CN104729905B - 抗凝剂的制备方法、抗凝剂及使用其制备血液涂片的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗凝剂的制备方法、抗凝剂及使用其制备血液涂片的方法。所述制备方法包括：分别量取肝素钠和蒸馏水，然后将肝素钠充分溶于蒸馏水中，得抗凝剂母液；用低容量注射器稀释抗凝剂母液，得备烘抗凝剂稀释液；用低容量注射器向高容量注射器内定量注入备烘抗凝剂稀释液；将装有备烘抗凝剂稀释液的高容量注射器在40‑60℃烘干备用。使用该抗凝剂制备血液涂片的方法，包括：用装有抗凝剂的高容量注射器采血；混匀采血后的高容量注射器；取步骤f得到的血，用载玻片制备血液涂片。使用本申请提供的抗凝剂的制备方法、抗凝剂及使用其制备血液涂片的方法，没有经验的学生也能够获得清晰的血液涂片，真实的再现了血细胞的形态结构和特征。

Description

抗凝剂的制备方法、抗凝剂及使用其制备血液涂片的方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种抗凝剂的制备方法、抗凝剂及使用其制备血液涂片的方法。

背景技术

血液涂片的制作，在临床上应用极为广泛，制备厚薄适宜，分布均匀，染色良好的血液涂片是血液学检查的重要基本技术之一。

在血液涂片的制作中，推片是整个制作技术中的难点和关键。在目前的本科教学实验中，有一个血液涂片的制作和观察实验。目前实验室主要使用的方法是直接采血、直接制作血液涂片，但对于绝大多数的同学们来说，他们都是第一次推片，没有丝毫的经验，往往是把鲜血滴在载波片上，还来不及推片，血已经在载玻片上凝固了，所以就需要使用添加了微量抗凝剂的血液，来进行血液涂片的制作了。

而抗凝剂的准确剂量，在实际操作中，往往是用血液量越少难以把握，实际操作中就曾多次因抗凝剂剂量的精准问题，导致所做出来的血液涂片中，红细胞严重变形，从而导致了整个实验的彻底失败。这是由于，制作血液涂片的用血量本来就很少，加入抗凝剂的量也就要求非常少，在这种情况下，就要求加入的量非常的精准，用量过多会破坏细胞的形态，尤其是红细胞，会严重的变形，呈锯齿状；而用量偏少呢，则达不到抗凝的效果。然而，这么小的精准用量，如果想要达到直接取用、直接加入的目的，需要非常精密的仪器量取，价格昂贵；如果使用常规方法进行溶解、定容，不仅耗时，而且也需要丰富的操作经验。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的，在于提供一种抗凝剂的制备方法，所述的方法具有操作简单、用量精准、抗凝血效果好等优点。

本发明的第二目的在于提供一种所述抗凝剂的制备方法制得的抗凝剂，该抗凝剂具有使用方便、抗凝血效果好等优点。

本发明的第三目的在于提供一种使用所述抗凝剂制备血液涂片的方法，该方法具有操作简单、尤其特别的适用于第一次或者没有丝毫推片经验的学生、实习生群体练习使用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种抗凝剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a.分别量取肝素钠和蒸馏水，然后将肝素钠充分溶于蒸馏水中，得抗凝剂母液；

b.用低容量注射器稀释所述抗凝剂母液，得备烘抗凝剂稀释液；

c.用所述低容量注射器向高容量注射器内定量注入所述备烘抗凝剂稀释液；

d.将装有所述备烘抗凝剂稀释液的所述高容量注射器在40-60℃下烘干备用。

由于制作血液涂片的用血量只有一滴，所用抗凝剂的量也就要求非常少而且必须精准，用量少达不到抗凝血效果，用量多又会使得红细胞严重的变形，呈锯齿状，做出来的血液涂片都是废片。通过先制备母液，再用注射器进行稀释，可以使得抗凝剂的量非常精准，用来制作血液涂片效果非常好，制得的血液涂片非常清晰，成功率也非常高，特别适合初次制作血液涂片，经验少、不熟练的学生或者实习人员使用。适当的烘干温度对于保证抗凝剂的状态稳定非常重要。

需要说明的是，本申请中所述注射器的高容量和低容量均是相对而言的，并不是一个绝对的概念。

优选地，所述低容量注射器为1ml注射器，所述高容量注射器为5ml注射器。

选用1ml和5ml的注射器，能够在其精度范围内进一步控制抗凝剂母液的使用量。

更加优选地，所述步骤b具体为：

用蒸馏水将所述抗凝剂母液稀释，然后用1ml注射器定量吸取稀释后的所述抗凝剂母液，再吸取蒸馏水至1ml，得所述备烘抗凝剂稀释液。

先用蒸馏水稀释，进一步降低液体中的肝素钠的含量，再用1ml注射器进行稀释定容，能够减小量取抗凝剂的误差，进一步保证用量的精准。

优选地，所述步骤c之后、所述步骤d之前还包括：

旋转所述高容量注射器，使所述备烘抗凝剂稀释液均匀附着于所述高容量注射器的管壁之上。

旋转之后溶质肝素钠能够均匀的分布在管壁上，在后续用其取血的时候能够更好的起到抗凝血作用，避免在注射器内，因肝素钠分布不均，造成局部过多、其余部分过少的情况，进而避免产生局部凝固和局部红细胞严重变形的现象。

本申请还提供一种由所述的方法制得的抗凝剂。

这种抗凝剂是针对初次制作血液涂片时，由于操作人员技术不熟练，或者是没有丝毫的推片经验，鲜血滴加在载玻片上，还来不及推片，血液就直接的凝固在了载玻片上的问题；而直接取用抗凝剂不仅剂量不好控制，而且非常麻烦。在制作血液涂片之前进行大量的预先制备该抗凝剂，取血时直接使用，非常的方便。而且这种抗凝剂的量十分精准，即使不熟练或者没有经验的人员也能够制作出好的血液涂片。

本申请还提供一种使用所述的抗凝剂制备血液涂片的方法，所述方法包括以下步骤：

e.用装有所述抗凝剂的所述高容量注射器采血；

f.混匀采血后的所述高容量注射器；

g.取步骤f得到的血，用载玻片制备血液涂片。

使用装有抗凝剂的注射器直接采血，使得血液脱离生物体后直接与抗凝剂接触，避免因人员操作不熟练造成血液凝固而需要再次采血。摇匀能够进一步避免血液与抗凝剂分布不均，从而使得血液内的红细胞保持最原始的形态结构和特征。

采血完毕之后，将血液倒入容器(如青霉素小瓶)中，放入冰箱保存备用。存放时间一般不超过5个小时，5个小时后需要重新采血。马上取血推片为最佳。

优选地，所述步骤f具体为：

采血完毕后，拔掉所述高容量注射器的针头和活塞，用手指按住注射器的两端上下轻轻晃动，直到血的温度与常温相一致，然后将所述的血轻轻倒入容器中备用。

必须轻轻的晃动，避免发生溶血而使红细胞破裂，造成采血失败。强调血液温度与常温一致后再倒入容器中，也是为了避免温度变化对红细胞产生不利影响。

优选地，所述采血量为2ml，用来采血的所述高容量注射器内装有的所述抗凝剂含有肝素钠0.02-0.1mg。

经试验验证，使用上述方法，采血量为2ml、用来采血的所述高容量注射器内装有的所述抗凝剂含有肝素钠0.02-0.1mg时，制作出的血液涂片的效果最好，其血细胞的形态结构特征完全达到了直接采血涂片一样的效果。

可选地，所述步骤g具体为：

用火柴圆头取1滴步骤f所得的血，滴于备用载玻片一端4-5mm处，另取一块边缘光滑的载玻片，做推片并将其一端置于血滴前方，向后移动到接触血滴，使血液均匀分散在推片与载波片的接触处，使之和载玻片形成一条垂直的血线；以一定倾角向另一端匀速平稳地推出，得所述血液涂片。

采用这种方法制作血液涂片，能够进一步的保证制作质量。血量取1滴、位置处于载玻片一端4-5mm处，能够将血量和载玻片的容量完美契合，做出的血液涂片中血液的位置、可观察的效果都极佳。

优选地，所述倾角为30-40度。

采用这种角度推动血液，能够最快、最好的制作好血液涂片，角度过大或者过小均会给制作带来操作困难，而且会影响血液涂片的质量。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)用量精准，在保证抗凝效果的同时，能够有效防止破坏红细胞形态，还原了血细胞本来的形态结构和特征；

(2)不需要昂贵的精密仪器，即可实现精准使用肝素钠；

(3)操作简单，不需要过多的操作经验，特别适合初学或者学生群体的操作实践；

(4)大大提高无经验人员制作血液涂片的成功率。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

量取肝素钠1g和蒸馏水100ml，然后将肝素钠充分溶于蒸馏水中，得抗凝剂母液；用蒸馏水将抗凝剂母液稀释得到0.5％的抗凝剂；用1ml注射器吸取0.5％的抗凝剂0.2ml，加蒸馏水至1ml，得备烘抗凝剂稀释液；将这1ml稀释后的抗凝剂平均滴加到10个进行过无菌处理的5ml注射器中，旋转每一个5ml注射器，使抗凝剂液体均匀的附着于注射器的管壁之上；将装有备烘抗凝剂稀释液的5ml注射器在50℃下烘干备用。

依照上述方法制备50个烘干的装有抗凝剂的5ml注射器，每个实验组一个，备用。

取血前准备：75％酒精棉球，灭菌纱布、装有抗凝剂的5ml注射器一个、麻醉药乙醚、青霉素小瓶一只、三黄鸡每组1只(共50组)、无菌手套。

戴好无菌手套，将三黄鸡称重并记录；将实验用三黄鸡固定于手术台上，乙醚吸入麻醉，5-8分钟后，鸡心脏或者翅膀静脉部位剪毛，备皮；75％酒精棉球，清洁消毒局部皮肤。

取血：

用烘干的装有抗凝剂的5ml注射器，从鸡的心脏采血至刻度2ml，采血完毕后，拔掉注射器的针头和活塞，用手指按住注射器的两端上下轻轻晃动，直到血的温度与常温相一致，然后将血轻轻倒入青霉素小瓶中，青霉素小瓶贴上标签，写好组号，放冰箱保存备用；如果在取血过程中，回血不畅，可轻轻的按摩左侧的心脏。

需要注意的是：使用本申请提供的抗凝剂，间隔时间越短越好，最长可抗5小时，最好是血液放入青霉素小瓶后，马上取血推片。且所取之血也可以是其他部位的血，如静脉血；此外，不局限于实验所用的三黄鸡，只要是适用于观察血细胞形态结构实验的动物血即可。

制备血液涂片：

用火柴圆头从青霉素小瓶中取血一滴，滴于备用好的载玻片一端4毫米处；另取一块边缘光滑的载波片做推片，将其一端置于血滴前方，向后移动到接触血滴，使血液均匀分散在推片与载波片的接触处，使之和载玻片成一条垂直的血线，以30度角，向另一端匀速平稳地推出，得到血液涂片。

后续处理：

染色，染色方法就是使用一般的吉姆萨瑞特氏复合染色法(略)；血液涂片染好色以后，用蒸馏水完全彻底的清洗干净血液涂片；晾干或烤干血液涂片；淘汰染色过深、过浅，带染色颗粒，血细胞分布不匀等废片，中性树胶封片；清洁盖玻片以外的染色区域；镜检。

统计成功制得清晰的血液涂片组数。

实施例2

量取肝素钠1g和蒸馏水100ml，然后将肝素钠充分溶于蒸馏水中，得抗凝剂母液；用蒸馏水将抗凝剂母液稀释得到0.1％的抗凝剂；用1ml注射器吸取0.1％的抗凝剂0.2ml，然后继续吸取蒸馏水至1ml，得备烘抗凝剂稀释液；将这1ml稀释后的抗凝剂平均滴加到10个进行过无菌处理的5ml注射器中，旋转每一个5ml注射器，使抗凝剂液体均匀的附着于注射器的管壁之上；将装有备烘抗凝剂稀释液的5ml注射器在60℃下烘干备用。

依照上述方法制备50个烘干的装有抗凝剂的5ml注射器，每个实验组一个，备用。

取血前准备与实施例1相同。

取血：

用烘干的装有抗凝剂的5ml注射器，从鸡的心脏采血至刻度3ml，采血完毕后，拔掉注射器的针头和活塞，用手指按住注射器的两端上下轻轻晃动，直到血的温度与常温相一致，然后将血轻轻倒入青霉素小瓶中，青霉素小瓶贴上标签，写好组号，放冰箱保存备用；如果在取血过程中，回血不畅，可轻轻的按摩左侧的心脏。

制备血液涂片：

用火柴圆头从青霉素小瓶中取血一滴，滴于备用好的载玻片一端5毫米处；另取一块边缘光滑的载波片做推片，将其一端置于血滴前方，向后移动到接触血滴，使血液均匀分散在推片与载波片的接触处，使之和载玻片成一条垂直的血线，以40度角，向另一端匀速平稳地推出，得到血液涂片。

后续处理与实施例1相同。

镜检并统计成功制得清晰的血液涂片数。

实施例3

量取肝素钠1g和蒸馏水100ml，然后将肝素钠充分溶于蒸馏水中，得抗凝剂母液；用蒸馏水将抗凝剂母液稀释得到0.5％的抗凝剂；用1ml注射器吸取0.5％的抗凝剂0.1ml，然后继续吸取蒸馏水至1ml，得备烘抗凝剂稀释液；将这1ml稀释后的抗凝剂平均滴加到10个进行过无菌处理的5ml注射器中，旋转每一个5ml注射器，使抗凝剂液体均匀的附着于注射器的管壁之上；将装有备烘抗凝剂稀释液的5ml注射器在40℃下烘干备用。

依照上述方法制备50个烘干的装有抗凝剂的5ml注射器，每个实验组一个，备用。

取血前准备与实施例1相同。

取血：

用烘干的装有抗凝剂的5ml注射器，从鸡的心脏采血至刻度1ml，采血完毕后，拔掉注射器的针头和活塞，用手指按住注射器的两端上下轻轻晃动，直到血的温度与常温相一致，然后将血轻轻倒入青霉素小瓶中，青霉素小瓶贴上标签，写好组号，放冰箱保存备用；如果在取血过程中，回血不畅，可轻轻的按摩左侧的心脏。

制备血液涂片：

用火柴圆头从青霉素小瓶中取血一滴，滴于备用好的载玻片一端5毫米处；另取一块边缘光滑的载波片做推片，将其一端置于血滴前方，向后移动到接触血滴，使血液均匀分散在推片与载波片的接触处，使之和载玻片成一条垂直的血线，以40度角，向另一端匀速平稳地推出，得到血液涂片。

后续处理与实施例1相同。

镜检并统计成功制得清晰的血液涂片组数。

实施例4

量取肝素钠1g和蒸馏水100ml，然后将肝素钠充分溶于蒸馏水中，得抗凝剂母液；用蒸馏水将抗凝剂母液稀释得到0.05％的抗凝剂；用5ml注射器吸取0.05％的抗凝剂1ml，然后继续吸取蒸馏水至5ml，得备烘抗凝剂稀释液；将这5ml稀释后的抗凝剂平均滴加到5个进行过无菌处理的10ml注射器中，旋转每一个10ml注射器，使抗凝剂液体均匀的附着于注射器的管壁之上；将装有备烘抗凝剂稀释液的10ml注射器在50℃下烘干备用。

依照上述方法制备50个烘干的装有抗凝剂的10ml注射器，每个实验组一个，备用。

取血前准备与实施例1相同。

取血：

用烘干的装有抗凝剂的10ml注射器，从鸡的心脏采血至刻度2ml，采血完毕后，拔掉注射器的针头和活塞，用手指按住注射器的两端上下轻轻晃动，直到血的温度与常温相一致，然后将血轻轻倒入青霉素小瓶中，青霉素小瓶贴上标签，写好组号，放冰箱保存备用；如果在取血过程中，回血不畅，可轻轻的按摩左侧的心脏。

制备血液涂片和后续处理与实施例1相同。

镜检并统计成功制得清晰的血液涂片组数。

比较例1

50组分别用不含有抗凝剂的注射器，使用实施例1提供的采血方法取血2ml，然后将血轻轻倒入青霉素小瓶中，青霉素小瓶贴上标签，写好组号。几分钟后，用火柴圆头想从青霉素小瓶中取血时，发现血液已经凝固，无法取血进行推片操作，因此实验全部失败。

比较例2

量取肝素钠1g和蒸馏水100ml，然后将肝素钠充分溶于蒸馏水中，得抗凝剂母液；用1ml注射器吸取抗凝剂母液0.2ml，然后继续吸取蒸馏水至1ml，得备烘抗凝剂稀释液；将这1ml稀释后的抗凝剂平均滴加到10个进行过无菌处理的5ml注射器中，旋转每一个5ml注射器，使抗凝剂液体均匀的附着于注射器的管壁之上；将装有备烘抗凝剂稀释液的5ml注射器在50℃下烘干备用。

其他步骤与实施例1相同，制备血液涂片并镜检，然后统计成功制得清晰的血液涂片的组数。

比较例3

量取肝素钠1g和蒸馏水100ml，然后将肝素钠充分溶于蒸馏水中，得抗凝剂母液；用蒸馏水将抗凝剂母液稀释得到0.1％的抗凝剂；用1ml注射器吸取0.1％的抗凝剂0.1ml，然后继续吸取蒸馏水至1ml，得备烘抗凝剂稀释液；将这1ml稀释后的抗凝剂平均滴加到10个进行过无菌处理的5ml注射器中，旋转每一个5ml注射器，使抗凝剂液体均匀的附着于注射器的管壁之上；将装有备烘抗凝剂稀释液的5ml注射器在50℃下烘干备用。

其他步骤与实施例1相同，制备血液涂片并镜检，然后统计成功制得清晰的血液涂片组数。

将实施例和比较例统计的成功制得清晰的血液涂片的组数记录，如下表1所示：

表1成功制得清晰的血液涂片的组数

实施例4与实施例1对比说明，使用的注射器的容量增大，会对涂血片的质量造成不利影响，分析原因在于，注射器的容量增大，其量取精度会下降，量取存在偏差，这种偏差对抗凝效果影响较大。

比较例1与实施例1对比说明，本申请提供的制备抗凝剂的方法、所获得的抗凝剂以及制备血液涂片的方法与现有技术相比，制备血液涂片质量高、成功率高。

比较例2、比较例3与实施例1对比说明，抗凝剂用量增大或减小时，导致所做出来的血液涂片基本都是废片，分析可能是由于抗凝剂用量增大时，红细胞严重的变形，呈锯齿状，破坏了红细胞原始形态；抗凝剂用量减小时，抗凝血效果差。本申请实施例所用的量为最佳量。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (8)

1.一种抗凝剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a.分别量取肝素钠和蒸馏水，然后将肝素钠充分溶于蒸馏水中，得抗凝剂母液；

b.用蒸馏水将所述抗凝剂母液稀释，然后用1ml注射器定量吸取稀释后的所述抗凝剂母液，再吸取蒸馏水至1ml，得到备烘抗凝剂稀释液；

c.用低容量注射器向高容量注射器内定量注入所述备烘抗凝剂稀释液；所述低容量注射器为1ml注射器，所述高容量注射器为5ml注射器；

d.将装有所述备烘抗凝剂稀释液的所述高容量注射器在40－60℃下烘干备用。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c之后、所述步骤d之前还包括：

旋转所述高容量注射器，使所述备烘抗凝剂稀释液均匀附着于所述高容量注射器的管壁之上。

3.一种权利要求1－2任一项所述的方法制得的抗凝剂。

4.使用权利要求3所述的抗凝剂制备血液涂片的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

e.用装有所述抗凝剂的所述高容量注射器采血；

f.混匀采血后的所述高容量注射器；

g.取步骤f得到的血，用载玻片制备血液涂片。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤f具体为：

采血完毕后，拔掉所述高容量注射器的针头和活塞，用手指按住注射器的两端上下轻轻晃动，直到血的温度与常温相一致，然后将所述的血轻轻倒入容器中备用。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述采血量为2ml，用来采血的所述高容量注射器内装有的所述抗凝剂含有肝素钠0.02－0.1mg。

7.根据权利要求4－6任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤g具体为：

用火柴圆头取1滴步骤f所得的血滴于备用载玻片一端4－5mm处，另取一块边缘光滑的载玻片，做推片并将其一端置于血滴前方，向后移动到接触血滴，使血液均匀分散在推片与载波片的接触处，使之和载玻片成一条垂直的血线；以一定倾角向另一端匀速平稳地推出，得所述血液涂片。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述倾角为30－40度。