-TTTT TTT TTT GGG TCT CAA TGG TGT ACA G-biotin-3’；一组的辅助探针的基因采用：5’-CTG TAC ACT GCC TCC CC-3’；另一组的捕获探针的基因采用，3’修饰生物素，5’端巯基标记：5’-SH-TTTT TTT TTT GGG AGG CAGAAG TAC TA-biotin-3’；另一组的辅助探针的基因采用：5’-TAG TAC TTC CAT TGA GACCC-3’；将两个捕获探针的基因通过其修饰有的巯基分别自组装固定在不同通道上的两个型号相同的金电极表面，对两个金电极表面未结合的位点通过封闭剂进行封闭；2)将上述两个辅助探针的基因提前混于含有靶标dsDNA的杂交溶液中，通过高温变性使靶标双链DNA解链成单链，并将变性后的杂交溶液置于冰浴中保持杂交溶液中DNA单链状态，同时加入一定量的限制性内切酶Rsa I；3)将分别修饰了两个捕获探针的基因的两个金电极工作电极放入上述的含有限制性内切酶Rsa I和两个辅助探针的基因的靶标dsDNA待测杂交溶液中进行杂交反应；上述的两个辅助探针的基因分别与靶标dsDNA中相应的DNA片段S1a和DNA片段S1b形成两个稳定杂交体，有效阻止了靶标DNA的自身复性，同时这两个稳定杂交体中各自杂交有的辅助探针的基因与靶标DNA其余未杂交的序列又可与固定在金电极表面上的相应的捕获探针杂交，在每个工作电极表面分别形成特殊的“Y”结点构型，在“Y”结点构型中金电极表面上的捕获探针作为“Y的下部支撑杆”，两个稳定杂交体分别与不同捕获探针相应的互补部分进行杂交后，其中含有的辅助探针的基因的杂交体部分作为“Y的两分叉”)，此时限制性内切酶Rsa I能够识别捕获探针的基因与辅助探针的基因所形成的双链结构中特定的酶切位点，对其进行剪切，使得捕获探针修饰的生物素游离了出来，同时也破坏了“Y”结点构型的稳定性，DNA片段S1a和DNA片段S1b被释放到杂交溶液中，开始新一轮的杂交过程，随着“杂交-剪切-释放”过程不断循环，经过一定时间后，金电极表面上存在的生物素越来越少；4)在杂交溶液中加入亲和素修饰的辣根过氧化物酶，通过辣根过氧化物酶(HRP)上的亲和素(avidin)，根据亲和素与生物素之间的亲和作用，将辣根过氧化物酶结合到金电极上去，所述的金电极置于由3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)和H2O2组成的检测底液中，通过辣根过氧化物酶HRP催化使得H2O2氧化TMB产生电化学信号，利用电化学双通道工作站同时采集电信号。
所述的靶标dsDNA为待检测APL的PML/RARα融合基因dsDNA，其型别为长型融合基因。
本发明所述的双通道电化学传感器检测急性早幼粒细胞白血病双链PML/RARα融合基因序列的方法，包括如下步骤：待检测基因序列为急性早幼粒细胞白血病(APL)的PML/RARα融合基因，95％的APL病人为t(15；17)(q22；q21)，在PML和RARα基因发生断裂时，RARα基因断裂点较为固定，发生在第2内含子，在与RARα基因发生融合时，PML基因的断裂点通常集中在三个区域，分别称为bcr1(break cluster region 1)、bcr2和bcr3。Bcr1位于PML的第6内含子，形成长型(即L型)融合基因，约占病人的55％；bcr2位于PML的第6外显子，在与RARα第3外显子融合区内常常插入RARα第2内含子中的3～127bp，形成变异型(即V型)融合基因，约占病人的5％；bcr3位于PML的第3内含子，形成短型(即S型)融合基因，约占病人的40％。为了实现对APL的PML/RARα融合基因的检测，从NCBI基因数据库中查找长型、变异型及短型PML/RARα融合基因dsDNA的融合位点，选择位点前后的碱基作为人工合成的两组检测探针使用，检测探针长度为17～20碱基之间，经过同源比对，同时利用相关生物学软件对两组检测探针与其相应的靶标序列两两间的解链温度进行模拟，以确保探针的特异性，将对应序列作为APL的特异性序列进行合成，采用限制性内切酶循环剪切方法和利用电化学酶链放大检测方法应用双通道电化学工作站检测APL的PML/RARα融合基因dsDNA，通过对采集信号的计算处理实现对PML/RARα融合基因dsDNA的定性定量检测。
所述的待检测APL的PML/RARα融合基因型别为L型融合基因，分别设计了两组“Y”结点检测探针，分别是一组捕获探针和辅助探针以及另一组捕获探针和辅助探针，其中一组的捕获探针的基因采用3’修饰生物素，5’端巯基标记：5’-SH-TTTT TTT TTT GGGTCT CAA TGG TGT ACA G-biotin-3’；一组的辅助探针的基因采用：5’-CTG TAC ACTGCC TCC CC-3’；另一组的捕获探针的基因采用3’修饰生物素，5’端巯基标记：5’-SH-TTTT TTT TTT GGG AGG CAG AAG TAC TA-biotin-3’；另一组的辅助探针的基因采用：5’-TAG TAC TTC CAT TGA GAC CC-3’。
杂交反应前，先将过量的两辅助探针的基因加入到含有待测dsDNA的杂交溶液中，并将其进行热变性后取出放入冰浴中，同时加入一定量的限制性内切酶Rsa I，在检测探针(即C1/A1)和(C2/A2)识别双链片段中与其相对应的靶标ssDNA杂交后所形成的“Y”结点构型，杂交溶液的限制性内切酶能对“Y”结点构型所具有的特异序列进行剪切，使得捕获探针修饰的生物素游离了出来，同时也破坏了“Y”结点构型的稳定性，从而将相应的靶标ssDNA被释放到溶液中，开始新一轮的杂交过程，随着“杂交-剪切-释放”过程不断循环，经过一定时间后，电极表面上存在的生物素越来越少，进而使得能够固定到电极表面的亲和素修饰的辣根过氧化物酶(avidin-HRP)数量急剧减少，因此，双通道电化学DNA阵列传感器检测到的电流信号也随之降低，若溶液中不存在靶标dsDNA，则无法形成稳定的“Y”结点构型，由于捕获探针的基因与辅助探针的基因之间的互补序列解链温度较低，因此无法进行杂交，Rsa I寻找不到酶切位点就无法将生物素从电极表面剪切下来，于是avidin-HRP能够固定到电极面上产生较大的电流信号。
本发明所述的检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因dsDNA的方法，其特征在于1)采用自组装膜法固定捕获探针，根据带巯基(-SH)的捕获探针在金电极表面可以形成自组装单分子膜的特性，将两捕获探针的基因和分别固定在不同通道上两个型号相同的金电极表面，对两个金电极表面未结合的位点通过封闭剂进行封闭，如巯基己醇，巯基乙酸，牛血清白蛋白，酪蛋白等；2)将辅助探针基因提前混于含有靶标dsDNA的杂交液中，通过高温95℃变性使双链DNA解链成单链，并将变性后的杂交液置于冰浴中保持杂交溶液中DNA单链状态，同时加入一定量的限制性内切酶Rsa I；3)接着将修饰了两捕获探针的基因的两个工作电极放入含有限制性内切酶Rsa I和辅助探针的基因的靶标dsDNA待测溶液中进行杂交反应；4)辅助探针的基因分别与靶标dsDNA中相应的S1a和S1b形成两个稳定杂交体，有效阻止了靶标DNA的自身复性，同时这两个杂交体中各自一侧辅助探针与靶标DNA其余序列又可与固定在电极上的相应的捕获探针杂交，在两个工作电极表面分别形成特殊的“Y”结点构型，此时限制性内切酶Rsa I能够识别捕获探针的基因与辅助探针的基因所形成的双链结构中特定的酶切位点，对其进行剪切，使得捕获探针修饰的生物素游离了出来，同时也破坏了“Y”结点构型的稳定性，S1a和S1b被释放到溶液中，开始新一轮的杂交过程，随着“杂交-剪切-释放”过程不断循环，经过一定时间后，电极表面上存在的生物素越来越少；5)通过辣根过氧化物酶(HRP)上的亲和素(avidin)，根据亲和素与生物素之间的亲和作用，将酶结合上去，利用酶的信号放大作用，将两个修饰电极同时置于相同的底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)中，利用电化学双通道工作站同时采集电信号。
在检测探针DNA加入后、检测探针DNA与靶标dsDNA杂交后需采用洗涤剂洗涤除去非特异性吸附，如PBS、0.2％SDS等。
将酶固定在修饰有生物素的工作电极表面之前，需采用封闭剂防止电极表面的非特异性吸附，如0.1wt％BSA。
将酶固定在修饰有生物素的工作电极表面后，需采用洗脱液除去电极表面的非特异性吸附，如0.1wt％Tween-PBS、PBS等。
采用检测探针以及限制性内切酶循环剪切作用的特异性及灵敏度进行测试，实现对急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因dsDNA的定量检测。
具体地说，本发明所述的一种基于内切酶和双“Y”结点探针的双通道电化学传感器检测急性早幼粒细胞白血病双链PML/RARα融合基因序列的方法，待检测PML/RARα融合基因为L型、V型或S型，包括如下步骤：
(1)从NCBI基因数据库中查找L型、V型及S型PML/RARα融合基因双链DNA片段的融合位点，选择位点前后的碱基作为人工合成的两组检测探针使用，检测探针长度为17～20碱基，经过同源比对，同时利用相关生物学软件对两组检测探针与其相应的靶标序列两两间的解链温度进行模拟，以确保探针的特异性，将对应序列作为APL的特异性序列进行合成。其中，探针设计过程中为了能较好地保持探针的特异性，将限制性内切酶酶切位点设计在捕获探针与辅助探针的互补结构中。
(2)采用自组装膜法固定捕获探针，根据带巯基(-SH)的不同捕获探针分别在不同金电极表面可以形成自组装单分子膜的特性来固定，对金电极表面未结合的位点通过封闭剂进行封闭，如巯基己醇，巯基乙酸，牛血清白蛋白，酪蛋白等；
(3)将过量的辅助探针加入到含有待测靶标dsDNA的杂交溶液中进行热变性，然后置于冰浴中待测，同时在杂交溶液中加入限制性内切酶(Rsa I)，靶标dsDNA中两条靶标ssDNA链的一端能够分别与其相应的辅助探针杂交形成两个稳定杂交体，有效阻止了靶标DNA的自身复性，同时这两个杂交体中各自一侧辅助探针与靶标DNA其余序列又可与固定在电极上的相应的捕获探针杂交，在两个工作电极表面分别形成特殊的“Y”结点构型，限制性内切酶识别特异性位点进行剪切，释放出靶标ssDNA，进行“杂交-剪切-释放”循环；
(4)通过辣根过氧化物酶(HRP)上的亲和素(avidin)，根据亲和素与生物素之间的亲和作用，将酶结合上去，利用酶的信号放大作用，在底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)中进行检测。
(5)利用双通道电化学工作站通过安培电流时间曲线法能够实现对靶标dsDNA链中两条互补序列的同时检测，将检测所得信号结果进行计算叠加，可以得到靶标dsDNA的检测最终电流信号，比较杂交前后电信号的差异，可说明溶液中是否存在靶标dsDNA。
与现有技术相比，上述技术方案采用“Y”结点双探针技术、限制性内切酶特异性循环剪切作用与电化学酶联放大技术构建了基于内切酶特异性剪切作用和双“Y”结点探针同时检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因双链DNA的双通道电化学传感检测方法，其中设计的“Y”结点探针因其特殊的结构能够增强探针的特异性，而双探针检测模式能够有效地避免DNA双链片段自身复性对探针识别靶标序列的干扰，提高传感器的检测性能，此外限制性内切酶的循环剪切作用和辣根过氧化物酶的催化作用均具有信号放大的功能，增强检测的灵敏度，是传统单通道传感器的10倍以上，且所构成的双通道电化学DNA传感器有效地减少非特异性吸附，从而提高杂交检测的特异性。由于该技术的检测周期相对较短，为临床上快速诊断提供可能。
附图说明
图1为本发明的基于“Y”结点探针技术的双通道电化学DNA传感器检测PML/RARα融合基因dsDNA的工作原理图。
图2为本发明的检测PML/RARα融合基因dsDNA的实验可行性组合分析图。
图3为本发明的“Y”结点双探针检测PML/RARα融合基因dsDNA的不同靶标序列直方图。
图4为本发明的“Y”结点双探针检测PML/RARα融合基因dsDNA的电信号检测图、直方图和标准曲线的组合图。
图2中：在0.1M KOH的10mM K3Fe(CN)6溶液中不同修饰电极的循环伏安图(A)和在10mM Fe(CN)6 3-/4-溶液中的交流阻抗图谱(B)，其中未做修饰的工作电极裸AuE(a)、完成捕获探针组装的C1/MCH/AuE(b)、在含有1nM靶标dsDNA的情况下经过90min酶切后的C1/MCH/AuE(c)和在无靶标dsDNA存在的情况下经过90min酶切后的C1/MCH/AuE(d)。
图3中：“Y”结点双探针分别与完全互补靶标dsDNA(a)，单碱基对错配dsDNA(b)，三对碱基错配dsDNA(c)，五对碱基错配dsDNA(d)，正常人PML部分dsDNA序列(e)和正常人RARα部分dsDNA序列(f)杂交后检测结果电流差值总和比较直方图。
图4中：基于“Y”结点探针技术的双通道电化学DNA传感器两个通道分别采集C1/A1/S1a(通道1：(A))和C2/A2/S1b(通道1：(B))的时间电流曲线：浓度范围从(a)到(g)分别为0mol/L，1×10-13mol/L，1×10-12mol/L，1×10-11mol/L，1×10-10mol/L，1×10-9mol/L和1×10-8mol/L；(C)比较双通道电化学DNA传感器上同时组装两组“Y”结点探针(C1/A1/S1a+C2/A2/S1b：黑色部分)与组装单组“Y”结点探针(C1/A1/S1a：白色部分，C2/A2/S1b：阴影部分)分别与不同浓度靶标dsDNA进行杂交后所得的电流差值总和(∑△I)直方图；(D)双通道电流差值总和(∑△I)与不同浓度靶标dsDNA的线性关系图(浓度范围1×10-13mol/L～2.0×10-12mol/L)。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1所示，本发明所述的基于“Y”结点探针的双通道电化学传感器，包含有两组检测探针，其特征在于1)所述两组检测探针采用两组“Y”结点检测探针，其中一组是捕获探针1和辅助探针1，另一组是捕获探针2和辅助探针2，所述捕获探针1基因采用(C1，3’修饰生物素，5’端巯基标记)：5’-SH-TTTT TTT TTT GGG TCT CAA TGG TGTACA G-biotin-3’；辅助探针1-1基因采用(A1)：5’-CTG TAC ACT GCC TCC CC-3’；捕获探针2基因采用(C2，3’修饰生物素，5’端巯基标记)：5’-SH-TTTT TTT TTT GGG AGGCAG AAG TAC TA-biotin-3’；辅助探针2-1基因采用(A2)：5’-TAG TAC TTC CAT TGAGAC CC-3’；将两个捕获探针C1和C2通过其修饰有的巯基分别自组装固定在不同通道上的两个型号相同的金电极表面，对两个金电极表面未结合的位点通过封闭剂进行封闭；2)将上述两个辅助探针基因A1和A2提前混于含有靶标dsDNA的杂交溶液中，通过高温变性使靶标双链DNA解链成单链，并将变性后的杂交溶液置于冰浴中保持杂交溶液中DNA单链状态，同时加入一定量的限制性内切酶Rsa I；3)将分别修饰了两个捕获探针C1和C2的两个金电极工作电极放入上述的含有限制性内切酶Rsa I和两个辅助探针基因A1、A2的靶标dsDNA待测杂交溶液中进行杂交反应；上述的两个辅助探针基因A1和A2分别与靶标dsDNA中相应的DNA片段S1a和DNA片段S1b形成两个稳定杂交体，有效阻止了靶标DNA的自身复性，同时这两个稳定杂交体(A1/S1a和A2/S1b)中各自杂交有的辅助探针基因A1和A2与靶标DNA其余未杂交的序列又可与固定在金电极表面上的相应的捕获探针杂交，在每个工作电极表面分别形成特殊的“Y”结点构型(金电极表面上的捕获探针作为“Y的下部支撑杆”，两个稳定杂交体(A1/S1a和A2/S1b)分别与不同捕获探针相应的互补部分进行杂交后，其中含有的辅助探针基因A1和A2的杂交体部分作为“Y的两分叉”)，此时限制性内切酶Rsa I能够识别捕获探针基因与辅助探针基因(C1/A1和C2/A2)所形成的双链结构中特定的酶切位点，对其进行剪切，使得捕获探针修饰的生物素游离了出来，同时也破坏了“Y”结点构型的稳定性，DNA片段S1a和DNA片段S1b被释放到杂交溶液中，开始新一轮的杂交过程，随着“杂交-剪切-释放”过程不断循环，经过一定时间后，金电极表面上存在的生物素越来越少；4)在杂交溶液中加入亲和素修饰的辣根过氧化物酶，通过辣根过氧化物酶(HRP)上的亲和素(avidin)，根据亲和素与生物素之间的亲和作用，将辣根过氧化物酶结合到金电极上去，所述的金电极置于由3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)和H2O2组成的检测底液中，通过辣根过氧化物酶HRP催化使得H2O2氧化TMB产生电化学信号，利用电化学双通道工作站同时采集电信号。
实施例1：
APL探针的设计步骤如下：
(1)PML/RARα融合基因在17号染色体上的断裂点固定于RARα基因的第二号内含子内，而在15号染色体上存在三个断裂点丛集区(breakpoint cluster region,BCR)，称为bcr1、bcr2和bcr3，分别位于PML基因的第六号内含子、第六号外显子和第三号内含子。由于PML基因断裂点的部位不同形成三种不同的融合转录本：第一种类型，大约70％的患者是bcr1或长型转录本，由PML基因的第六号外显子(P6)与RARα基因的第三号外显子(R3)形成融合基因。第二种类型，约20％的患者为bcr3或短型本，由PML基因的第三号外显子(P3)与RARα基因的第三号外显子(R3)形成融合基因。第三种类型，10％左右的患者为bcr2或变异转录本，由断裂的PML基因的第六号外显子(P6)与RARα基因的第三号外显子(R3)形成融合基因，并且插入一些来源不明的短片段。从NCBI基因数据库中查找L型、V型及S型PML/RARα融合基因dsDNA的融合位点，选择位点前后的碱基作为人工合成的两组检测探针使用，检测探针长度为17～20碱基，经过同源比对，同时利用相关生物学软件对两组检测探针与其相应的靶标序列两两间的解链温度进行模拟，以确保探针的特异性，将对应序列作为APL的特异性序列进行合成。本方法采用限制性内切酶循环剪切方法，以达到放大检测电流信号的目的，同时还利用电化学酶链放大检测方法应用双通道电化学工作站检测APL的PML/RARα融合基因dsDNA，通过对采集信号的计算处理实现对PML/RARα融合基因dsDNA的定性定量检测。以L型融合基因为例，其采用的两组检测探针中，分别是捕获探针1和辅助探针1以及捕获探针2和辅助探针2-1。其中捕获探针1基因采用(C1，3’修饰生物素，5’端巯基标记)：5’-SH-TTTT TTTTTT GGG TCT CAA TGG TGT ACA G-biotin-3’；辅助探针1-1基因采用(A1)：5’-CTG TACACT GCC TCC CC-3’；捕获探针2基因采用(C2，3’修饰生物素，5’端巯基标记)：5’-SH-TTTT TTT TTT GGG AGG CAG AAG TAC TA-biotin-3’；辅助探针2-1基因采用(A2)：5’-TAG TAC TTC CAT TGA GAC CC-3’。
实施例2：
基于“Y”结点探针的双通道DNA传感器的制备表征步骤如下：
(1)金电极用Piranha溶液(30％的H2O2和H2SO4，以1:3的体积比混合)超声10min后，分别用去离子水超声清洗2次，每次10min，然后置于KOH溶液中进行电化学清洗，接着依次用1μm、0.3μm、0.05μm粒径的Al2O3混悬液抛光至镜面，再先后用无水乙醇、去离子水超声清洗。接着将超声好的电极置于0.5M H2SO4溶液中循环扫描至稳定，用去离子水清洗，N2吹干备用。
(2)将步骤(1)处理好的裸金电极分别置于含有0.1mol/L KOH的10m mol/LK3Fe(CN)6溶液中(电位范围为-0.2V～+0.6V的条件下进行循环伏安扫描，扫描速度100mV/s)，测定结果见图2(A)的曲线a和含有0.01mol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1:1)的0.1mol/L KCl溶液中电极表面电子传递电阻(Ret)的变化，测定结果见图2(B)的曲线a。
图2结果显示，未做修饰的工作电极裸AuE的CV曲线上具有一对明显的氧化还原峰，交流阻抗值很小，仅为104.6Ω。说明在裸金电极上电子能够快速传递。
实施例3：
基于“Y”结点探针的双通道DNA传感器的制备表征步骤如下：
(1)将实施例2步骤1处理好的裸金电极浸没在含有巯基修饰捕获探针溶液(C1或者C2)中，在室温下反应2h后，用pH 7.50的Tris-HCl缓冲液清洗10s，氮气吹干,接着在1m mol/L MCH水溶液中封闭1h，即可得到修饰有捕获探针和巯基己醇的金电极，然后用pH 7.50的Tris-HCl缓冲液清洗10s，氮气吹干，备用。
(2)将步骤(1)处理好的电极分别置于含有0.1mol/L KOH的10m mol/L K3Fe(CN)6溶液中(电位范围为-0.2V～+0.6V的条件下进行循环伏安扫描，扫描速度100mV/s)，测定结果见图2(A)的曲线b和含有0.01mol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1:1)的0.1mol/L KCl溶液中电极表面电子传递电阻(Ret)的变化，测定结果见图2(B)曲线b。
图2结果显示，电极表面完成了捕获探针的组装之后，这对氧化还原峰的可逆性变差，△E增大，且由[Fe(CN)6]3-所产生的氧化还原峰电流信号明显下降，交流阻抗变大。
实施例4：
基于“Y”结点探针的双通道DNA传感器的制备表征步骤如下：
(1)将过量的辅助探针基因(A1或A2)加入到含有待测dsDNA的杂交溶液中，并将其置于95℃下变性10min后取出放入冰浴中，同时加入一定浓度的限制性内切酶Rsa I。然后，将实施例3步骤(1)处理的电极放入到杂交溶液中，接着在37℃下杂交90min后，取出并用pH 7.50的Tris-HCl缓冲液清洗10s，氮气吹干，用0.1％BSA进行封闭30min后，在电极表面滴加3μL streptavidin-HRP酶储备液，37℃下反应15min，依次置于含有0.05％吐温的10mM Tris-HCl洗液和10mmol/L Tris-HCl洗液，室温放置各5min后，立即进行电化学检测。
(2)将步骤1处理好的电极分别置于含有0.1mol/L KOH的10m mol/L K3Fe(CN)6溶液中(电位范围为-0.2V～+0.6V的条件下进行循环伏安扫描，扫描速度100mV/s)，测定结果见图2(A)的曲线c和含有0.01mol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1:1)的0.1mol/L KCl溶液中电极表面电子传递电阻(Ret)的变化，测定结果见图2(B)曲线c。
图2结果显示，当溶液存在靶标dsDNA时，捕获探针、辅助探针与靶标互补链两两之间相互杂交，在电极表面形成了稳定的“Y”结点构型存在于杂交液中的内切酶识别到剪切位点，将捕获探针上修饰的biotin从电极表面切除，经过不断循环，存在于电极表面的biotin数量急剧减少，所以能够连接到电极表面的HRP的数量有限，而身为蛋白大分子的HRP可进一步阻碍电极表面的电子传递，所以氧化还原峰电流进一步下降，氧化还原峰之间的可逆性变得更差，交流阻抗进一步增大。
实施例5：
基于“Y”结点探针的双通道DNA传感器的制备表征步骤如下：
(1)将过量的辅助探针基因(A1或A2)加入到没有待测dsDNA的杂交溶液中，并将其置于95℃下变性10min后取出放入冰浴中，同时加入一定浓度的限制性内切酶Rsa I。然后，将实施例3步骤1处理的电极放入到杂交溶液中，接着在37℃下杂交90min后，取出并用pH 7.50的Tris-HCl缓冲液清洗10s，氮气吹干，用0.1％BSA进行封闭30min后，在电极表面滴加3μL streptavidin-HRP酶储备液，37℃下反应15min，依次置于含有0.05％吐温的10mmol/L Tris-HCl洗液和10mmol/L Tris-HCl洗液，室温放置各5min后，立即进行电化学检测。
(2)将步骤1处理好的电极分别置于含有0.1mol/L KOH的10mmol/L K3Fe(CN)6溶液中(电位范围为-0.2V～+0.6V的条件下进行循环伏安扫描，扫描速度100mV/s)，测定结果见图2(A)的曲线d和含有0.01mol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1:1)的0.1M KCl溶液中电极表面电子传递电阻(Ret)的变化，测定结果见图2(B)曲线d。
图2结果显示，溶液中不存在靶标dsDNA，则捕获探针、辅助探针与靶标互补链之间的杂交无法进行，电极面上无法形成“Y”结点构型，内切酶无法将biotin从电极表面切除，此时连接到C1/MCH/AuE表面的HRP的数量远远多于在含有1nmol/L靶标dsDNA的情况下经过90min酶切后的C1/MCH/AuE电极表面的HRP数量。所以氧化还原峰电流降至最低，交流阻抗值增加到最大。
以上实施例2、3、4、5表明：捕获探针已经成功组装到工作电极表面，并且在辅助探针的协助下能很好地区分待测溶液中是否含有靶标dsDNA。
实施例6：
基于“Y”结点探针的双通道DNA传感器对目标DNA的检测步骤如下：
(1)将过量的辅助探针加入到含有完全互补DNA序列的杂交溶液中，并将其置于95℃下变性10min后取出放入冰浴中，同时加入一定浓度的限制性内切酶Rsa I。然后，将实施例3获得的固定在表面的探针DNA探针放入到杂交溶液中，接着在37℃下杂交90min后，取出并用pH 7.50的Tris-HCl缓冲液清洗10s，氮气吹干，用0.1％BSA进行封闭30min后，在电极表面滴加3μL streptavidin-HRP酶储备液，37℃下反应15min，依次置于含有0.05％吐温的10mmol/L Tris-HCl洗液和10mmol/L Tris-HCl洗液，室温放置各5min后，立即进行电化学检测。
(2)将步骤(1)制得的电极浸入到500μL的TMB底物溶液(37℃)中，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl(KCl 3mol/L)为参比电极，记录电流-时间曲线，读出电流值，初始电位为100mV，实验时间100s。测定结果见图3的曲线a。
图3结果显示，当固定有捕获探针与完全互补的目标DNA杂交反应后，电流信号最强(曲线a)，说明捕获探针能够很好的与其完全互补的碱基序列进行杂交，出现强的电流信号。
实施例7：
基于“Y”结点探针的双通道DNA传感器对目标DNA的检测步骤如下：
(1)将过量的辅助探针加入到含有单碱基错配DNA序列的杂交溶液中，并将其置于95℃下变性10min后取出放入冰浴中，同时加入一定浓度的限制性内切酶Rsa I。然后，将实施例3获得的固定在表面的探针DNA探针放入到杂交溶液中，接着在37℃下杂交90min后，取出并用pH 7.50的Tris-HCl缓冲液清洗10s，氮气吹干，用0.1％BSA进行封闭30min后，在电极表面滴加3μL streptavidin-HRP酶储备液，37℃下反应15min，依次置于含有0.05％吐温的10mmol/L Tris-HCl洗液和10mmol/L Tris-HCl洗液，室温放置各5min后，立即进行电化学检测。
(2)将步骤(1)制得的电极浸入到500μL的TMB底物溶液(37℃)中，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl(KCl 3M)为参比电极，记录电流-时间曲线，读出电流值，初始电位为100mV，实验时间100s。测定结果见图3的曲线b。
图3结果显示，单碱基错配的DNA序列电流信号(曲线b)相对于完全互补序列的信号(曲线a)有明显减弱，这说明捕获探针不能与存在一个碱基错配的序列进行完全杂交，故电流信号较低。
实施例8：
基于“Y”结点探针的双通道DNA传感器对目标DNA的检测步骤如下：
(1)将过量的辅助探针分别加入到①含有三碱基错配DNA序列的杂交溶液中，②含有五碱基错配DNA序列杂交溶液中，③含有正常人PML部分的DNA序列杂交液中，④含有正常人RARα部分的DNA序列杂交液中。并将其置于95℃下变性10min后取出放入冰浴中，同时加入一定浓度的限制性内切酶Rsa I。然后，将实施例3获得的固定在表面的探针DNA探针放入到杂交溶液中，接着在37℃下杂交90min后，取出并用pH 7.50的Tris-HCl缓冲液清洗10s，氮气吹干，用0.1％BSA进行封闭30min后，在电极表面滴加3μLstreptavidin-HRP酶储备液，37℃下反应15min，依次置于含有0.05％吐温的10mMTris-HCl洗液和10mmol/L Tris-HCl洗液，室温放置各5min后，立即进行电化学检测。
(2)将步骤(1)制得的电极浸入到500μL的TMB底物溶液(37℃)中，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl(KCl 3mol/L)为参比电极，记录电流-时间曲线，读出电流值，初始电位为100mV，实验时间100s。测定结果见图3的曲线c、d、e、f。
图3结果显示，当检测对象为三碱基错配dsDNA(c)、五碱基错配dsDNA(d)、正常人PML部分dsDNA序列(e)和正常人RARα部分dsDNA序列(f)时，其最终计算出∑△I值远低于互补靶标dsDNA(a)所检测信号，其检测信号接近空白背景电流值，说明捕获探针不能与三碱基错配、五碱基错配、正常人PML部分和正常人RARα部分碱基序列发生杂交，故电流信号很低。
以上实施例6、7、8表明：该方法构建的DNA电化学传感器，Y”结点探针具有更高的杂交选择专一性，且基于内切酶特异性剪切作用和“Y”结点探针技术的双通道电化学DNA阵列传感器具有很好的DNA序列特异性和选择性，能实现对靶标dsDNA中单碱基对突变的识别和检测。
实施例9：
基于“Y”结点探针的双通道DNA传感器的制备以及对PML/RARα融合基因的检测步骤如下：
(1)将金电极用Piranha溶液(30％的H2O2和H2SO4，以1:3的体积比混合)超声10min后，分别用去离子水超声清洗2次，每次10min，然后置于KOH溶液中进行电化学清洗，接着依次用1μm、0.3μm、0.05μm粒径的Al2O3混悬液抛光至镜面，再先后用无水乙醇、去离子水超声清洗。接着将超声好的电极置于0.5M H2SO4溶液中循环扫描至稳定，用去离子水清洗，N2吹干备用。
(2)将处理好的裸金电极分别浸没在含有不同序列的巯基修饰捕获探针溶液(C1或者C2)中，在室温下反应2h后，用pH 7.50的Tris-HCl缓冲液清洗10s，氮气吹干。
(3)将步骤(2)中处理好的电极置于1mmol/L MCH水溶液中封闭1h，即可得到修饰有捕获探针和巯基己醇的金电极，然后用pH 7.50的Tris-HCl缓冲液清洗10s，氮气吹干。
(4)将过量的辅助探针基因(A1、A2)加入到含有待测dsDNA的杂交溶液中，并将其置于95℃下变性10min后取出放入冰浴中，同时加入一定浓度的限制性内切酶Rsa I。然后，将步骤(3)处理好的电极(分别组装有C1和C2的金电极)一同放入到杂交溶液中，接着在37℃下杂交90min后，取出并用pH 7.50的Tris-HCl缓冲液清洗10s，氮气吹干。
(5)将步骤(4)处理好的电极用0.1％BSA进行封闭30min后，在电极表面滴加3μLstreptavidin-HRP酶储备液，37℃下反应15min，依次置于含有0.05％吐温的10mmol/LTris-HCl洗液和10mmol/L Tris-HCl洗液，室温各放置5min。
(6)将步骤(5)浸入到500μL的TMB底物溶液(37℃)中，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl(KCl 3M)为参比电极，记录电流-时间曲线，读出电流值，初始电位为100mV，实验时间100s。
(7)利用双通道电化学工作站通过安培电流时间曲线法能够实现对靶标dsDNA链中两条互补序列的同时检测，将检测所得信号结果进行计算叠加，可以得到靶标dsDNA的检测最终电流信号，比较杂交前后电信号的差异，可说明溶液中是否存在靶标dsDNA。电流与目标DNA浓度关系见图4。
从图4的结果可以看出，在一定浓度范围内，随着靶标dsDNA浓度增加，电极表面杂交形成的“Y”结点构型DNA的数量不断增加，经过N个“杂交-剪切-释放”循环后，其最终检测出来的IdsDNA信号随之减小。通过对电流信号的计算整理后，从图4(C)可以看出，与单组探针(C1/A1或者C2/A2)组成的双通道电化学DNA阵列传感器相比，当靶标dsDNA溶度低至1.0×10-13mol/L时，两组探针(C1/A1+C2/A2)组成的双通道电化学DNA阵列传感器仍能将其测定出来，且在1.0×10-13～2.0×10-12mol/L范围呈较好的线性关系(图4(D))，其相关的回归方程为∑△I(nA)＝1019.1737+1172.9564CdsDNA(pmol/L)，r＝0.9939，检测限可达4.7×10-14mol/L。而单组探针(C1/A1或者C2/A2)的检测范围仅为1.0×10-10～1.0×10-8mol/L。该实验结果表明该传感器通过组装两组“Y”结点探针，能够较为有效的阻止靶标dsDNA的自身复性，提高探针与靶标dsDNA的杂交效率，且利用限制性内切酶酶切放大信号的策略，可以实现对APL中人工合成的PML/RARαdsDNA片段的定量检测，且具有较高的灵敏度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 福建医科大学
<120> 基于“Y”结点探针的双通道传感器检测急早粒PML/RARα基因序列的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 一组捕获探针
<400> 1
5’-SH-tttttttttt gggtctcaat ggtgtacag- biotin - 3’ 29
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 一组辅助探针
<400> 2
5’-ctgtacactg cctcccc- 3’ 17
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 另一组捕获探针
<400> 3
5’-SH-tttttttttt gggaggcaga agtacta- biotin - 3’ 27
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 另一组辅助探针
<400> 4
5’-tagtacttcc attgagaccc- 3’ 20
Claims (10)
1.一种基于“Y”结点探针的双通道电化学传感器，包含有两组检测探针，其特征在于1）所述两组检测探针采用两组“Y”结点检测探针，其中一组是捕获探针（1）和辅助探针（1-1），另一组是捕获探针（2）和辅助探针（2-1），所述一组捕获探针（1）的 基因（C1）采用3’ 修饰生物素， 5’ 端巯基标记：5’-SH- TTTT TTT TTT GGG TCT CAA TGG TGT ACA G- biotin - 3’； 一组辅助探针（1-1）的基因（A1）采用：5’-CTG TAC ACT GCC TCC CC- 3’； 另一组捕获探针（2）的基因（C2）采用，3’ 修饰生物素，5’ 端巯基标记：5’-SH- TTTT TTT TTT GGG AGG CAG AAG TAC TA- biotin - 3’； 另一组辅助探针（2-1）的基因（A2）采用：5’- TAG TAC TTC CAT TGA GAC CC- 3’；将两个捕获探针的基因（C1）和（C2）通过其修饰有的巯基分别自组装固定在不同通道上的两个型号相同的金电极表面，对两个金电极表面未结合的位点通过封闭剂进行封闭；2）将上述两个辅助探针的基因（A1 ）和（A2） 提前混于含有靶标 dsDNA 的杂交溶液中，通过高温变性使靶标双链 DNA 解链成单链，并将变性后的杂交溶液置于冰浴中保持杂交溶液中 DNA 单链状态，同时加入一定量的限制性内切酶Rsa I；3）将分别修饰了两个捕获探针的基因（C1）和（C2）的两个金电极工作电极放入上述的含有限制性内切酶Rsa I和两个辅助探针的基因（A1 ）和（A2）的靶标 dsDNA待测杂交溶液中进行杂交反应；上述的两个辅助探针的基因（A1）和（A2）分别与靶标dsDNA 中相应的 DNA片段S1a 和DNA片段 S1b 形成两个稳定杂交体，有效阻止了靶标 DNA 的自身复性，同时这两个稳定杂交体（A1/S1a）和（A2/S1b）中各自杂交有的辅助探针的基因（A1）和（A2）与靶标 DNA 其余未杂交的序列又可与固定在金电极表面上的相应的捕获探针杂交，在每个工作电极表面分别形成特殊的“Y”结点构型，在“Y”结点构型中金电极表面上的捕获探针作为“Y的下部支撑杆”，两个稳定杂交体（A1/S1a）和（A2/S1b）分别与不同捕获探针相应的互补部分进行杂交后，其中含有的辅助探针的基因（A1）和（A2）的杂交体部分作为“Y的两分叉”），此时限制性内切酶 Rsa I 能够识别捕获探针的基因与辅助探针的基因（C1/A1）和（C2/A2）所形成的双链结构中特定的酶切位点，对其进行剪切，使得捕获探针修饰的生物素游离了出来，同时也破坏了“Y”结点构型的稳定性，DNA片段S1a 和 DNA片段S1b 被释放到杂交溶液中，开始新一轮的杂交过程，随着“杂交-剪切-释放”过程不断循环，经过一定时间后，金电极表面上存在的生物素越来越少； 4）在杂交溶液中加入亲和素修饰的辣根过氧化物酶，通过辣根过氧化物酶 (HRP) 上的亲和素(avidin)，根据亲和素与生物素之间的亲和作用，将辣根过氧化物酶结合到金电极上去，所述的金电极置于由 3，3’，5，5’- 四甲基联苯胺（TMB）和 H2O2 组成的检测底液中，通过辣根过氧化物酶 HRP 催化使得 H2O2 氧化 TMB 产生电化学信号，利用电化学双通道工作站同时采集电信号。
2.如权利要求 1 所述的基于“Y”结点探针的双通道电化学传感器，其特征在于所述的靶标 dsDNA为待检测APL 的 PML/RARα融合基因dsDNA，其型别为长型融合基因。
3.一种权利要求1-2任一所述的双通道电化学传感器检测急性早幼粒细胞白血病双链PML/RARα融合基因序列的方法，包括如下步骤：待检测基因序列为急性早幼粒细胞白血病（APL）的 PML/RARα融合基因，95% 的 APL 病人为 t(15;17)(q22;q21)，在 PML 和 RARα基因发生断裂时，RARα基因断裂点较为固定，发生在第 2 内含子，在与 RAR基因发生融合时，PML 基因的断裂点通常集中在三个区域，分别称为bcr1(break cluster region 1)、bcr2和bcr3;Bcr1 位于 PML 的第 6 内含子，形成长型（L型）融合基因，约占病人的55%；bcr2 位于 PML 的第 6 外显子，在与RARα第3外显子融合区内常常插入RARα第 2 内含子中的3 ~127 bp，形成变异型（V型）融合基因，约占病人的5%；bcr3位于PML的第3内含子，形成短型（S型）融合基因，约占病人的40%;为了实现对 APL 的 PML/RARα融合基因的检测，从NCBI基因数据库中查找长型、变异型及短型 PML/RARα融合基因 dsDNA 的融合位点，选择位点前后的碱基作为人工合成的两组检测探针使用，检测探针长度为17 ~ 20碱基之间，经过同源比对，同时利用相关生物学软件对两组检测探针与其相应的靶标序列两两间的解链温度进行模拟，以确保探针的特异性，将对应序列作为 APL 的特异性序列进行合成，采用限制性内切酶循环剪切方法和利用电化学酶链放大检测方法应用双通道电化学工作站检测APL 的PML/RARα融合基因 dsDNA，通过对采集信号的计算处理实现对 PML/RARα融合基因 dsDNA 的定性定量检测。
4.如权利要求 3 所述的检测急性早幼粒细胞白血病 PML/RARα融合基因 dsDNA的方法，其特征在于所述的待检测 APL 的 PML/RARα融合基因型别为 L 型融合基因，分别设计了两组“Y”结点检测探针，分别是捕获探针（1）和辅助探针（1-1）以及捕获探针（2） 和辅助探针（2-1），其中捕获探针（1）的 基因（C1）采用3’ 修饰生物素，5’ 端巯基标记：5’-SH- TTTT TTT TTT GGG TCT CAA TGG TGT ACA G- biotin - 3’；辅助探针（1-1）的基因（A1）采用：5’-CTG TAC ACT GCC TCC CC- 3’；捕获探针（2）的基因（C2）采用3’ 修饰生物素，5’ 端巯基标记）：5’-SH- TTTT TTT TTT GGG AGG CAG AAG TAC TA- biotin - 3’； 辅助探针（2-1）的基因（A2）采用：5’- TAG TAC TTC CAT TGA GAC CC- 3’。
5.根据权利要求 3 或 4 所述的检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因 dsDNA 的方法，其特征在于杂交反应前，先将过量的两辅助探针的基因（A1）、（A2）加入到含有待测 dsDNA 的杂交溶液中，并将其进行热变性后取出放入冰浴中，同时加入一定量的限制性内切酶 Rsa I，在检测探针（即 C1/A1） 和（C2/A2）识别双链片段中与其相对应的靶标 ssDNA 杂交后所形成的“Y”结点构型，杂交溶液的限制性内切酶能对“Y”结点构型所具有的特异序列进行剪切，使得捕获探针修饰的生物素游离了出来，同时也破坏了“Y”结点构型的稳定性，从而将相应的靶标 ssDNA 被释放到溶液中，开始新一轮的杂交过程，随着“杂交-剪切-释放”过程不断循环，经过一定时间后，电极表面上存在的生物素越来越少，进而使得能够固定到电极表面的亲和素修饰的辣根过氧化物酶（avidin-HRP）数量急剧减少，因此，双通道电化学 DNA 阵列传感器检测到的电流信号也随之降低，若溶液中不存在靶标 dsDNA，则无法形成稳定的“Y”结点构型，由于捕获探针的基因与辅助探针的基因（C1/A1 ）和（C2/A2）之间的互补序列解链温度较低，因此无法进行杂交，Rsa I 寻找不到酶切位点就无法将生物素从电极表面剪切下来，于是 avidin-HRP 能够固定到电极面上产生较大的电流信号。
6.权利要求 5 所述的检测急性早幼粒细胞白血病 PML/RARα融合基因 dsDNA 的方法，其特征在于1）采用自组装膜法固定捕获探针，根据带巯基 (-SH) 的捕获探针在金电极表面可以形成自组装单分子膜的特性，将两捕获探针的基因（C1）和（C2）分别固定在不同通道上两个型号相同的金电极表面，对两个金电极表面未结合的位点通过封闭剂进行封闭，如巯基己醇，巯基乙酸，牛血清白蛋白，酪蛋白等；2）将辅助探针基因（A1）和（A2）提前混于含有靶标 dsDNA 的杂交液中，通过高温95℃变性使双链 DNA 解链成单链，并将变性后的杂交液置于冰浴中保持杂交溶液中 DNA 单链状态，同时加入一定量的限制性内切酶Rsa I；3）接着将修饰了两捕获探针的基因（C1）和（C2）的两个工作电极放入含有限制性内切酶Rsa I和辅助探针的基因（A1）、（A2）的靶标 dsDNA待测溶液中进行杂交反应；4）辅助探针的基因（A1）、（A2）分别与靶标 dsDNA 中相应的 S1a 和 S1b 形成两个稳定杂交体，有效阻止了靶标 DNA 的自身复性，同时这两个杂交体（A1/S1a）和（A2/S1b）中各自一侧辅助探针与靶标 DNA其余序列又可与固定在电极上的相应的捕获探针杂交，在两个工作电极表面分别形成特殊的“Y”结点构型，此时限制性内切酶 Rsa I 能够识别捕获探针的基因与辅助探针的基因（C1/A1）和（C2/A2）所形成的双链结构中特定的酶切位点，对其进行剪切，使得捕获探针修饰的生物素游离了出来，同时也破坏了“Y”结点构型的稳定性，S1a 和 S1b 被释放到溶液中，开始新一轮的杂交过程，随着“杂交-剪切-释放”过程不断循环，经过一定时间后，电极表面上存在的生物素越来越少；5）通过辣根过氧化物酶 (HRP) 上的亲和素(avidin)，根据亲和素与生物素之间的亲和作用，将酶结合上去，利用酶的信号放大作用，将两个修饰电极同时置于相同的底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB) 中，利用电化学双通道工作站同时采集电信号。
7.根据权利要求 6 所述的检测急性早幼粒细胞白血病 PML/RARα融合基因 dsDNA 的方法，其特征在于检测探针DNA 加入后、检测探针DNA与靶标 dsDNA 杂交后需采用洗涤剂洗涤除去非特异性吸附，如 PBS、0.2% SDS 等。
8.根据权利要求 6 所述的检测急性早幼粒细胞白血病 PML/RARα融合基因 dsDNA的方法，其特征在于将酶固定在修饰有生物素的工作电极表面之前，需采用封闭剂防止电极表面的非特异性吸附，如 0.1wt% BSA。
9.根据权利要求 6 所述的检测急性早幼粒细胞白血病 PML/RARα融合基因 dsDNA的方法，其特征在于将酶固定在修饰有生物素的工作电极表面后，需采用洗脱液除去电极表面的非特异性吸附，如 0.1wt% Tween-PBS、PBS 等。
10.根据权利要求 6 所述的检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因 dsDNA 的方法，其特征在于采用检测探针以及限制性内切酶循环剪切作用的特异性及灵敏度进行测试，实现对急性早幼粒细胞白血病 PML/RARα融合基因 dsDNA 的定量检测。
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