CN104711271B - 一种人工合成的脂肪酸去饱和酶编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人工合成的脂肪酸去饱和酶编码基因及其应用。本发明所提供的基因具体为如下a）‑d）中任一：a）编码序列为序列1的第932‑2131位所示的核酸分子；b）序列1的第932‑2131位所示的核酸分子；c）在严格条件下与a）或b）限定的核酸分子杂交，且与序列1的第932‑2131位所示核酸分子编码具有相同氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；d）与a）或b）或c）限定的核酸分子具有90%以上同源性，且与序列1的第932‑2131位所示核酸分子编码具有相同氨基酸序列的蛋白质的核酸分子。实验证明，在猪胎儿成纤维细胞中，本发明的优化的线虫FAT‑1脂肪酸去饱和酶基因与野生型的线虫FAT‑1脂肪酸去饱和酶基因相比，具有更强的将omega‑6脂肪酸转化为omega‑3脂肪酸的能力，可显著降低ω‑6/ω‑3比值。

Description

一种人工合成的脂肪酸去饱和酶编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种人工合成的脂肪酸去饱和酶编码基因及其应用，特别涉及一种人工合成的脂肪酸去饱和酶基因及其将脂肪酸Omega-6转化为Omega-3中的应用。

背景技术

Omega-3多不饱和脂肪酸对人类健康有诸多益处，这一点已经被公众广泛接受，因此这些脂肪酸的需求逐年增长。

中国为猪肉生产和消费大国，根据中国健康与营养调查得到的数据，在中国人的肉类消费中，猪肉一项便占了70%以上。猪油中的8种主要脂肪酸是豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生酸。其中不饱和脂肪酸占58%，不饱和脂肪酸中尤其是Omega-6、Omega-3对人体健康尤其有益。但是猪肉牛肉等人们摄入量最大的肉类中Omega-6/Omega-3比值较高，约为10～20，人工饲养的更甚。这些营养成分的不足和不平衡，不仅在发育阶段还在整个生命过程中对大脑功能产生影响。例如，神经认知障碍，如注意力缺陷多动显示顺序（ADHD），阅读障碍，运动障碍和自闭症疾病往往相对缺乏ω-3。但由于长期的饮食习惯以及猪肉特殊的口感，我们对猪肉的热爱又是如此不可替代。

ω-3脂肪酸常见于海洋生物油脂和植物油脂，为人体必需脂肪酸的重要组成，由于人类等哺乳动物缺乏ω-3脂肪酸合成酶，导致n-3PUFA合成量远远不足，只能从食物中获取。近几年大量关于海洋动物体内存在着有害物质的富集以及个人饮食偏好等原因，海洋生物油脂虽然含有丰富的ω-3脂肪酸，但是仅仅占据人类膳食结构金字塔的冰山一角。

改善猪油脂肪酸Omega-6/Omega-3比例关系，让人们餐桌上出现既美味又健康的猪肉食品，满足现代化人对美味和健康的要求，是亟待解决的问题。到目前唯一可行的方法来增加肉食动物中的omega-3的含量是通过喂养添加omega-3脂肪酸饲料（比如喂养亚麻籽、鱼粉或其它的海产品），但这是不可持续的，因为不仅昂贵、耗时且海产品来源的有限性及生物富集引起的潜在污染性仍然令人担忧。线虫（Caenorhabditis elegans）fat-1基因编码的ω-3PUFA脱氢酶，对生物体中16～20碳的ω-6PUFAs进行脱氢反应，生成相应的ω-3PUFA，Spychalla、kang、Lai等通过制备转基因拟南芥，转基因小鼠和转基因猪验证了其功能，而与其同种不同属的线虫（Caenorhabditis briggsae）fat-1基因功能报道较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工合成的脂肪酸去饱和酶编码基因及其应用。

本发明所提供的人工合成的脂肪酸去饱和酶编码基因为经过优化的基因，即将野生型线虫（Caenorhabditis briggsae）FAT-1脂肪酸去饱和酶基因序列转变成哺乳动物偏好（高频使用）的密码子优化序列。将该基因命名为hsfat-1基因，具体可为如下a）-d）中任一：

a）编码序列为序列表中序列1的第932-2131位所示的核酸分子；

b）序列表中序列1的第932-2131位所示的核酸分子；

c）在严格条件下与a）或b）限定的核酸分子杂交，且与序列表中序列1的第932-2131位所示核酸分子编码具有相同氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；

d）与a）或b）或c）限定的核酸分子具有90%以上同源性，且与序列表中序列1的第932-2131位所示核酸分子编码具有相同氨基酸序列的蛋白质的核酸分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

含有所述核酸分子（hsfat-1基因）的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因细胞进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可发光化合物的基因（GFP基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）等。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述核酸分子转录的启动子具体为CMV启动子。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体为将所述核酸分子插入到质粒pcDNA3.1（+）的多克隆位点（如Hind III和EcoR I）处得到的重组质粒。

为了增强所述核酸分子的后续转录和翻译，在构建所述重组表达载体时可在所述核酸分子之前引入Kozak序列。

更为具体的，所述重组表达载体的核酸序列如序列表中序列1所示。其中，第917-931位为所述Kozak序列，第932-2131位为所述核酸分子（hsfat-1基因）的编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质（线虫FAT-1脂肪酸去饱和酶）。

所述表达盒由能够启动所述hsfat-1基因表达的启动子，所述hsfat-1基因，以及转录终止序列组成。

所述转基因细胞系为将所述重组载体导入受体细胞得到的稳定表达的重组细胞系。

在本发明中，所述受体细胞具体为离体的猪胎儿成纤维细胞（porcine embryonicfibroblast，PEF）。

所述核酸分子（hsfat-1基因），或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，在将omega-6脂肪酸转化为omega-3脂肪酸中的应用也属于本发明的保护范围。

在本发明中，所述omega-6脂肪酸具体为如下中的至少一个：花生四烯酸（Arachidonic Acid，AA，20:4(n-6)）、亚油酸（Linoleic acid，LA，18：2(n-6)）、顺，顺，顺-8，11，14-二十碳三烯酸（cis,cis,cis-8,11,14-Eicosatrienoic acid，DGLA，20：3(n-6)）。所述omega-3脂肪酸具体为如下中的至少一个：顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic Acid，EPA，20:5(n-3)）和顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA，22:6(n-3)）。

所述核酸分子，或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，在脂肪酸去饱和中的应用也属于本发明的保护范围。

实验证明，在猪胎儿成纤维细胞中，本发明所提供的优化的线虫（Caenorhabditisbriggsae）FAT-1脂肪酸去饱和酶编码基因（hsfat-1基因，序列1的第932-2131位）与Spychalla等发现的野生型线虫fat-1（Caenorhabditis elegans）相比，具有更强的将omega-6脂肪酸转化为omega-3脂肪酸的能力，可显著降低ω-6/ω-3比值。

附图说明

图1为重组表达载体pcDNA3.1(+)-hsfat-1的酶切鉴定及质粒图谱。其中，A为HindIII和EcoR I双酶切鉴定结果，泳道M为DNA标准分子，泳道1为pcDNA3.1(+)-hsfat-1的HindIII和EcoR I双酶切鉴定结果；B为重组表达载体pcDNA3.1(+)-hsfat-1的质粒图谱；C为pcDNA3.1(+)-cgfat-1的质粒图谱。D为cgfat-1基因的PCR扩增结果，泳道M为DNA标准分子，泳道1为cgfat-1基因的PCR扩增结果。

图2为稳定表达细胞单克隆形态（转hsfat-1基因）。其中，A为G418压力筛选9天时的形态；B为G418压力筛选14天时的形态。

图3为hsfat-1，cgfat-1基因稳定表达细胞系的PCR检测结果。其中，A为hsfat-1基因稳定表达细胞系的PCR检测结果，泳道M为DNA标准分子，泳道1-21为21个hsfat-1基因稳定表达细胞克隆的PCR鉴定结果（扩增出大小为165bp目的条带的为阳性结果）。B为cgfat-1基因稳定表达细胞系的PCR检测结果，泳道M为DNA标准分子，泳道1-13为13个cgfat-1基因稳定表达细胞克隆的PCR鉴定结果（扩增出大小为193bp目的条带的为阳性结果）。

图4为hsfat-1，cgfat-1基因稳定表达细胞系的总RNA提取结果。其中，泳道M为标准分子，泳道1-6为部分hsfat-1基因稳定表达细胞系的总RNA提取结果；泳道7-11为部分cgfat-1基因稳定表达细胞系的总RNA提取结果。

图5为hsfat-1，cgfat-1基因稳定表达细胞系的RT-PCR检测结果。其中，泳道M为标准分子，泳道1-10为10个hsfat-1基因或cgfat-1基因稳定表达细胞系的RT-PCR检测结果。

图6为各组细胞中脂肪酸甲酯的GC-MS测定结果。其中，A为空白对照组（未做任何处理的PEF细胞，CK2）；B为实验组（RT-PCR鉴定为阳性的hsfat-1基因稳定表达细胞系）；C为阴性对照组（pcDNA3.1(+)空载体阳性克隆，CK1）；D为阳性对照组（RT-PCR鉴定为阳性的C.elegants fat-1基因稳定表达细胞系）；E为脂肪酸甲酯标准品（上样浓度为0.8mg/mL）；所有样品上样量均为20μl；A-E中，纵坐标均表示峰高，横坐标均表示保留时间；峰9均表示亚油酸（Linoleic acid，LA，18：2(n-6)）甲酯，峰11均表示顺，顺，顺-8，11，14-二十碳三烯酸（cis,cis,cis-8,11,14-Eicosatrienoic acid，DGLA，20：3(n-6)）甲酯，峰12均表示花生四烯酸（Arachidonic Acid，AA，20:4(n-6)）甲酯，峰13均表示顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic Acid，EPA，20:5(n-3)）甲酯，峰17均表示顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA，22:6(n-3)）甲酯；E中各峰所示脂肪酸甲酯同产品说明书，其中峰19、27、30、33、36依次对应上述5种脂肪酸甲酯。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pcDNA3.1(+)质粒：invitrogen公司（Catalog Number：V790-20）；

大肠杆菌DH5α：北京全式金生物技术有限公司（目录号:CD201-01）。

G418：invitrogen公司（Catalog Number：11811-023）；

Hind III：NEB公司，R0104S；EcoR I：NEB公司，R0101S；Sca I：NEB公司，R0122V；

猪胎儿成纤维细胞（porcine embryonic fibroblast，PEF）：取本实验室猪场37胎龄胚胎，去除胎儿的头、尾、四肢、内脏和骨头，并将血液清理干净。用弯头眼科剪持续剪切胎儿30min保证充分剪碎，将剪碎的胎儿组织用剪头的蓝枪头吸取到15mL离心管中，加入5mL全培养基，自然沉降数分钟后除去上面溶液，并在下层组织块中加入几滴FBS，用尖端1cm处弯曲的15cm玻璃巴氏管吸出，平铺于两个T75培养瓶中，瓶底朝上放置，并在对侧加入15mL全培养液，于6-8h后小心翻转培养瓶，将组织块浸入培养液中，每两天换一次液，待细胞长满T75培养瓶后冻存备用。

裂解液（1×）：tris-HCl40mM，triton-1000.9%（体积含量），nonidetp400.9%（体积含量），蛋白酶K0.4mg/ml；

全培养基（20%FBS）：79%（体积分数）DMEM培养基（gibco，11995-081），20%（体积分数）胎牛血清（gibco，10099-141），1%（体积分数）双抗（gibco，15140-122）

RNA提取试剂盒：BioTeke公司，RP1202；RT-PCR反转录试剂盒：Fermentas公司，K1621；

花生四烯酸（AA，20:4(n-6)）：sigma公司，Catalog Number：A3555。

脂肪酸甲酯标准品：sigma公司，Catalog Number：47885-U。该产品中共含有36种脂肪酸甲酯标准品，包含本发明涉及到的如下5种脂肪酸对应的的脂肪酸甲酯标准品：亚油酸（Linoleic acid，LA，18：2(n-6)），顺，顺，顺-8，11，14-二十碳三烯酸（cis,cis,cis-8,11,14-Eicosatrienoic acid，DGLA，20：3(n-6)），花生四烯酸（ArachidonicAcid，AA，20:4(n-6)），顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic Acid，EPA，20:5(n-3)），顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA，22:6(n-3)。

核转染试剂盒：Lonza，Catalog Number：VPI-1002。

核转仪：Amaxa公司I Device（Catalog Number：AAD-1001）。

实施例1、线虫FAT-1脂肪酸去饱和酶基因的密码子优化及全基因合成

根据野生型线虫（Caenorhabditis briggsae）FAT-1脂肪酸去饱和酶基因—cbrfat-1的CDS全序列（如序列表中序列3所示），经过设计和反复验证得到适合于在哺乳动物细胞中表达的优化型FAT-1脂肪酸去饱和酶基因序列，即将野生型线虫（Caenorhabditisbriggsae）FAT-1脂肪酸去饱和酶基因序列转变成哺乳动物偏好（高频使用）的密码子优化序列，从而提高线虫FAT-1脂肪酸去饱和酶在哺乳动物细胞培养环境中的表达水平。

根据上述方法，最终获得按哺乳动物密码子偏好设计的优化型线虫FAT-1脂肪酸去饱和酶编码基因，命名为hsfat-1基因，其基因序列为序列表中序列1的第932-2131位。所述hsfat-1基因编码的蛋白为序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白（即线虫（Caenorhabditis briggsae）FAT-1脂肪酸去饱和酶）。

为了满足构建重组表达载体时将所述hsfat-1基因正确插入相应酶切位点的需要，在所述hsfat-1基因两端分别引入Hind III和EcoR I酶切位点识别序列；为了有效增强所述hsfat-1基因的转录和翻译，在所述hsfat-1基因前又引入了Kozak序列。最终人工合成序列表中序列1的第911-2137位所示的DNA片段，其中，第911-916位为HindIII的识别序列，第917-931位为所述Kozak序列，第932-2131为所述hsfat-1基因序列，第2132-2137位为EcoR I的识别序列。

实施例2、hsfat-1，cgfat-1基因哺乳动物稳定表达细胞系的构建

一、重组表达载体pcDNA3.1(+)-hsfat-1，pcDNA3.1(+)-cgfat-1的构建

1、重组表达载体pcDNA3.1(+)-hsfat-1的构建

将实施例1人工合成的DNA片段（序列1的第911-2137位）用限制性内切酶HindIII和EcoR I进行双酶切，与经过同样双酶切的质粒pcDNA3.1(+)骨架大片段相连，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。获得若干个单菌落，接种到含相应抗生素（Amp⁺）的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，提取质粒，并用内切酶Hind III和EcoR I对重组质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图1中A所示，得到大小约为5400bp和1200bp的两个条带，与预期结果相符，进一步经酶切鉴定后的重组质粒送公司测序，将测序证实含有序列表中序列1的第911-2137位所示DNA片段的重组质粒命名为pcDNA3.1(+)-hsfat-1（质粒图谱如图1中B所示）。整个重组表达载体pcDNA3.1(+)-hsfat-1的核苷酸序列为序列表中序列1。在重组表达载体pcDNA3.1(+)-hsfat-1中，启动hsfat-1基因转录的启动子为CMV启动子。

2、重组表达载体pcDNA3.1(+)-cgfat-1的构建

以线虫（C.elegants）cDNA为模板，利用引物Cgfat-1-F和Cgfat-1-R（引物Cgfat-1-F的5'端加入Nhe I酶切位点及Kozak序列，为序列4的第895-934位，引物Cgfat-1-R的5'端加入EcoR I酶切位点，为序列4的第2324-2349位的反向互补序列，见表1）扩增cgfat-1基因（如图1中D所示）。扩增产物经Nhe I、EcoR I双酶切后连入经过同样双酶切的质粒pcDNA3.1(+)骨架大片段，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。获得若干个单菌落，接种到含相应抗生素（Amp⁺）的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，提取质粒，重组质粒送公司测序，将测序证实含有序列表中序列4的第895-2349位所示DNA片段的重组质粒命名为pcDNA3.1(+)-cgfat-1（质粒图谱如图1中C所示）。整个重组表达载体pcDNA3.1(+)-cgfat-1的核苷酸序列为序列表中序列4。在重组表达载体pcDNA3.1(+)-cgfat-1中，启动cgfat-1基因转录的启动子为CMV启动子。

二、hsfat-1，cgfat-1基因稳定表达细胞系的构建及鉴定

1、hsfat-1，cgfat-1基因稳定表达细胞系的构建

用限制性内切酶Sca I分别酶切实施例1步骤一中的重组表达载体pcDNA3.1(+)-hsfat-1，pcDNA3.1(+)-cgfat-1，使之线性化。采用电转的方法将5μg线性化的pcDNA3.1(+)-hsfat-1，pcDNA3.1(+)-cgfat-1载体分别转染G1代（原代细胞传代后地第一代细胞称为G1代细胞）的PEF细胞（约1×10⁶个），电转严格按照试剂盒和核转仪说明书操作，选用T-016程序。电转后，在终浓度为800μg/ml的G418压力下筛选4天，之后用终浓度为600μg/ml的G418维持培养12天，直至长出细胞单克隆。最终分别获得转入重组表达载体pcDNA3.1(+)-hsfat-1的细胞单克隆，以及转入重组表达载体pcDNA3.1(+)-cgfat-1的细胞单克隆。

2、hsfat-1，cgfat-1基因稳定表达细胞系的鉴定

分别挑取步骤1得到的两种单克隆细胞（图2），每种单克隆细胞均取部分提取基因组分别作为模板，采用PCR方法及PCR产物测序的方法对各单克隆细胞进行初步鉴定。其中，细胞基因组提取方法如下：40μl裂解液（1×）裂解约0.5×10⁵个细胞，充分震荡混匀后1000rpm离心10min，收集上清即为基因组。对于转入重组表达载体pcDNA3.1(+)-hsfat-1的细胞单克隆，PCR检测hsfat-1基因的引物为如下表1中的HS-F（序列1的第1800-1819位）和HS-FR（序列1的第1943-1964位的反向互补序列）；对于转入重组表达载体pcDNA3.1(+)-cgfat-1的细胞单克隆，检测cgfat-1基因的引物为如下表1中的CG-F（序列4的第2320-2343位）和CG-R（序列4的第2489-2512位的反向互补序列）；反应程序为：预变性95℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃20s，循环33次；72℃5min再延伸后检测。

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测（图3），将以转入重组表达载体pcDNA3.1(+)-hsfat-1的细胞单克隆基因组DNA为模板，扩增得到的大小为165bp目的条带对应的PCR产物，以及以转入重组表达载体pcDNA3.1(+)-cgfat-1的细胞单克隆基因组DNA为模板，扩增得到的大小为193bp目的条带对应的PCR产物进行序列测定。经测序表明PCR产物为序列表中序列1的第1800-1964位所示的PCR扩增对应的单克隆细胞为转入重组表达载体pcDNA3.1(+)-hsfat-1的阳性细胞克隆；经测序表明PCR产物为序列表中序列4的第2320-2512位所示的PCR扩增对应的单克隆细胞为转入重组表达载体pcDNA3.1(+)-cgfat-1的阳性细胞克隆。

进一步，将上述PCR鉴定为阳性的单克隆细胞系，利用RNA提取试剂盒提取总RNA（图4）。利用RT-PCR反转录试剂盒按照试剂盒说明书进行RT-PCR反应。检测hsfat-1基因所用引物为表1中的HS-F和HS-FR；检测cgfat-1基因所用引物为表1中的CG-F和CG-R；内参基因为GAPDH，所用引物为表1中的susGAPDH-F和susGAPDH-R。反转录严格按照反转录试剂盒说明书操作，RT-PCR程序为：预变性95℃3min，94℃30s，58℃30s，72℃20s，循环33次72℃5min再延伸。

RT-PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测（图5）。扩增得到大小为165bp目的条带的扩增产物对应的转入重组表达载体pcDNA3.1(+)-hsfat-1的单克隆细胞进一步确定为阳性克隆，每一个阳性克隆即为一个hsfat-1基因稳定表达细胞克隆；扩增得到大小为193bp目的条带的扩增产物对应的转入重组表达载体pcDNA3.1(+)-cgfat-1的单克隆细胞进一步确定为阳性克隆，每一个阳性克隆即为一个cgfat-1基因稳定表达细胞克隆。

同时设置向G1代PEF细胞中转入pcDNA3.1(+)空载体，获得G418抗性克隆（阳性克隆）的对照（CK1）。

表1PCR和RT-PCR检测阳性克隆引物

实施例3、hsfat-1，cg-fat-1基因哺乳动物稳定表达细胞系脂肪酸提取及测定

从实施例2中构建得到的hsfat-1基因哺乳动物稳定表达细胞系（实验组），cg-fat-1基因哺乳动物稳定表达细胞系（阳性对照组，WT）和pcDNA3.1(+)空载体阳性克隆（阴性对照组，CK1）中随机各选取5个，分别接种于含有4ml细胞培养液的60mm培养皿（约4×10⁵细胞/皿）中待细胞融合度到90%时，用0.1%胰酶消化传代到100mm培养皿内继续培养以扩大细胞量，添加终浓度为100μM的花生四烯酸，培养48h至细胞融合度达100%，提取脂肪酸，将脂肪酸进行甲酯化反应后，通过GC-MS方法测得脂肪酸甲酯含量，脂肪酸甲酯的含量即反应细胞系中表达的相应脂肪酸的含量。同时设置未经过G418筛选的PEF细胞做空细胞对照（空白对照组，CK2）。实验设置3次重复，结果以MEAN±SD表示。

其中，脂肪酸提取及甲酯化方法如下：

去除培养皿中的培养液，PBS洗涤3次后，加入2ml浓度为2.5%的硫酸甲醇液（硫酸和甲醇按体积比2.5:100配制），80℃放置90min进行甲酯化反应，之后加入1.5ml生理盐水和1ml正己烷，用力震摇2-3分钟。2500rpm离心5分钟，吸取上清正己烷层，即为脂肪酸甲酯提取液，氮吹仪吹干，定容至20μl以用于GC-MS测定。

GC-MS法测定脂肪酸甲酯含量的方法如下：

所用色谱柱为HP-88（100m×0.25mm×0.20μm）；测定参数为：柱流速1.0mL/min；进样口温度：220℃；进样方式：分流1：1；升温程序：60℃保持1min，以40℃/min升至140℃，再以4℃/min升至240℃保持15min；离子源类型：EI；离子源温度：200℃；传输线温度：240℃；溶剂切除时间：10.5min；电子倍增器能量：70eV；采集方式：SCAN（全扫描）；m/z：50～500。

所测脂肪酸甲酯对应的脂肪酸如下：亚油酸（Linoleic acid，LA，18：2(n-6)、顺，顺，顺-8，11，14-二十碳三烯酸（DGLA，20：3(n-6)）、花生四烯酸（Arachidonic Acid，AA，20:4(n-6)）、顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic Acid，EPA，20:5(n-3)）和顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA，22:6(n-3)）。对于某一脂肪酸甲酯的含量，通过将待测样品与标准品对照，做比值换算，即待测样品中A物质实际浓度=待测样品中A物质峰面积×标准品中A物质浓度（mg/mL）/标准品中A物质峰面积。峰面积对应各组分含量，保留时间对应不同脂肪酸甲酯组分。其中，花生四烯酸（AA，20:4(n-6)）甲酯标准品、亚油酸（LA，18：2(n-6)）甲酯标准品、顺，顺，顺-8，11，14-二十碳三烯酸（DGLA，20：3(n-6)）标准品、顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸（EPA，20:5(n-3)）甲酯标准品，以及顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸（DHA，22:6(n-3)）甲酯标准品等存在于sigma公司产品目录号为47885-U的脂肪酸甲酯标准品中。标准品的浓度为0.8mg/mL，上样量为20μl。

各组细胞中脂肪酸甲酯的GC-MS测定结果如图6所示，图6中A-D所示各样品的峰9为亚油酸（Linoleic acid，LA，18：2(n-6)）甲酯，保留时间与其标准品（图6中E的峰19）相同，为26.2min；图6中A-D所示各样品的峰11为顺，顺，顺-8，11，14-二十碳三烯酸（DGLA，20：3(n-6)）甲酯，保留时间与其标准品（图6中E的峰27）相同，为30.0min；图6中A-D所示各样品的峰12为花生四烯酸（Arachidonic Acid，AA，20:4(n-6)）甲酯，保留时间与其标准品（图6中E的峰30）相同，为30.8min；图6中A-D所示各样品的峰13为顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic Acid，EPA，20:5(n-3)）甲酯，保留时间与其标准品（图6中E的峰33）相同，为32.3min；图6中A-D所示各样品的峰17为顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA，22:6(n-3)）甲酯，保留时间与其标准品（图6中E的峰36）相同，为36.9min。各组细胞中脂肪酸甲酯含量的统计分析结果如表2所示，相比阴性对照组（CK1）、空白对照组（CK2）以及阳性对照组（WT），实验组能有效的转化Omega-6脂肪酸为Omega-3脂肪酸，降低ω-6/ω-3比值至少2倍。

表2GC-MS测定各组细胞中脂肪酸甲酯含量的统计分析结果

注：***表示实验组与WT、CK1、CK2相比差异显著（p<0.05）。

亚油酸（Linoleic acid，LA，18：2(n-6)、顺，顺，顺-8，11，14-二十碳三烯酸（DGLA，20：3(n-6)）、花生四烯酸（Arachidonic Acid，AA，20:4(n-6)）均属于Omega-6脂肪酸；顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic Acid，EPA，20:5(n-3)）和顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA，22:6(n-3)）均属于Omega-3脂肪酸。

Claims (7)

1.核酸分子或重组载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌在将omega-6脂肪酸转化为omega-3脂肪酸中的应用；所述omega-6脂肪酸为如下：花生四烯酸、亚油酸、顺，顺，顺-8，11，14-二十碳三烯酸；所述omega-3脂肪酸为如下：顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸和顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸；

所述核酸分子为序列表中序列1的第932-2131位所示的核酸分子；

所述重组载体为含有所述核酸分子的重组载体；

所述表达盒为含有所述核酸分子的表达盒；

所述转基因细胞系为含有所述核酸分子的转基因细胞系；

所述重组菌为含有所述核酸分子的重组菌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述核酸分子转录的启动子为CMV启动子。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体为将所述核酸分子插入到质粒pcDNA3.1(+)的多克隆位点处得到的重组质粒。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体的核酸序列如序列表中序列1所示。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述转基因细胞系为将权利要求1-5任一中所述的重组载体导入受体细胞得到的转基因细胞系。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述受体细胞为离体的猪胎儿成纤维细胞。