CN104721821A - 靶向稀土上转换金核壳纳米粒制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种靶向稀土上转换金核壳纳米粒制备方法。本发明提供一种靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的制备方法。具体涉及两部分内容即1)稀土上转换-金核壳纳米粒的合成;2)将这种稀土上转换-金核壳纳米粒同巯基乙酸以及靶向分子RGD多肽复合制备靶向稀土上转换-金核壳纳米制剂。相对于传统的肿瘤热疗相比,利用这种靶向稀土上转换-金核壳纳米粒进行肿瘤热疗具有诸多优势:可在短时间照射条件下,产生大量的热量,从而减少传统热疗治疗过程长的缺陷。组装得到的靶向稀土上转换-金核壳纳米粒具有结构稳定,粒径均一,光热转换效率高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种靶向稀土上转换金核壳纳米粒制备方法,属医药技术领域。
背景技术
肿瘤,特别是恶性肿瘤,是威胁人类健康乃至生命的最重要杀手之一。目前临床上常用的治疗手段包括手术切除、放疗、化疗。但上述方法也存在着一定的缺陷性,如手术切除将造成肢体残缺,放疗和化疗会因副作用导致对正常组织的杀伤,所有这些都将不可避免地降低患者的生存率和生存质量。临床上一直寻找一种既能有效杀伤肿瘤细胞,又能确保损伤小、毒副作用低的微创甚至无创治疗方法。现代肿瘤热疗技术是一种具有上述潜能的全新解决方法。
肿瘤热疗是指利用非电离辐射物理因子在生物组织中的热效应,即通过对肿瘤组织细胞加热升温而将其杀灭的技术方法。肿瘤热疗已成为继手术、放疗、化疗和免疫疗法之后的第五大疗法,是治疗肿瘤的一种新的有效手段。传统肿瘤热疗具体治疗过程是利用物理能量直接加热人体全身或局部,使肿瘤组织温度上升到有效治疗温度,并维持一定时间,利用正常组织和肿瘤细胞对温度耐受能力的差异,达到既能使肿瘤细胞凋亡、又不损伤正常组织的治疗目的。目前主要应用于对于放疗、化疗或手术后复发的晚期肿瘤病人进行单独热疗进行姑息治疗;另外对某些表浅肿瘤如乳腺癌、皮肤癌等也可以直接热疗。
但是,同手术、放疗和化疗三种传统治疗方法相比,肿瘤热疗大多数还处于辅助和次要的地位,究其原因重要是热疗过程中存在自身难以克服的缺陷,如1)加热设备无法实现精准加热;2)热量穿透深度浅等这些缺陷直接限制了热疗在临床上的进一步应用。
发明内容
鉴于纳米药剂在医学上的重要应用,本发明提供一种靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的制备方法。具体涉及两部分内容即1)稀土上转换-金核壳纳米粒的合成;2)将这种稀土上转换-金核壳纳米粒同巯基乙酸以及靶向分子RGD多肽(商品化试剂)复合制备靶向稀土上转换-金核壳纳米制剂。组装得到的靶向稀土上转换-金核壳纳米粒具有结构稳定,粒径均一,光热转换效率高等优点。目前尚未发现于此相关纳米粒文章及专利的报道。
本发明的靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的制备方法技术方案
一种靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的制备方法,步骤如下,如图2所示:
1)稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成:利用各种稀土盐以及氯金酸为原料,通过溶剂热-还原法联用制备出稀土上转换-金核壳纳米粒;
2)稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰:利用巯基乙酸,按照反相蒸发法,制备得到稀土上转换-金核壳纳米粒,接着在其表面进行靶向分子功能化修饰最终得到靶向稀土上转换-金核壳纳米粒。
具体说明如下:
稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成:
(1)按照质量比为氯化镱:氯化钇:氯化铒=(10~40):(10~60):1将原料加入到反应器中,然后向反应器中加入溶剂水使上述物质完全溶解;在磁力搅拌条件,加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体;
(2)水蒸干后,按照体积数比为油酸:十八烯=2~6:1将二者加入反应器中使白色固体完全溶解;
(3)冷却至40~60℃,按照质量数为NaOH:氟化铵=1~6:5将二者加入的反应器中,然后加入甲醇使NaOH:氟化铵完全溶解;调节温度升温到100~150℃,抽真空10~40min,通氩气;迅速升温到250~300℃,维持反应1~3小时;然后加入丙酮离心纯化,产物上转换纳米粒子真空干燥处理;使用的氟化铵与氯化铒的质量比=5:1;
(4)按上转换纳米粒子:氯金酸质量数比=1:(1~10)加入到反应器中,然后向反应器中加入溶剂水使上述物质完全分散,搅拌1~4小时;
(5)用氢氧化钠将溶液pH值调节到8~10,将羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中,其中羟基胺与上转换纳米粒子的质量份数比为1~5:1;
(6)反应1~4小时后,加入丙酮离心纯化,产物稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理;得到的稀土上转换-金核壳纳米粒颗粒。
稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰:
(1)按稀土上转换-金核壳纳米粒:巯基乙胺质量份数比=1:(50~200)将原料加入到反应器中,然后向反应器中加入溶剂水使上述物质分散;
(2)磁力搅拌条件下加热到30~50℃,反应1~3小时,反应完全后离心纯化,产物巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒,真空干燥处理;
(3)按照物质的质量份数比为靶向分子RGD多肽:巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒=1~20:50将原料加入到反应器中,然后向反应器中加入溶剂水使上述物质分散;
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐,其中EDC与巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒的质量比为1~3:50;
(5)在磁力搅拌条件下,反应1~3小时;反应完全后离心纯化,最终产物靶向稀土上转换-金核壳纳米粒。
本发明的有益效果:
1)本发明涉及的靶向稀土上转换-金核壳纳米制剂的主要优势包括:操作简便,适用性强,成本低,在水中具有较好的分散性,光热转化效率高。
2)本发明涉及的靶向稀土上转换-金核壳纳米制剂的主要性能指标包括:a)有效粒径在20~80nm之间,粒径更均匀,且可以根据制剂的组成成分,实验条件等进行调节;b)稳定性好,可在水溶液中保存至少2个月以上;c)表面含有大量靶向分子RGD多肽,易于制剂在肿瘤组织处聚集;制备得到表面靶向分子RGD的密度为:0.4~1.3mmol/g。
d)整个制备过程简单快捷,制备周期短,产率高,适合大批量生产。
本发明同传统的传统胶体金热疗制剂相比具有如下优势:
本发明涉及一种靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的制备方法,有助于解决上述热疗中无法解决的缺陷。这种制剂主要成分包括三方面:1)靶向分子RGD多肽修饰的高分子脂质体层;2)稀土上转换-金核壳纳米粒。其热疗的基本原理是:1)将制备好的靶向稀土上转换-金核壳纳米粒通过静脉注射或局部注射的方式给药;2)当制剂在靶向分子的作用下聚集到肿瘤部位后,在特定的部位用使用够穿透深部组织的近红外(波长980nm)激光直接照射靶部位;3)穿透深部组织的激光首先被上转换纳米核吸收,从而产生相应的可见光;4)可见光被金壳吸收产生热量,从而杀伤肿瘤。靶向稀土上转换-金核壳纳米粒在肿瘤热疗中应用机理图如图1所示。
相对于传统的肿瘤热疗相比,利用这种靶向稀土上转换-金核壳纳米粒进行肿瘤热疗具有诸多优势:
1)利用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒靶向聚集作用,能够实现在肿瘤部位的精准加热。
2)利用近红外(波长980nm)激光作为激发源,可穿透深部组织,有效实现对深部肿瘤组织的治疗。
3)光热转换效率高,可在短时间照射条件下,产生大量的热量,从而减少传统热疗治疗过程长的缺陷。
4)此外,靶向稀土上转换-金核壳纳米粒具有荧光成像功能,可实现热疗过程的可视化。
附图说明
图1:靶向稀土上转换-金核壳纳米粒在肿瘤热疗中应用机理图;
图2:靶向稀土上转换-金核壳纳米制剂制备方法流程示意图;
图3:按照实施例1合成的稀土上转换-金核壳纳米粒(左)和热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒(右)投射电子显微镜照片(形貌分析)。
图4:按照实施例1制备的热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的粒径分布图(尺寸分析)。
图5:热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒红外光谱谱图(结构分析)。
图6:热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒细胞毒性MTT实验结果(安全性分析)。
图7:热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒细胞内吞共聚焦照片(靶向性分析)。
图8:热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒光热治疗细胞抑制率结果。(肿瘤细胞杀伤效果分析)
本发明首先利用溶剂热-还原法联用制备稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu),如图3投射电镜测试结果显示,制备的上转换纳米粒(左图)粒径小于50nm,粒度分布均匀,制备的稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)(右图)粒径小于50nm,粒度分布均匀。接着利用反相蒸发法对制备的核壳纳米粒进行亲水性改性,如图4粒径分析表明,制备好的稀土上转换-金核壳纳米粒颗粒尺寸为112nm。如图5红外结构分析所示,制备好的稀土上转换-金核壳纳米粒表面包覆一层有机分子,且表面成功键联了靶向分子RGD多肽。如图6进行细胞毒性实验结果表明,制备的稀土上转换-金核壳纳米粒细胞毒性非常低。如图7进行细胞内吞实验结果表明,制备得到的靶向稀土上转换-金核壳纳米粒能够有效进入肿瘤细胞,在细胞内富集。如图8进行热疗杀伤效果实验后表明,靶向稀土上转换-金核壳纳米粒能够有效地通过光热杀伤肿瘤细胞,经30分钟照射后,80%的肿瘤细胞被杀死,有效抑制了肿瘤细胞的生长。
具体实施方式
下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述,但本发明不限于此。
实施例1:
1、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成:
(1)分别取40mg氯化镱、10mg氯化钇和1mg氯化铒,将上述三种物质加入到四毫升水中,在磁力搅拌条件,加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。
(2)水蒸干后,用移液管加入6mL油酸配体溶剂及1mL十八烯配体溶剂使白色固体完全溶解;
(3)冷却至60℃,加入6mgNaOH、5mg氟化铵,用五毫升甲醇溶解;调节温度升温到150℃,采用油泵抽真空40min,通氩气;迅速升温到270℃,维持反应3小时;结束后加入丙酮离心纯化,产物上转换纳米粒真空干燥处理。
(4)分别取10mg上转换纳米粒子、10mg氯金酸,将上述两种物质加入到4mL吐温80水溶液中(吐温浓度为2mg/mL),搅拌3小时。
(5)接着将溶液pH值调节到9,将50mg的羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中。
(6)反应3.5小时后,加入丙酮离心纯化,产物上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。组装的到的颗粒尺寸为:56nm。图3:按照实施例1合成的稀土上转换-金核壳纳米粒(左)和热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒(右)投射电子显微镜照片(形貌分析)。
2、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰:
(1)分别取10mg稀土上转换-金核壳纳米粒、500mg巯基乙胺,将上述两种原料加入十毫升水中完全溶解。
(2)磁力搅拌条件下加热到30℃,反应2小时。反应完全后离心纯化,基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。
(3)分别取10mg靶向分子RGD多肽(商品化)和50mg巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒,将上述两种原料加入五毫升水中。
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC,商品化)1mg。
(5)接着磁力搅拌条件下,反3小时。反应完全后离心纯化,最终产物真空干燥处理后保存。制备得到表面靶向分子RGD的密度为:0.8mmol/g。
实施例2:
1、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成:
(1)分别取10mg氯化镱、60mg氯化钇和1mg氯化铒,将上述三种物质加入到四毫升水中,在磁力搅拌条件,加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。
(2)水蒸干后,用移液管加入20mL油酸配体溶剂及10mL十八烯配体溶剂使白色固体溶解;
(3)冷却至40℃,加入20mgNaOH、5mg氟化铵,用五毫升甲醇溶解;调节温度升温到100℃,采用油泵抽真空10min,通氩气;迅速升温到250℃,维持反应2小时;结束后加入丙酮离心纯化,产物上转换纳米粒真空干燥处理。
(4)分别取5mg上转换纳米粒子、50mg氯金酸,将上述两种物质加入到四毫升吐温80水溶液中(吐温浓度为2mg/mL),搅拌1小时。
(5)接着将溶液pH值调节到10,将5mg的羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中。
(6)反应1小时后,加入丙酮离心纯化,产物稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。组装的到的颗粒尺寸为20nm。
2、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰:
(1)分别取10mg稀土上转换-金核壳纳米粒、2000mg巯基乙胺,将上述两种原料加入十毫升水中完全溶解。
(2)磁力搅拌条件下加热到42℃,反应3小时。反应完全后离心纯化,产物巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。
(3)分别取20mg靶向分子RGD多肽(商品化)和50mg巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒,将上述两种原料加入五毫升水中。
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC,商品化)3mg。
(5)接着磁力搅拌条件下,反应1小时。反应完全后离心纯化,最终产物真空干燥处理后保存。制备得到表面靶向分子RGD的密度为1.3mmol/g。
实施例3:
1、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成:
(1)分别取20mg氯化镱、40mg氯化钇和1mg氯化铒,将上述三种物质加入到四毫升水中,在磁力搅拌条件,加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。
(2)水蒸干后,用移液管加入20mL油酸配体溶剂及5mL十八烯配体溶剂使白色固体完全溶解;
(3)冷却至60℃,加入1mgNaOH、5mg氟化铵,用五毫升甲醇溶解;调节温度升温到150℃,采用油泵抽真空30min,通氩气;迅速升温到300℃,维持反应1小时;结束后加入丙酮离心纯化,产物真空上转换纳米粒子干燥处理。
(4)分别取5mg上转换纳米粒子、5mg氯金酸,将上述两种物质加入到四毫升吐温80水溶液中(吐温浓度为2mg/mL),搅拌4小时。
(5)接着将溶液pH值调节到8,将20mg的羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中。
(6)反应4小时后,加入丙酮离心纯化,产物稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。组装得到的稀土上转换-金核壳纳米粒颗粒尺寸为80nm。
2、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰:
(1)分别取10mg稀土上转换-金核壳纳米粒、1000mg巯基乙胺,将上述两种原料加入十毫升水中完全溶解。
(2)接着磁力搅拌条件下加热到50℃,反应1小时。反应完全后离心纯化,产物巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。
(3)分别取2mg靶向分子RGD多肽(商品化)和50mg巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒,将上述两种原料加入五毫升水中。
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC,商品化)2mg。
(5)接着磁力搅拌条件下,反应2小时。反应完全后离心纯化,产物靶向稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理后保存。制备得到表面靶向分子RGD的密度为:0.4mmol/g。
实施例4:
1、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成:
(1)分别取50mg氯化镱、60mg氯化钇和2mg氯化铒,将上述三种物质加入到四毫升水中,在磁力搅拌条件,加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。
(2)水蒸干后,用移液管加入20mL油酸配体溶剂及10mL十八烯配体溶剂使白色固体完全溶解;
(3)冷却至45℃,加入10mgNaOH、10mg氟化铵,用五毫升甲醇溶解;调节温度升温到120℃,采用油泵抽真空30min,通氩气;迅速升温到280℃,维持反应1.5小时;结束后加入丙酮离心纯化,产物真空上转换纳米粒子干燥处理。
(4)分别取6mg上转换纳米粒子、9mg氯金酸,将上述两种物质加入到四毫升吐温80水溶液中(吐温浓度为2mg/mL),搅拌2小时。
(5)接着将溶液pH值调节到8.5,将12mg的羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中。
(6)反应2小时后,加入丙酮离心纯化,产物稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。组装得到的稀土上转换-金核壳纳米粒颗粒尺寸为70nm。
2、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰:
(1)分别取5mg稀土上转换-金核壳纳米粒、500mg巯基乙胺,将上述两种原料加入十毫升水中完全溶解。
(2)接着磁力搅拌条件下加热到45℃,反应2.5小时。反应完全后离心纯化,产物巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。
(3)分别取10mg靶向分子RGD多肽(商品化)和50mg巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒,将上述两种原料加入五毫升水中。
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC,商品化)2.5mg。
(5)接着磁力搅拌条件下,反应2.5小时。反应完全后离心纯化,产物靶向稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理后保存。制备得到表面靶向分子RGD的密度为:1mmol/g。
实施例5:
1、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成:
(1)分别取10mg氯化镱、10mg氯化钇和0.5mg氯化铒,将上述三种物质加入到四毫升水中,在磁力搅拌条件,加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。
(2)水蒸干后,用移液管加入24mL油酸配体溶剂及6mL十八烯配体溶剂使白色固体完全溶解;
(3)冷却至50℃,加入3mgNaOH、2.5mg氟化铵,用五毫升甲醇溶解;调节温度升温到100℃,采用油泵抽真空35min,通氩气;迅速升温到260℃,维持反应2小时;结束后加入丙酮离心纯化,产物真空上转换纳米粒子干燥处理。
(4)分别取8mg上转换纳米粒子、16mg氯金酸,将上述两种物质加入到四毫升吐温80水溶液中(吐温浓度为2mg/mL),搅拌2小时。
(5)接着将溶液pH值调节到9,将16mg的羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中。
(6)反应3小时后,加入丙酮离心纯化,产物稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。组装得到的稀土上转换-金核壳纳米粒颗粒尺寸为65nm。
2、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰:
(1)分别取5mg稀土上转换-金核壳纳米粒、300mg巯基乙胺,将上述两种原料加入十毫升水中完全溶解。
(2)接着磁力搅拌条件下加热到45℃,反应2.5小时。反应完全后离心纯化,产物巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。
(3)分别取15mg靶向分子RGD多肽(商品化)和50mg巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒,将上述两种原料加入五毫升水中。
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC,商品化)2mg。
(5)接着磁力搅拌条件下,反应2小时。反应完全后离心纯化,产物靶向稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理后保存。制备得到表面靶向分子RGD的密度为:0.8mmol/g。
实施例6:
1、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的合成:
(1)分别取25mg氯化镱、40mg氯化钇和1mg氯化铒,将上述三种物质加入到四毫升水中,在磁力搅拌条件,加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体。
(2)水蒸干后,用移液管加入18mL油酸配体溶剂及6mL十八烯配体溶剂使白色固体完全溶解;
(3)冷却至55℃,加入4mgNaOH、5mg氟化铵,用五毫升甲醇溶解;调节温度升温到130℃,采用油泵抽真空20min,通氩气;迅速升温到260℃,维持反应2小时;结束后加入丙酮离心纯化,产物真空上转换纳米粒子干燥处理。
(4)分别取5mg上转换纳米粒子、25mg氯金酸,将上述两种物质加入到四毫升吐温80水溶液中(吐温浓度为2mg/mL),搅拌2小时。
(5)接着将溶液pH值调节到9,将10mg的羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中。
(6)反应2小时后,加入丙酮离心纯化,产物稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。组装得到的稀土上转换-金核壳纳米粒颗粒尺寸为60nm。
2、稀土上转换-金核壳纳米粒(UCNAu)的表面修饰:
(1)分别取3mg稀土上转换-金核壳纳米粒、360mg巯基乙胺,将上述两种原料加入十毫升水中完全溶解。
(2)接着磁力搅拌条件下加热到45℃,反应1.5小时。反应完全后离心纯化,产物巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理。
(3)分别取20mg靶向分子RGD多肽(商品化)和100mg巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒,将上述两种原料加入五毫升水中。
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC,商品化)4mg。
(5)接着磁力搅拌条件下,反应1.5小时。反应完全后离心纯化,产物靶向稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理后保存。制备得到表面靶向分子RGD的密度为:0.9mmol/g。
形态观察、粒径及其分布测定:
取样品溶液经超速离心分离后,取出沉淀物,加蒸馏水少量使分散,滴于碳支持膜上制样,在透射电镜下观察其形貌状态并拍照。透射电镜下观察到靶向稀土上转换-金核壳纳米制剂颗粒呈均匀规则的球形粒子。实验测得的靶向稀土上转换-金核壳纳米制剂粒径分布均匀,在20—80nm范围内可控。
MTT法测试热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的细胞毒性:
1)取处于对数生长期的小鼠成纤维细胞,0.125%胰蛋白酶消化后充分吹打成单细胞悬液,计数后调整细胞浓度为5×104/m1。
2)向96孔板的每孔中加入100μl细胞悬液,在37℃,5%CO2培养箱中培养24h。
3)将120μl含有一定浓度的热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒溶液加入到新鲜培养基中,并在37℃,5%CO2培养箱中通细胞共培养24h。
4)24h后取出培养板,向每个孔中加入10μl MTT溶液,在37℃,5%CO2培养箱中继续培养4h后,小心吸取培养孔中的培养基,向每个孔中加入200μl DMSO(二甲基亚砜)溶液,在摇床上摇动20min,使DMSO溶液充分地溶解Formazan晶体。
5)用酶联免疫检测仪在570nm波长处,以空白管调零,测定各孔的吸光值A,按下式计算细胞存活率。每组设8个平行,计算其平均值。
细胞存活率(%)=实验细胞组吸光值(A2)/空白细胞组吸光值(A1)*100%
图6:热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒细胞毒性MTT实验结果(安全性分析)。热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒的体外热疗效果实验:
1)取处于对数生长期的Hela细胞,0.125%胰蛋白酶消化后充分吹打成单细胞悬液,计数后调整细胞浓度为5×104/m1。
2)向96孔板的每孔中加入100μl细胞悬液,在37℃,5%CO2培养箱中培养24h。
3)将120μl含有一定浓度的聚马来酸酐-磷脂酰乙醇胺接枝聚合物纳米光敏制剂溶液加入到新鲜培养基中,并在37℃,5%CO2培养箱中通细胞共培养3h。
4)3h后取出培养板,向96孔板中加入等量新鲜培养基。
5)用980nm近红外激光器连续激光器,在2M条件下,照射细胞10分钟。
6)接着向每个孔中加入10μlMTT溶液,在37℃,5%CO2培养箱中继续培养4h后,小心吸取培养孔中的培养基,向每个孔中加入200μl DMSO(二甲基亚砜)溶液,在摇床上摇动20min,使DMSO溶液充分地溶解Formazan晶体。
6)用酶联免疫检测仪在570nm波长处,以空白管调零,测定各孔的吸光值A,按下式计算细胞存活率。每组设8个平行,计算其平均值。
细胞抑制率(%)=100%-细胞存活率
=100%-[实验细胞组吸光值(A2)/空白细胞组吸光值(A1)*100%]
图7:热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒细胞内吞共聚焦照片(靶向性分析)。图8:热疗用靶向稀土上转换-金核壳纳米粒光热治疗细胞抑制率结果。(肿瘤细胞杀伤效果分析)
Claims (3)
1.一种靶向稀土上转换金核壳光控纳米粒的制备方法,其特征是步骤如下:
1)利用各种稀土盐以及氯金酸为原料,通过溶剂热-还原法联用制备出稀土上转换-金核壳纳米粒;
2)利用巯基乙酸,按照反相蒸发法,制备得到稀土上转换-金核壳纳米粒,接着在其表面进行靶向分子功能化修饰最终得到靶向稀土上转换-金核壳纳米粒。
2.如权利要求1所述的方法,其特征是所述步骤1)方法如下:
(1)按照质量比为氯化镱:氯化钇:氯化铒=(10~40):(10~60):1将原料加入到反应器中,然后向反应器中加入溶剂水使上述物质完全溶解;在磁力搅拌条件,加热至沸腾直至稀土盐溶液变成白色固体;
(2)水蒸干后,按照体积数比为油酸:十八烯=2~6:1将二者加入反应器中使白色固体完全溶解;
(3)冷却至40~60℃,按照质量数为NaOH:氟化铵=1~6:5将二者加入的反应器中,然后加入甲醇使NaOH:氟化铵完全溶解;调节温度升温到100~150℃,抽真空10~40min,通氩气;迅速升温到250~300℃,维持反应1~3小时;然后加入丙酮离心纯化,产物上转换纳米粒子真空干燥处理;使用的氟化铵与氯化铒的质量比=5:1;
(4)按上转换纳米粒子:氯金酸质量数比=1:(1~10)加入到反应器中,然后向反应器中加入溶剂水使上述物质完全分散,搅拌1~4小时;
(5)用氢氧化钠将溶液pH值调节到8~10,将羟基胺作为还原剂加入到上述溶液中,其中羟基胺与上转换纳米粒子的质量份数比为1~5:1;
(6)反应1~4小时后,加入丙酮离心纯化,产物稀土上转换-金核壳纳米粒真空干燥处理;得到的稀土上转换-金核壳纳米粒颗粒。
3.如权利要求1所述的方法,其特征是所述步骤2)方法如下:
(1)按稀土上转换-金核壳纳米粒:巯基乙胺质量份数比=1:(50~200)将原料加入到反应器中,然后向反应器中加入溶剂水使上述物质分散;
(2)磁力搅拌条件下加热到30~50℃,反应1~3小时,反应完全后离心纯化,产物巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒,真空干燥处理;
(3)按照物质的质量份数比为靶向分子RGD多肽:巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒=1~20:50将原料加入到反应器中,然后向反应器中加入溶剂水使上述物质分散;
(4)接着加入偶联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐,其中EDC与巯基乙胺保护的稀土上转换-金核壳纳米粒的质量比为1~3:50;
(5)在磁力搅拌条件下,反应1~3小时;反应完全后离心纯化,最终产物靶向稀土上转换-金核壳纳米粒。
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