CN104686503B - 一种批量冷冻石斑鱼精子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种批量冷冻石斑鱼精子的方法，包括精子采集、精子与抗冻保护液混合、分装与冷冻等步骤。本发明方法针对小量冻存精子费时费力，不能满足实际生产需要的问题，采用液氮样品架批量快速冻存石斑鱼精子。通过本方法，可以快速冻存石斑鱼精子数百毫升，解冻后平均活力大于90％，解决人工繁殖石斑鱼需要大量精子的问题。

Description

一种批量冷冻石斑鱼精子的方法

技术领域

本发明涉及鱼类繁殖与育种学领域，具体涉及一种批量快速保存石斑鱼精子的方法。

背景技术

鱼类精液超低温保存在水产养殖、遗传育种及种质资源保存中具有很重要意义：鱼类精液的超低温冷冻保存，不仅可以实现种质材料的长距离运输，有利于不同区域鱼类的杂交、选育、获得优良性状及基因多样性保护；还可以为水产养殖业和实验生物学研究长期稳定地提供材料。鱼类精子低温冷冻保存研究开始于20世纪50年代初期。英国学者Blaxter使用干冰直接冷冻保存太平洋鲱鱼(Clupea pallasi)精巢，获得80％的受精率。之后，国内外学者们对鱼类精子冷冻保存开展了大量研究。目前已建立200多种淡水鱼类和40多种海水鱼类，包括花鲈、牙鲆、大菱鲆、大黄鱼、真鲷、四大家鱼、鲫鱼、鲤鱼、团头鲂、大口鲇、鳜、鲟鱼、石斑鱼及虹鳟等重要经济鱼类的精子超低温保存方法。

低温生物学研究表明，生物体的一切生化活动，虽大多数由酶所催化而表现多种特殊形式，但仍然服从于共同的生物学规律。其共同的规律是，酶的催化活性是受温度影响的，大多数酶都有其特定的最佳反应温度，但随着温度的降低，酶的活性逐渐下降，当温度降到一定程度，各种酶都会失去活性，不能发挥催化作用，因此，生物体的所有生化活动基本停止，进入一种低能耗、低新陈代谢的休眠状态。

精子低温保存是一项需要控制非常精细的技术，处理条件应用得当时低温可以长期保存精子；处理条件应用不当会严重损伤精子，一般使用液氮低温保存精子所产生的损伤包括(1)渗透压损伤、(2)冰晶损伤、(3)冷休克损伤、(4)抗冷冻剂毒性、(5)pH损伤、(6)复温过程的冷冻的逆过程。一般通过筛选合适的精子稀释剂和抗冻剂来减少冻存对精子的伤害，而精子的低温冷冻步骤对于精子活性的保存也具有重要作用。采用合适的降温速率是减少渗透压损伤和冰晶损伤的重要环节，是保证鱼类精子超低温冷冻保存成功的关键之一。由于在鱼类精子冻存的研究报道中，基本上是采用实验室条件下的单管或少量多管保存，少量保存实验可以利用精密的程序降温设备快速摸索最佳冻存条件，然而这种少量冻存程序却较难在渔业生产中得到大规模的应用。这是因为在单管条件下，精子样品本身的散热较少，可以准确地遵循降温程序达到预定的温度条件。而在批量条件下，如果采用单管冻存则非常费时费力；如果采用多管同时冻存，由于样品的散热较大，除非采用大型的程序降温仪，否则通常不能达到预定的温度条件，从而导致精子在降温过程中损伤。鱼类人工繁殖生产所需要的精子量较大，采用合适的包装方式和降温程序来批量保存精子才能满足产业规模化生产的需要。

石斑鱼在我国海水增养殖业中的重要经济地位，目前杂交石斑鱼是南方海水养殖的重要发展方向，杂交石斑鱼技术需要用到较大量的异源精子，采用批量精子保存技术才能够满足石斑鱼杂交生产的迫切需要。

发明内容

本发明的目的是提供了一种快速批量保存石斑鱼精子的方法，解决了现有石斑鱼精子超低温保存方法效率较低、量小、操作复杂等问题。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种批量冷冻石斑鱼精子的方法，包括以下步骤：

1)精子取材

在石斑鱼进入繁殖盛期的第1、2周内选择健康成熟石斑鱼雄鱼进行采精，采精前擦干鱼体并排除尿液和粪便，将乳白色浓度适中且精子活力旺盛的精样置于50ml EP管中密封、闭光、冰浴保存；显微镜镜检激活观察，室温下80％精子在5min内保持运动状态为合格样品；

2)精子的稀释

选取步骤1)的合格精子，采用常规Ts-2为精子稀释液，DMSO为抗冻剂，按照精子：稀释液：DMSO＝4.5:4.5:1的体积比例均匀混合精子和试剂；

3)样品的分装

将混合好的精子样品分装到2.5ml体积的冻存管中，每管1ml精子样品；将已分装的冻存管装入样品保存盒中，冻存管放置的位置为单数标号位置，一个样品盒放置13管精子样品；

4)样品盒的安放

将装盒的精子样品置于冰浴平衡30min；将样品盒放入样品架从下往上的第1层、3层、5层，样品相邻层之间的垂直间距为6cm；

5)降温操作

将样品架第1层置于液氮面上方6cm处10min，然后将第1层降到液氮面放置5min，然后将第1层浸入液氮中；此时正好保持第3层距离液氮面6cm放置5min，然后将第3层降到液氮面放置5min，再将第3层完全浸入液氮中；此时第5层刚好距离液氮面6cm放置5min，然后将第5层降到液氮面放置5min，最后将第5层完全浸入液氮中；

6)复温操作

将样品架整个取出，迅速将样品盒置于42℃水浴中，并充分在水浴中摇晃解冻，镜检活力后使用。

本发明具有以下优点：

1)本发明保存石斑鱼精子的效率较高，采用分隔放置冻存管的方法有效避免相邻样品管降温过程中散热对精子的损伤，大大提高多管冻存精子复温后的活力。

2)本发明采用液氮样品架保存精子，相邻层样品垂直间距6cm，此设计一方面保证每层精子样品都能按照三步法程序降温，一方面相邻层的样品受前一层样品液氮沸腾的影响大大降低。

3)本发明可以节约冷冻操作的时间，使用本发明方法35min即可完成39ml精子的超低温冷冻操作，减少了人工操作的工作量。本方法单个液氮罐可冻存234ml的精子，可满足20kg受精卵生产的需要，大大减少了精子冻存操作时间、储存和运输成本。

4)本发明方法在于保证受精率的同时提供了保存工作的效率、提高单液氮罐保存量。一次繁殖通常要生产几十公斤的受精卵，用常规方法的话起码要携带5-6个大液氮罐，而且受精率低，用本发明方法1个液氮罐就可以满足一个繁殖周期的量。

附图说明

图1样品盒顶面观；

图2样品架侧面观；

图3不同精子取材时间对冷冻精子活力的影响；

图4样品架不同层次及单管冻存精子的活力比较；

具体实施方式

以下结合鞍带石斑鱼精子的批量快速冷冻保存的具体实例来进一步解释本发明。

1.合格精液的采集：7月份在海南陵水选择健康成熟的鞍带石斑鱼雄鱼进行采精，采精前擦干鱼体并排除尿液和粪便，将乳白色精液置于包裹有锡箔纸的50ml EP管中，并密封迅速置于冰浴样品箱中保存和运输。将少量精子样品置于显微镜下海水激活观察，室温下80％精子在5min内保持运动状态为合格样品。(图3所示，不同精子取材时期对冻存活力的影响)

2)精子的稀释：选取步骤1)的合格精子，采用常规Ts-2(Tris酸10mmol/L，KHCO₃100mmol/L，蔗糖110mmol/L，胎牛血清10％)为精子稀释液，二甲亚砜DMSO为抗冻剂，稀释比例按照精子：Ts-2：DMSO＝4.5:4.5:1的体积比例均匀混合。

3)样品的分装：将混合好的精子样品分装到2.5ml体积的冻存管中，每管1ml精子样品；如图1所示，将这些冻存管装入样品保存盒中，冻存管放置的位置为单数标号位置(1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25)，单个样品盒放置13管精子。

4)样品盒的安放：将装盒的精子样品置于冰浴或4℃冰箱中平衡30min。如图2所示，样品盒高度为5.5cm，样品架每层高度为6cm，将样品盒放入样品架的第1、3、5层(从下往上)，相邻层之间的垂直间距为6cm。

5)降温操作：将样品架放入广口液氮罐中，首先将样品架第1层(最底层)置于液氮面上方6cm处维持10min，然后将第1层降到液氮面放置5min，然后将第1层浸入液氮中；由于第1层与第3层垂直间距为6cm，当第1层刚好完全浸入液氮时，第3层正好距离液氮面6cm，维持该位置5min，然后将第3层降到液氮面放置5min，再将第3层刚好完全浸入液氮中；同理，此时第5层刚好距离液氮面6cm，维持该位置5min，然后将第5层降到液氮面放置5min，最后将第5层完全浸入液氮中。

6)批量保存的效率：一个YDS47-127型的液氮罐可以放置6个样品架，每个样品架放置3个样品盒，每个样品盒放置13ml。一个液氮罐共放置234ml石斑鱼精子。每个样品架降温操作的时间约为35min，大约4个小时可以完成样品的冻存操作。

7)精子复温：将样品架整个取出，迅速将样品盒置于42℃水浴中，并充分在水浴中摇晃解冻1min，取少量加入海水镜检活力。以海水激活1min内正常运动的精子比例为冻存精子活力。(图4)

8)人工授精操作，鞍带石斑鱼精子冻存通常用作杂交石斑鱼用途，用于虎龙斑(棕点石斑鱼♀×鞍带石斑鱼♂)或青龙斑(斜带石斑鱼♀×鞍带石斑鱼♂)的生产，按照繁殖企业的海上鱼排通常1天可生产5-10公斤的卵子，使用单管或多管冷冻方法冻存的精子量较少，普通批量冷冻方法的精子活力较差，均无法满足实际生产的需要(表1)。而本发明的方法单个液氮罐保存的精子可生产受精卵20kg以上，完全可以满足一个繁殖周期4-5天的生产需要。

表1各冷冻操作方法的比较

*单管冷冻法：单次降温操作1管精子；多管冷冻：使用小型液氮勺单次降温操作6管精子；批量冷冻1：使用大液氮勺单次降温操作25管精子；批量冷冻2：本发明采用的冷冻方法

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (2)

1.一种批量冷冻石斑鱼精子的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)精子取材

在石斑鱼进入繁殖盛期的第1周或第2周选择健康成熟石斑鱼雄鱼进行采精，采精前擦干鱼体并排除尿液和粪便，将乳白色浓度适中且精子活力旺盛的精样置于50ml EP管中密封、闭光、冰浴保存；显微镜镜检激活观察，室温下80％精子在5min内保持运动状态为合格样品；

2)精子的稀释

选取步骤1)的合格精子，采用常规Ts-2为精子稀释液，DMSO为抗冻剂，按照精子：稀释液：DMSO＝4.5:4.5:1的体积比例均匀混合精子和试剂；

3)样品的分装

将混合好的精子样品分装到2.5ml体积的冻存管中，每管1ml精子样品；将已分装的冻存管装入样品保存盒中，冻存管放置的位置为单数标号位置，一个样品盒放置13管精子样品；

4)样品盒的安放

将装盒的精子样品置于冰浴平衡30min；将样品盒放入样品架从下往上的第1层、3层、5层，样品相邻层之间的垂直间距为6cm；

5)降温操作

将样品架第1层置于液氮面上方6cm处10min，然后将第1层降到液氮面放置5min，然后将第1层浸入液氮中；此时正好保持第3层距离液氮面6cm放置5min，然后将第3层降到液氮面放置5min，再将第3层完全浸入液氮中；此时第5层刚好距离液氮面6cm放置5min，然后将第5层降到液氮面放置5min，最后将第5层完全浸入液氮中；

6)复温操作

将样品架整个取出，迅速将样品盒置于42℃水浴中，并充分在水浴中摇晃解冻，镜检活力后使用。

2.如权利要求1所述的批量冷冻石斑鱼精子的方法，其特征在于：所述Ts-2精子稀释液成分由Tris酸10mmol/L，KHCO₃100mmol/L，蔗糖110mmol/L，胎牛血清10％组成。