CN104726521B - 一种双酶提高γ‑环糊精专一性的方法 - Google Patents

一种双酶提高γ‑环糊精专一性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104726521B
CN104726521B CN201510176751.3A CN201510176751A CN104726521B CN 104726521 B CN104726521 B CN 104726521B CN 201510176751 A CN201510176751 A CN 201510176751A CN 104726521 B CN104726521 B CN 104726521B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cyclodextrin
reaction
cgtase
gtase
enzymes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510176751.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104726521A (zh
Inventor
王金鹏
李林林
张梦柯
周星
赵建伟
杨哪
谢正军
徐学明
金征宇
焦爱权
田耀旗
吴凤凤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201510176751.3A priority Critical patent/CN104726521B/zh
Publication of CN104726521A publication Critical patent/CN104726521A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104726521B publication Critical patent/CN104726521B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

一种双酶提高γ‑环糊精专一性的方法,包括以下步骤:(1)以玉米淀粉为底物,微波加热使其完全溶解于pH为8.5、浓度为50mmol/l的Tris‑Hcl缓冲溶液中,得到玉米淀粉溶液;(2)向玉米淀粉溶液中分别加入4αGTase和CGTase两种酶,控制反应温度和反应时间,反应结束后,沸水煮沸灭酶30min;(3)向反应液加入葡萄糖淀粉酶,38℃条件下反应16‑24h,反应结束后煮沸灭酶10min,10000rpm离心5min;(4)上清液即为含γ‑环糊精的混合物。本发明解决了γ‑环糊精专一性低的问题,进而扩大其应用范围。

Description

一种双酶提高γ-环糊精专一性的方法
技术领域
本发明涉及食品技术领域,尤其是涉及一种采用双酶法提高γ-环糊精专一性的方法。
背景技术
环糊精是由芽孢杆菌属的某些种产生的葡萄糖基转移酶作用于淀粉而生成的一类环状低聚糖。环糊精最显著的特征是具有一个环外亲水、环内疏水且有一定尺寸的立体手性空腔,因而可以包埋一些疏水性的分子或者基团。γ-环糊精是由8个D-吡喃型葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键链接而成的。与α、β环糊精相比,γ-环糊精具有较大的疏水性空腔、较高的溶解度,能包接较大的分子,因此在食品、医疗行业有着较广泛的应用空间。
然而,到目前为止,在市场上研究最广泛的是β-环糊精和较小范围的α-环糊精,但γ-环糊精在国内尚未有工业化生产,主要是因为其低产率、高成本导致的高价格限制了其使用。大多数的CGTase作用淀粉生成的产物中大多数为α、β、γ三种环糊精的混合物,为提高产物专一性,多采用基因工程的方法,通过对CGTase进行改造和突变,实现产物专一性提高。还没有用双酶法调控提高环糊精产物专一性的相关报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本发明人提供了一种双酶提高γ-环糊精专一性的方法。本发明解决了γ-环糊精专一性低的问题,进而扩大其应用范围。
本发明的技术方案如下:
一种双酶提高γ-环糊精专一性的方法,包括以下步骤:
(1)以玉米淀粉为底物,微波加热使其完全溶解于pH为8.5、浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲溶液中,得到玉米淀粉溶液;
(2)向玉米淀粉溶液中分别加入4αGTase和CGTase两种酶,控制反应温度和反应时间,反应结束后,沸水煮沸灭酶30min;
(3)向反应液加入葡萄糖淀粉酶,38℃条件下反应16-24h,反应结束后煮沸灭酶10min,10000rpm离心5min;
(4)上清液即为含γ-环糊精的混合物。
所述双酶为4αGTase和CGTase;其中4αGTase是来自于thermus acquaticus的一种糖基转移酶,CGTase是来自于alkalophilic bacillus 825-6的一种环糊精糖基转移酶。
步骤(1)中所述玉米淀粉溶液的浓度为1~5%。
步骤(2)中酶的添加方式为先加4αGTase,后加CGTase。
步骤(2)中加入4αGTase后反应温度为70℃,反应时间为8-24h;加入CGTase后反应温度为60~70℃,反应时间为24-48h。
步骤(2)中4αGTase和CGTase两种酶的用量范围分别为:0.05U-0.5U/g淀粉。
步骤(3)中葡萄糖淀粉酶的用量范围为:0.1U-0.5U/g淀粉。
本发明有益的技术效果在于:
本发明采用4αGTase和CGtase相结合,催化淀粉制备环糊精,通过提高催化温度,实现了对γ-环糊精产物专一性的提高。
附图说明
图1为单酶反应和双酶反应(γ-环糊精/β-环糊精比率)对γ-环糊精的专一性的影响示意图。
具体实施方式
下面结合附图1,对本发明进行具体描述。
本发明所用双酶为4αGTase和CGTase;其中4αGTase是来自于thermus acquaticus的一种糖基转移酶,CGTase是来自于alkalophilic bacillus 825-6的一种环糊精糖基转移酶。酶的来源为市售。
实施例1
(1)将玉米淀粉溶于50ml的pH8.5的浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲液中,制成1%的溶液,微波加热2-3min使其糊化。
(2)取(1)中配置好的溶液1ml,先加入0.1U/g淀粉的4αGTase在70℃下反应24h预处理玉米淀粉,之后再向反应体系中加入0.5U/g淀粉的CGTase在60℃下反应24h。
(3)将步骤(2)中的反应液煮沸灭活30min。
(4)取步骤(3)中的反应液500ul和500ul 0.2M pH4.2的醋酸钠缓冲溶液混合,并向其中加入0.4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38℃下反应16h。
(5)将步骤(4)所得的反应液煮沸10min灭酶,灭酶后18000g离心5min。
(6)对上述步骤所测定的环糊精溶液进行测定,γ-环糊精/β-环糊精比率为2.52。
实施例2
(1)将玉米淀粉溶于50ml的pH8.5的浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲液中,制成1%的溶液,微波加热2-3min使其糊化。
(2)取(1)中配置好的溶液1ml,先加入0.1U/g淀粉的4αGTase在70℃下反应24h预处理玉米淀粉,之后再向反应体系中加入0.5U/g淀粉CGTase在70℃下反应24h。
(3)将步骤(2)中的反应液煮沸灭活30min。
(4)取步骤(3)中的反应液500ul和500ul 0.2M pH4.2的醋酸钠缓冲溶液混合,并向其中加入0.4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38℃下反应16h。
(5)将步骤(4)所得的反应液煮沸10min灭酶,灭酶后18000g离心5min。
(6)对上述步骤所测定的环糊精溶液进行测定,γ-环糊精/β-环糊精比率为4.15。
实施例3
(1)将玉米淀粉溶于50ml的pH8.5的浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲液中,制成1%的溶液,微波加热2-3min使其糊化。
(2)取(1)中配置好的溶液1ml,先加入0.05U/g淀粉的4αGTase在70℃下反应24h预处理玉米淀粉,之后再向反应体系中加入0.5U/g淀粉的CGTase在70℃下反应24h。
(3)将步骤(2)中的反应液煮沸灭活30min。
(4)取步骤(3)中的反应液500ul和500ul 0.2M pH4.2的醋酸钠缓冲溶液混合,并向其中加入0.4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38℃下反应16h。
(5)将步骤(4)所得的反应液煮沸10min灭酶,灭酶后18000g离心5min。
(6)对上述步骤所测定的环糊精溶液进行测定,γ-环糊精/β-环糊精比率为6.18。
对比例
(1)将玉米淀粉溶于50ml的pH8.5的浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲液中,制成1%的溶液,微波加热2-3min使其糊化。
(2)取(1)中配置好的溶液1ml,向反应体系中加入0.5U/g淀粉CGTase在50℃下反应24h。
(3)将步骤(2)中的反应液煮沸灭活30min。
(4)取步骤(3)中的反应液500ul和500ul 0.2M pH4.2的醋酸钠缓冲溶液混合,并向其中加入0.4U/g淀粉的葡萄糖淀粉酶在38℃下反应16h。
(5)将步骤(4)所得的反应液煮沸10min灭酶,灭酶后18000g离心5min。
(6)对上述步骤所测定的环糊精溶液进行测定,γ-环糊精/β-环糊精比率为0.55。
从图1可以看到,采用4αGTase和CGTase相结合的方法,催化玉米淀粉,制备γ-环糊精,使γ-环糊精的专一性得到极大地提高(对应实施例1、2、3及对比例)。

Claims (1)

1.一种双酶提高γ-环糊精专一性的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)以玉米淀粉为底物,微波加热使其完全溶解于pH为8.5、浓度为50mmol/l的Tris-Hcl缓冲溶液中,得到玉米淀粉溶液;
(2)向玉米淀粉溶液中分别加入4αGTase和CGTase两种酶,控制反应温度和反应时间,反应结束后,沸水煮沸灭酶30min;
(3)向反应液加入葡萄糖淀粉酶,38℃条件下反应16-24h,反应结束后煮沸灭酶10min,10000rpm离心5min;
(4)上清液即为含γ-环糊精的混合物;
所述双酶为4αGTase和CGTase;其中4αGTase是来自于thermus acquaticus的一种糖基转移酶,CGTase是来自于alkalophilic bacillus 825-6的一种环糊精糖基转移酶;
步骤(1)中所述玉米淀粉溶液的浓度为1~5%;
步骤(2)中酶的添加方式为先加4αGTase,后加CGTase;
步骤(2)中加入4αGTase后反应温度为70℃,反应时间为8-24h;加入CGTase后反应温度为60~70℃,反应时间为24-48h;
步骤(2)中4αGTase和CGTase两种酶的用量范围分别为:0.05U-0.5U/g淀粉;
步骤(3)中葡萄糖淀粉酶的用量范围为:0.1U-0.5U/g淀粉。
CN201510176751.3A 2015-04-14 2015-04-14 一种双酶提高γ‑环糊精专一性的方法 Active CN104726521B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510176751.3A CN104726521B (zh) 2015-04-14 2015-04-14 一种双酶提高γ‑环糊精专一性的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510176751.3A CN104726521B (zh) 2015-04-14 2015-04-14 一种双酶提高γ‑环糊精专一性的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104726521A CN104726521A (zh) 2015-06-24
CN104726521B true CN104726521B (zh) 2018-04-17

Family

ID=53450933

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510176751.3A Active CN104726521B (zh) 2015-04-14 2015-04-14 一种双酶提高γ‑环糊精专一性的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104726521B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107177647B (zh) * 2017-05-16 2019-11-26 江南大学 一种酶法处理麦芽糊精制备分支环糊精的方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101633900A (zh) * 2009-07-02 2010-01-27 江南大学 产大环糊精4-α-糖基转移酶的制备方法
CN103074399A (zh) * 2013-01-17 2013-05-01 江南大学 一种双酶复配生产γ-环糊精的生产工艺

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101633900A (zh) * 2009-07-02 2010-01-27 江南大学 产大环糊精4-α-糖基转移酶的制备方法
CN103074399A (zh) * 2013-01-17 2013-05-01 江南大学 一种双酶复配生产γ-环糊精的生产工艺

Also Published As

Publication number Publication date
CN104726521A (zh) 2015-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Miao et al. Microbial starch‐converting enzymes: Recent insights and perspectives
Park et al. Properties and applications of starch modifying enzymes for use in the baking industry
Dura et al. Physico-chemical properties of corn starch modified with cyclodextrin glycosyltransferase
Roussel et al. Characterization of substrate and product specificity of the purified recombinant glycogen branching enzyme of Rhodothermus obamensis
Sorndech et al. Synergistic amylomaltase and branching enzyme catalysis to suppress cassava starch digestibility
Lim et al. Comprehensive study on transglycosylation of CGTase from various sources
Wang et al. Enhanced production of γ-cyclodextrin by optimization of reaction of γ-cyclodextrin glycosyltransferase as well as synchronous use of isoamylase
Zhou et al. One-pot biosynthesis of high-concentration α-glucose 1-phosphate from starch by sequential addition of three hyperthermophilic enzymes
Zhong et al. Sequential maltogenic α-amylase and branching enzyme treatment to modify granular corn starch
Charoenlap et al. Optimization of cyclodextrin production from sago starch
Wang et al. Identification of an α-(1, 4)-glucan-synthesizing amylosucrase from Cellulomonas carboniz T26
Koh et al. Efficient biocatalytic production of cyclodextrins by combined action of amylosucrase and cyclodextrin glucanotransferase
Miao et al. Enzymatic approaches for structuring starch to improve functionality
CN108707634A (zh) 一种多酶偶联生产海藻糖的方法及其应用
Jaafar et al. Synergistic action of cyclodextrin glucanotransferase and maltogenic amylase improves the bioconversion of starch to malto-oligosaccharides
US8871473B2 (en) Method for producing γ-cyclodextrin by simultaneous use of γ-cyclodextrin glycosyltransferase and isoamylase
Li et al. Preparation of linear maltodextrins using a hyperthermophilic amylopullulanase with cyclodextrin-and starch-hydrolysing activities
Goh et al. The effects of reaction conditions on the production of γ-cyclodextrin from tapioca starch by using a novel recombinant engineered CGTase
Mondal et al. Microbial Amylase: Old but still at the forefront of all major industrial enzymes
Martins et al. Bacillus agaradhaerens LS-3C cyclodextrin glycosyltransferase: activity and stability features
CN104726521B (zh) 一种双酶提高γ‑环糊精专一性的方法
Ye et al. Expression and characterization of 1, 4-α-glucan branching enzyme from Microvirga sp. MC18 and its application in the preparation of slowly digestible starch
Chen et al. Research progresses on enzymatic modification of starch with 4-α-glucanotransferase
Te Poele et al. GtfC enzyme of Geobacillus sp. 12AMOR1 represents a novel thermostable type of GH70 4, 6-α-glucanotransferase that synthesizes a linear alternating (α1→ 6)/(α1→ 4) α-glucan and delays bread staling
Wang et al. Biochemical characterization and molecular mechanism of acid denaturation of a novel α-amylase from Aspergillus niger

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant