CN104726521B - 一种双酶提高γ‑环糊精专一性的方法 - Google Patents
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Abstract
一种双酶提高γ‑环糊精专一性的方法，包括以下步骤：(1)以玉米淀粉为底物，微波加热使其完全溶解于pH为8.5、浓度为50mmol/l的Tris‑Hcl缓冲溶液中，得到玉米淀粉溶液；(2)向玉米淀粉溶液中分别加入4αGTase和CGTase两种酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后，沸水煮沸灭酶30min；(3)向反应液加入葡萄糖淀粉酶，38℃条件下反应16‑24h，反应结束后煮沸灭酶10min，10000rpm离心5min；(4)上清液即为含γ‑环糊精的混合物。本发明解决了γ‑环糊精专一性低的问题，进而扩大其应用范围。
Description
技术领域
本发明涉及食品技术领域，尤其是涉及一种采用双酶法提高γ-环糊精专一性的方法。
背景技术
环糊精是由芽孢杆菌属的某些种产生的葡萄糖基转移酶作用于淀粉而生成的一类环状低聚糖。环糊精最显著的特征是具有一个环外亲水、环内疏水且有一定尺寸的立体手性空腔，因而可以包埋一些疏水性的分子或者基团。γ-环糊精是由8个D-吡喃型葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键链接而成的。与α、β环糊精相比，γ-环糊精具有较大的疏水性空腔、较高的溶解度，能包接较大的分子，因此在食品、医疗行业有着较广泛的应用空间。
然而，到目前为止，在市场上研究最广泛的是β-环糊精和较小范围的α-环糊精，但γ-环糊精在国内尚未有工业化生产，主要是因为其低产率、高成本导致的高价格限制了其使用。大多数的CGTase作用淀粉生成的产物中大多数为α、β、γ三种环糊精的混合物，为提高产物专一性，多采用基因工程的方法，通过对CGTase进行改造和突变，实现产物专一性提高。还没有用双酶法调控提高环糊精产物专一性的相关报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明人提供了一种双酶提高γ-环糊精专一性的方法。本发明解决了γ-环糊精专一性低的问题，进而扩大其应用范围。
本发明的技术方案如下：
一种双酶提高γ-环糊精专一性的方法，包括以下步骤：
(1)以玉米淀粉为底物，微波加热使其完全溶解于pH为8.5、浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲溶液中，得到玉米淀粉溶液；
(2)向玉米淀粉溶液中分别加入4αGTase和CGTase两种酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后，沸水煮沸灭酶30min；
(3)向反应液加入葡萄糖淀粉酶，38℃条件下反应16-24h，反应结束后煮沸灭酶10min，10000rpm离心5min；
(4)上清液即为含γ-环糊精的混合物。
所述双酶为4αGTase和CGTase；其中4αGTase是来自于thermus acquaticus的一种糖基转移酶，CGTase是来自于alkalophilic bacillus 825-6的一种环糊精糖基转移酶。
步骤(1)中所述玉米淀粉溶液的浓度为1～5％。
步骤(2)中酶的添加方式为先加4αGTase，后加CGTase。
步骤(2)中加入4αGTase后反应温度为70℃，反应时间为8-24h；加入CGTase后反应温度为60～70℃，反应时间为24-48h。
步骤(2)中4αGTase和CGTase两种酶的用量范围分别为：0.05U-0.5U/g淀粉。
步骤(3)中葡萄糖淀粉酶的用量范围为：0.1U-0.5U/g淀粉。
本发明有益的技术效果在于：
本发明采用4αGTase和CGtase相结合，催化淀粉制备环糊精，通过提高催化温度，实现了对γ-环糊精产物专一性的提高。
附图说明
图1为单酶反应和双酶反应(γ-环糊精/β-环糊精比率)对γ-环糊精的专一性的影响示意图。
具体实施方式
下面结合附图1，对本发明进行具体描述。
本发明所用双酶为4αGTase和CGTase；其中4αGTase是来自于thermus acquaticus的一种糖基转移酶，CGTase是来自于alkalophilic bacillus 825-6的一种环糊精糖基转移酶。酶的来源为市售。
实施例1
(1)将玉米淀粉溶于50ml的pH8.5的浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲液中，制成1％的溶液，微波加热2-3min使其糊化。
(2)取(1)中配置好的溶液1ml，先加入0.1U/g淀粉的4αGTase在70℃下反应24h预处理玉米淀粉，之后再向反应体系中加入0.5U/g淀粉的CGTase在60℃下反应24h。
(3)将步骤(2)中的反应液煮沸灭活30min。
(4)取步骤(3)中的反应液500ul和500ul 0.2M pH4.2的醋酸钠缓冲溶液混合，并向其中加入0.4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38℃下反应16h。
(5)将步骤(4)所得的反应液煮沸10min灭酶，灭酶后18000g离心5min。
(6)对上述步骤所测定的环糊精溶液进行测定，γ-环糊精/β-环糊精比率为2.52。
实施例2
(1)将玉米淀粉溶于50ml的pH8.5的浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲液中，制成1％的溶液，微波加热2-3min使其糊化。
(2)取(1)中配置好的溶液1ml，先加入0.1U/g淀粉的4αGTase在70℃下反应24h预处理玉米淀粉，之后再向反应体系中加入0.5U/g淀粉CGTase在70℃下反应24h。
(3)将步骤(2)中的反应液煮沸灭活30min。
(4)取步骤(3)中的反应液500ul和500ul 0.2M pH4.2的醋酸钠缓冲溶液混合，并向其中加入0.4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38℃下反应16h。
(5)将步骤(4)所得的反应液煮沸10min灭酶，灭酶后18000g离心5min。
(6)对上述步骤所测定的环糊精溶液进行测定，γ-环糊精/β-环糊精比率为4.15。
实施例3
(1)将玉米淀粉溶于50ml的pH8.5的浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲液中，制成1％的溶液，微波加热2-3min使其糊化。
(2)取(1)中配置好的溶液1ml，先加入0.05U/g淀粉的4αGTase在70℃下反应24h预处理玉米淀粉，之后再向反应体系中加入0.5U/g淀粉的CGTase在70℃下反应24h。
(3)将步骤(2)中的反应液煮沸灭活30min。
(4)取步骤(3)中的反应液500ul和500ul 0.2M pH4.2的醋酸钠缓冲溶液混合，并向其中加入0.4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38℃下反应16h。
(5)将步骤(4)所得的反应液煮沸10min灭酶，灭酶后18000g离心5min。
(6)对上述步骤所测定的环糊精溶液进行测定，γ-环糊精/β-环糊精比率为6.18。
对比例
(1)将玉米淀粉溶于50ml的pH8.5的浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲液中，制成1％的溶液，微波加热2-3min使其糊化。
(2)取(1)中配置好的溶液1ml，向反应体系中加入0.5U/g淀粉CGTase在50℃下反应24h。
(3)将步骤(2)中的反应液煮沸灭活30min。
(4)取步骤(3)中的反应液500ul和500ul 0.2M pH4.2的醋酸钠缓冲溶液混合，并向其中加入0.4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38℃下反应16h。
(5)将步骤(4)所得的反应液煮沸10min灭酶，灭酶后18000g离心5min。
(6)对上述步骤所测定的环糊精溶液进行测定，γ-环糊精/β-环糊精比率为0.55。
从图1可以看到，采用4αGTase和CGTase相结合的方法，催化玉米淀粉，制备γ-环糊精，使γ-环糊精的专一性得到极大地提高(对应实施例1、2、3及对比例)。
Claims (1)
1.一种双酶提高γ-环糊精专一性的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以玉米淀粉为底物，微波加热使其完全溶解于pH为8.5、浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲溶液中，得到玉米淀粉溶液；
(2)向玉米淀粉溶液中分别加入4αGTase和CGTase两种酶，控制反应温度和反应时间，反应结束后，沸水煮沸灭酶30min；
(3)向反应液加入葡萄糖淀粉酶，38℃条件下反应16-24h，反应结束后煮沸灭酶10min，10000rpm离心5min；
(4)上清液即为含γ-环糊精的混合物；
所述双酶为4αGTase和CGTase；其中4αGTase是来自于thermus acquaticus的一种糖基转移酶，CGTase是来自于alkalophilic bacillus 825-6的一种环糊精糖基转移酶；
步骤(1)中所述玉米淀粉溶液的浓度为1～5％；
步骤(2)中酶的添加方式为先加4αGTase，后加CGTase；
步骤(2)中加入4αGTase后反应温度为70℃，反应时间为8-24h；加入CGTase后反应温度为60～70℃，反应时间为24-48h；
步骤(2)中4αGTase和CGTase两种酶的用量范围分别为：0.05U-0.5U/g淀粉；
步骤(3)中葡萄糖淀粉酶的用量范围为：0.1U-0.5U/g淀粉。
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