CN104726571A - 肿瘤联合治疗相关基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可用于肝癌细胞联合治疗的基因，该基因为Shp2，本发明还公开了应用该基因进行肝癌联合治疗的方法，Shp2可以影响细胞对化疗药物表现出较好的反应性。本发明还公开了一种通过敲除或减少Shp2的表达来影响肿瘤化疗效果的方法，以及该基因在预测肿瘤化疗效果、提高肿瘤化疗反应性、制备肿瘤治疗药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种可用于肿瘤细胞联合治疗具有决定作用的基因及其应用，特别是涉及将该基因作为靶基因并下调该基因在病人体内的表达以增强化疗的疗效。
背景技术
作为恶性肿瘤之一的原发性肝癌，因其异质性极高，使得其成为当前人类无法攻克的一种恶性疾病。目前，肝癌的主要治疗手段包括手术切除、化学药物治疗和放射治疗等，其中化学药物疗法已广泛用于晚期肝癌患者。但是肿瘤化疗药物的毒副作用及患者产生的耐药现象，很大程度上限制了肿瘤化疗药物的使用。其次，由于在治疗前无法判断不同肿瘤患者对肿瘤化疗药物的反应性，临床医生主要还是依据其临床经验选择不同的药物，因此具有一定的盲目性。再者，不恰当的使用肿瘤化疗药物不仅使患者正常细胞和免疫系统遭到破坏，还有可能诱导肿瘤细胞产生对多种药物的联合耐药性，即多药耐药性，进而导致化学治疗的失败。肿瘤化疗失败的主要原因是肿瘤细胞的耐药性，对目前主要采用药物治疗的肿瘤而言，找到肿瘤细胞耐药性的原因和决定肿瘤化疗疗效的基因是一项具有重大意义的课题。
在过去十几年中，抗肿瘤药物研发取得了长足的进展，许多抗肿瘤新药进入临床应用。由拜耳公司研发的索拉菲尼(Sorafenib)是第一个，也是唯一一个获得美国FDA批准上市，用于治疗肝细胞癌的多靶点药物。它能够抑制多个酪氨酸蛋白激酶，如VEGFR、PDGFR，还能抑制ERK1/2信号通路中抑制丝/苏氨酸蛋白激酶RAF，从而抑制了肿瘤细胞生长和肿瘤血管形成，进而阻止了肿瘤的生长。但肝癌患者中使用索拉菲尼易产生耐药性，治疗效果也不理想(参见文献：Shibo Lin,Katrin Hoffmann,Peter Schemmer,Treatment ofHepatocellularCarcinoma:A Systematic Review,Liver Cancer 2012；1:144–158.)。
Shp2蛋白是由基因PTPN11所编码(GeneID:5781)，是具有去磷酸化作用的一种胞浆型蛋白酪氨酸磷酸酶(英文全称：protein tyrosine phosphatase,non-receptor type 11)，结构上含有2个相同的SH2结构域，Shp2通过SH2结构域结合磷酸化的酪氨酸残基，使其自身结构中的酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP酶)激活，可将细胞内其他信号分子去磷酸化(参见文献：A.Alonso,J.Sasin,N.Bottini,I.Friedberg,A.Osterman,A.Godzik,T.Hunter,J.Dixon and T.Mustelin,Protein tyrosine phosphatases in the human genome,Cell117(2004),pp.699–711.)。研究表明，Shp2分子可参与多种细胞信号通路，调控细胞增殖、凋亡等生物学行为，但Shp2在肝癌药物治疗中的作用报道很少。本申请人已获得中国发明专利CN201310005628.6，发明名称为“Shp2蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用”，授权公布号为CN103063850B。
在索拉菲尼治疗肝癌病人的过程中，Shp2的作用尚不清楚。
另外，也未见肝癌中Shp2表达与其对索拉菲尼疗效影响的相关报道。
发明内容
本发明的目的是：提供一种可用于肿瘤联合治疗的基因。
本发明的另一个目的是：提供上述基因在预测肿瘤化疗效果、提高肿瘤化疗疗效、制备肿瘤治疗药物中的应用。
本发明的再一个目的是：提供一种提高肿瘤化疗效果的方法。
本发明的再一个目的是：提供一种预测肿瘤化疗反应性的方法。
本发明的第一方面，提供了一种可用于肿瘤联合治疗的基因，所述的基因为Shp2基因(GeneID:5781)，所述的肿瘤联合治疗药物为索拉菲尼。
Shp2基因也是肿瘤化疗药物敏感基因。
本发明的第二方面，提供了Shp2基因在制备检测肿瘤化疗药物反应性试剂或试剂盒中的应用。
所述的肿瘤化疗药物为索拉菲尼。
所述的检测肿瘤化疗药物反应性，即预测或评估肿瘤化疗效果、病人对肿瘤化疗药物是否有反应。
进一步地，本发明还提供了Shp2基因在肿瘤联合治疗、制备抗肿瘤药物中的应用。
Shp2基因在肿瘤联合治疗，所述的联合治疗药物为索拉菲尼。
Shp2基因在制备抗肿瘤药物中的应用，优选的，所述的肿瘤优选为肝癌。
在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的药物为抑制或降低Shp2基因转录(翻译)的物质与索拉菲尼联用。
所述的抑制或降低Shp2基因转录(翻译)的物质为Shp2小干扰RNA，
正义链5'UUAAUUGCCCGUGAUGUUCUU3'(SEQ ID NO：1)
反义链5'GAACAUCACGGGCAAUUAAUU3'(SEQ ID NO：2)
本发明还提供了Shp2基因在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的应用，所述的肿瘤化疗药物为索拉菲尼。
本发明的第三方面，提供一种提高肿瘤化疗效果的方法，具体是通过降低Shp2基因的表达来提高肿瘤化疗药物疗效的方法。所述的肿瘤化疗药物为索拉菲尼。
本发明的第四方面，提供一种预测肿瘤化疗药物反应性的方法，具体是应用Shp2基因来预测肝癌细胞对索拉菲尼反应性的方法。所述的肿瘤化疗药物为索拉菲尼。
本发明经实验发现，当肝癌细胞内有Shp2表达可以影响肝癌细胞对索拉菲尼的反应性。
本发明将有助于开发针对Shp2表达的诊断试剂盒，以预测病人对化疗的治疗效果；也有助于抗癌药物的筛选来寻找降低Shp2表达的化学和生物分子，最终达到减轻化疗药物的毒副作用，节约医疗费用，增加治愈率的作用。本发明为肿瘤的治疗提高的新的临床手段。
附图说明
图1是Shp2在肝癌患者中的表达情况示意图，其中T：癌组织，N：癌旁组织；
图2是建立的干扰Shp2的稳转细胞系及对照细胞系，其中细胞为肝癌细胞SMMC-7721；
图3是干扰Shp2的稳转细胞系及对照细胞系分别给予索拉菲尼后，肝癌细胞生长情况的示意图；
图4是干扰Shp2的稳转细胞系及对照细胞系分别给予索拉菲尼后，肝癌细胞克隆形成能力的示意图，其中A为细胞所形成克隆的照片，B为比较克隆数量的示意图，C比较克隆体积的示意图；
图5是干扰Shp2的稳转细胞系及对照细胞系分别给予索拉菲尼后，肝癌细胞凋亡比例的示意图，其中A为流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡的结果示意图，B比较两种肝癌细胞凋亡比例的示意图；
图6是干扰Shp2的稳转细胞系及对照细胞系在裸鼠皮下荷瘤后分别给予索拉菲尼治疗后，裸鼠移植瘤体积的示意图，其中A为裸鼠移植瘤的照片，B为裸鼠移植瘤生长曲线。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
索拉菲尼：购自拜耳公司，规格为0.2g/片。
实验动物：裸鼠(8周龄)，雄性，均购于第二军医大学实验动物中心。
实施例1：
从人肝癌的癌组织及癌旁组织中提取RNA，肝癌患者的癌组织及癌旁组织来自东方肝胆外科医院肝癌组织样本库。提取RNA的方法(参见invitrogen公司Trizol Plus试剂盒)，从肝癌病人的癌组织及癌旁组织中提取总RNA并逆转录获取cDNA。
即按照Trizol操作程序抽提总RNA，并将RNA逆转录获得cDNA。反应体系25μl，各管分别含逆转录缓冲液(5×)5.0μl，dNTPs(10mM)1μ1，RNasin0.5μ1,M-MLV-RTase 1.0μ1，RNA 2μg(体积由RNA浓度决定)，N61μ1，DEPC H2O补至25μ1，然后70℃5min，4℃4min，37℃60min，70℃10min，10℃20min进行逆转录。
Applied Biosystems 7300/7900 Fast Real-Time PCR System荧光定量PCR仪定量检测。Shp2基因引物序列：
上游引物5'CTGCCTCCACACCAGTGATA3'(SEQ ID NO：3)，
下游引物5'GGAGCCTGAGCAAGGAGC 3'(SEQ ID NO：4)。
以B-actin为内参，引物序列：
上游引物5'AATCGTGCGTGACATTAAGGAG3'(SEQ ID NO：5)，
下游引物5'ACTGTGTTGGCGTACAGGTCTT3'(SEQ ID NO：6)。
反应体系10μ1，含cDNA 0.5μ1，Shp2(或B-actin)上游、下游引物各1μ1，2xTaqman SYBR 12.5μ1，ddH20 10μ1。反应参数：95℃预变性10分钟，之后95℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，共40个循环，72℃终末延伸10min。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4秒，记录吸光值和制作熔解曲线(图1)。
由图1可知，Shp2在134例肝癌组织中的大部分癌组织中与癌旁组织相比呈现高表达。
实施例2：
采用能够特异性沉默Shp2基因表达的shRNA经由慢病毒载体表达。
制备过程包括：将编码Shp2基因小分子干扰RNA的DNA片段克隆插入慢病毒载体获得Shp2基因干扰慢病毒载体，进而利用该干扰Shp2基因慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肝癌细胞SMMC-7721(此细胞购自中科院细胞所)并最终获得特异性沉默Shp2基因表达的SMMC-7721细胞系(命名为SMMC-7721shShp2)及其对照细胞系(命名为SMMC-7721GFP)。
Shp2干扰型(shShp2)慢病毒构建。该方法包括：
A、构建Shp2干扰型(shShp2)慢病毒质粒；
B、包装Shp2干扰型(shShp2)慢病毒；
C、将Shp2干扰型(shShp2)慢病毒转染SMMC-7721细胞。
该方法具体包括：
A、合成如下shShp2序列并克隆入Lenti慢病毒载体中，构建Shp2干扰型(shShp2)慢病毒质粒为：Lenti-shShp2；
正义链5'UUAAUUGCCCGUGAUGUUCUU3'(SEQ ID NO：1)
反义链5'GAACAUCACGGGCAAUUAAUU3'(SEQ ID NO：2)
B、Shp2干扰型(shShp2)慢病毒质粒与pCMV、pMD2G慢病毒骨架质粒共转包装Shp2干扰型(shShp2)慢病毒；
C、Shp2干扰型(shShp2)慢病毒转染SMMC-7721细胞。
如图2所示，用GAPDH作为内参，SMMC-7721shShp2细胞系Shp2蛋白表达量相对于SMMC-7721GFP细胞系明显减少。
实施例3：
将实施例2制备得到的肝癌细胞系SMMC-7721GFP、SMMC-7721shShp2分别传入96孔板，每孔5000个细胞，每种细胞分为DMSO及索拉菲尼两组，每组设3个副孔。待细胞贴壁后计为0h，同时各组分别给予DMSO或索拉菲尼(5μM)。在72h吸掉培养基，加入用DMEM稀释的10％的CCK8检测试剂，37℃孵箱孵育1h后检测450nm处的吸光度值,并用所测的吸光度值绘制生长曲线(图3)。
由图3可知，干扰Shp2基因表达可以促进肝癌细胞对Sorafenib抑制克隆形成的效应。
实施例4：
为了进一步证明索拉菲尼能够抑制肝癌细胞SMMC-7721shShp2的增殖，进行细胞克隆实验。
实验方法如下：将实施例2制备得到的肝癌细胞系SMMC-7721GFP、SMMC-7721shShp2传入6孔板中，每孔500个细胞。分为DMSO、Sorafenib(2μM)2组，每组设3个副孔。待细胞贴壁后，各组换成分别含有DMSO及Sorafenib(2μM)的培养基，放入37℃孵箱孵育1周。第7d吸除培养基，用生理盐水冲洗两遍，加入结晶紫染色5min，吸除结晶紫，再用生理盐水冲洗2遍，拍照，并计算各孔中形成克隆个数。统计每组各副孔克隆形成个数，并绘制计数柱状图(图4)。
由图4可知，干扰Shp2基因表达的肝癌细胞对Sorafenib引起的生长抑制更加显著。
实施例5：
将实施例2制备得到的肝癌细胞系SMMC-7721GFP、SMMC-7721shShp2传入6孔板，每孔传约2×105个细胞。待细胞贴壁后分为2组，每组设3个副孔，各组分别换成含有以下药物的培养基：(1)DMSO；(2)Sorafenib(20mM)；放入37℃孵箱孵育24h后吸掉培养基，用胰酶将细胞消化下来，并用生理盐水悬浮于1.5ml EP管中后离心，吸掉上清，留细胞沉淀。将配好的凋亡检测试剂(Annexin V)加到含有细胞沉淀的EP管中悬浮细胞，在室温避光条件下孵育15min，然后加入终止液，上流式细胞仪检测(图5)。
由图5可知，干扰Shp2基因表达可以促进肝癌细胞对Sorafenib诱导的细胞凋亡。
实施例6：
实施例2制备得到的肝癌细胞系SMMC-7721GFP、SMMC-7721shShp2培养到充足密度后用胰酶消化下来，并用生理盐水重悬，细胞计数后，将2×106个细胞打入裸鼠皮下，裸鼠左侧为SMMC-7721GFP细胞，右侧为SMMC-7721shShp2。同时，将裸鼠分为2组，采用灌胃的方法，一组给予DMSO，一组给予Sorafenib 1.5mg/kg，2d一次，共八周。每3w测量一次肿瘤直径，计算各组肿瘤体积后，绘制肿瘤生长曲线图。
如图6所示，干扰Shp2基因表达的肝癌移植瘤与其对照相比生长较慢，而给与Sorafenib药物后，该移植瘤的体积进一步缩小、甚至消失。这一结果提示我们，Shp2基因低表达的肝癌对索拉菲尼反应性更好；在肝癌中下调Shp2表达可以促进索拉菲尼的疗效。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.一种可用于肿瘤联合治疗的基因，其特征在于，所述的基因为Shp2基因，所述的肿瘤联合治疗药物为索拉菲尼。
2.Shp2基因在制备检测肿瘤化疗药物反应性试剂或试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的Shp2基因在制备检测肿瘤化疗药物反应性试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的肿瘤化疗药物为索拉菲尼。
4.Shp2基因在制备肿瘤联合治疗药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤联合治疗药物为Shp2基因和索拉菲尼。
5.Shp2基因在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抑制或降低Shp2基因转录的物质与索拉菲尼联用。
6.Shp2基因在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的应用，所述的肿瘤化疗药物为索拉菲尼。
7.根据权利要求2所述的Shp2基因在制备检测肿瘤化疗药物反应性试剂或试剂盒中的应用，所述的肿瘤为肝癌。
8.根据权利要求6所述的Shp2基因在制备肿瘤化疗药物增敏剂中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌。
9.根据权利要求5所述的Shp2基因在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抑制或降低Shp2基因转录的物质为Shp2的小干扰RNA。
10.根据权利要求9所述的Shp2基因在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的Shp2的小干扰RNA的序列如下：
正义链5'UUAAUUGCCCGUGAUGUUCUU3'(SEQ ID NO：1)；
反义链5'GAACAUCACGGGCAAUUAAUU3'(SEQ ID NO：2)。
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|---|---|---|---|---|
| CN106645723A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-05-10 | 中国人民解放军第二军医大学 | Shp2蛋白在制备肝癌对索拉菲尼疗效评估试剂盒中的应用 |
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|---|
| 韩涛: "Shp2调控肝癌进展的信号网络及临床意义研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN106645723A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-05-10 | 中国人民解放军第二军医大学 | Shp2蛋白在制备肝癌对索拉菲尼疗效评估试剂盒中的应用 |
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