CN104677865B - 一种显微分析装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种显微分析装置，包括激光光源装置、光传导装置、随机光学重构显微装置、原子力显微装置、样品承载装置和信息整合输出装置。所述激光光源装置提供的光源束，由光传导装置导入光学重构显微装置，对样品承载装置上的待测样品进行光学重构显微成像；同时，原子力显微装置对同一位置进行原子力显微成像；信息整合输出装置将随机光学重构显微信息和原子力显微信息整合后输出。解决了现有原子力显微成像不能定性分析样品的问题，可广泛用于生物、高分子和材料领域。

Description

一种显微分析装置

技术领域

本发明涉及一种随机光学重构显微装置和原子力显微装置联用技术，属于显微分析领域。

背景技术

光学显微镜是生物学家从事研究工作、探寻生命奥秘必不可少的利器。人们已经借助光学显微镜对细胞内部错综复杂的结构和形态进行了初步的了解。但是受到光学衍射极限的限制，常规光学显微镜的分辨率很难达到200nm以下。近年来，超分辨荧光显微技术的发明突破了光学衍射极限。其中包括受激发射损耗显微镜STED、饱和结构照明显微技术SSIM、随机光学重构显微技术STORM以及光激活定位显微技术PALM。这些方法的三维空间分辨率相比传统的光学显微镜技术具有数量级上的提高，现在可以用超分辨荧光显微技术描述以前无法分辨的细胞器和分子水平事件。

随机光学重构显微技术是一种高分辨率定位技术。它是将能够在荧光态和暗态之间转换的荧光探针和定位函数结合而发明的超分辨荧光显微技术。通过这项技术可以将衍射极限范围内的分子在不同时间内激活，以便能够使这些分子单独成像；然后，通过宽场成像得到众多分子的平行定位，从而重构了超分辨图像。定位精度可以达到20nm以下。然而，超分辨光学显微镜尚有不能提供三维形貌信息的缺点。

原子力显微镜AFM于1986年由Binnig等人发明，通过检测连接在弹性微悬臂一端的微小探针与被测样品之间微弱的相互作用力来获取样品表面的各类信息。AFM突破了光和电子波长对显微镜分辨率的限制，在真空、大气、以及液体环境下都能获得物质的三维立体形貌。并且能够获得针尖与样品相互作用的信息，如粘弹性，硬度，化学力，摩擦力等。因其可达原子级的高分辨观测能力和可达皮的牛高灵敏检测能力，AFM自发明以来已被广泛用于生命科学、表面科学和材料科学等领域。但是，原子力显微镜不能给出样品的定性信息。

为解决上述技术问题，本发明结合了随机光学重构显微镜和原子力显微镜的各自优势，提供了一种显微分析装置，在高分辨观察样品形貌的同时给出样品的性质信息，从而打破了现有单一显微镜产品的成像局限性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种显微分析装置，解决了现有原子力显微成像不能定性分析样品的问题，能够在得到样品三维形貌信息的同时获得样品分子组成信息，分辨率可达10-20nm，可广泛用于生物分子样品分析、细胞膜结构分析、细胞成像、纳米结构分析及纳米催化检测等。

根据本发明的一个方案，其特征在于，包括激光光源装置、光传导装置、随机光学重构显微装置、原子力显微装置、样品承载装置和信息整合输出装置；所述激光光源装置提供的光源束由光传导装置导入光学重构显微装置，对样品承载装置上所承载待测样品的某一位置进行光学重构显微成像；同时，原子力显微装置对所述待测样品的同一位置进行原子力显微成像；信息整合输出装置将随机光学重构显微装置的成像信息和原子力显微装置的成像信息经整合输出。

所述激光光源装置的作用在于提供的光源束；所述光传导装置的作用在于，将激光光源装置提供的光源束导入光学重构显微装置；所述样品承载装置的作用在于承载待测样品；所述光学重构显微装置的作用在于，对样品承载装置上所承载的待测样品某一位置进行光学重构显微成像；原子力显微装置的作用在于，在光学重构显微装置对样品承载装置上所承载的待测样品某一位置成像的同时，对同一位置进行原子力显微成像；所述信息整合输出装置的作用在于，将随机光学重构显微装置的成像信息和原子力显微装置的成像信息经电脑软件整合输出。

在一个优选的实施方式中，所述激光光源装置包括激光器和激光汇聚装置；所述激光器发出的激光，经激光汇聚装置汇聚成光源束。所述激光器任选自气体激光器、液体激光器、半导体激光器或固体激光器中的一种或几种，数量大于等于2，至少有2个激光器发射的激光波长不同。进一步优选的实施方式为，每个激光器发射的激光波长均不相同。本领域技术人员可根据具体待测样品的性质以及拟获得的信息，择优选取激光器的数量和每个激光器的波长。

在一个优选的实施方式中，所述激光汇聚装置包括一组半透半反分光镜片；半透半反分光镜片的数量可根据需要任意选取；优选的分光镜为二色镜；分光镜透过长波长、阻碍短波长，能够透过所有波长的光并汇聚在同一轴线上。

在一个优选的实施方式中，激光汇聚装置中半透半反分光镜的数量与激光器的数量相等。

在一个优选的实施方式中，所述光纤传导系统包含光路衰减系统、光纤耦合装置和光纤。所述光纤可采用单模或多模光纤，能达到远程光学稳定输出，本领域技术人员可根据具体需要选择。

在一个优选的实施方式中，所述样品承载装置包括样品台和方位控制器；方位控制器控制着样品台在三维方向的移动、旋转，通过电脑软件实现精确控制。样品承载装置中的样品台主要是承载样品，也可以表述为样品池、载物台等。

在一个优选的实施方式中，所述的显微分析装置，所述原子力显微装置包括微小悬臂、压电陶瓷管扫描器和激光位置检测器。其中微小悬臂为力检测部分，检测原子与原子之间的范德华力。激光位置检测器为位置检测部分，包含激光器和位置检测器，当针尖与样品之间有了交互作用之后，会使得微小悬臂摆动，当激光器发射的激光照射在微小悬臂末端时，其反射光位置也会有所改变，从而产生偏移量。位置检测器记录偏移量下并转化成电信号，反馈系统根据此电信号，驱使压电陶瓷管扫描器做适当的移动，以保持样品与针尖保持合适的作用力，最后将样品表面特性以成像的方式呈现出来。

在一个优选的实施方式中，所述随机光学重构显微装置位于样品承载装置下方；所述原子力显微装置位于样品承载装置上方。

在一个优选的实施方式中，所述随机光学重构显微装置为随机重构荧光显微镜；所述原子力显微装置为原子力显微镜。

在一个优选的实施方式中，所述光传导装置为一组折射镜片；所述随机光学重构显微装置包括半透半反分光镜、物镜、反射镜和检测器。激光光源装置提供的光源束经折射后进入光学重构显微装置后，经半透半反分光镜、物镜照射在待测样品的某一位置上，样品发出的荧光经反射镜达到检测器上进行成像。

在一个优选的实施方式中，所述光传导装置为光纤传导装置，包含光路衰减器、光纤耦合器和光纤；所述随机光学重构显微装置包括半透半反分光镜、物镜、反射镜、检测器和透镜。激光光源装置提供的光源束经光路衰减器和光纤耦合器后，由光纤导入光学重构显微装置。所述光源束由光纤导入光学重构显微装置后，由透镜扩束，经半透半反分光镜、物镜照射在待测样品的某一位置上，样品发出的荧光经反射镜达到检测器上进行成像。

在一个优选的实施方式中，所述检测器为电荷耦合阵列检测器，简称CCD检测器。

在一个优选的实施方式中，具体步骤为：

步骤一、多束激光器的激光经过半透半反镜片组，优选二色镜，汇集成一束，经过反射镜汇集到荧光显微镜的光路中。光束聚焦在样品台的样品上，样品的荧光经过反射发送到CCD检测器上进行检测。

步骤二、样品台的上方安装有原子力显微镜的扫描器，精确控制着探针的三维扫描，对样品的形貌给出高度图像。同时，样品下方的荧光显微镜对同一样品位置进行成像分析。最终在显示器上获得样品的三维高度形貌图和荧光成像图。

上述任一显微装置可应用在在生物、高分子和材料领域，如单生物分子、生物膜、细胞、纳米粒子、高分子材料等的检测，通过荧光标记使样品发射荧光。

本发明的有益效果是：

1、本发明所提供的显微分析装置，将随机光学重构显微装置和原子力显微装置联用，同时定位成像，在对样品进行三维形貌分析的同时，能够给出分子的组成信息。

2、本发明所提供的显微分析装置，分辨率可达10-20nm。

3、本发明所提供的显微分析装置，可用于研究生物分子样品分析，细胞膜结构分析，细胞成像，纳米结构分析及纳米催化检测等，拓展了相关领域的检测手段。

附图说明

图1为本发明所述显微分析装置的示意图。

图2为本发明所述显微分析装置中激光光源装置和光传导装置示意图。

图3为本发明所述显微分析装置中光学重构显微装置示意图。

图4为本发明所述显微分析装置中原子力显微装置示意图。

图5为本发明所述显微分析装置所得到的生物样品成像图。

附图中的附图标记如下：

10-激光光源装置；100-激光器；102-激光汇聚装置；12-光传导装置；120-光路衰减器；122-光纤耦合器；124-光纤；14-随机光学重构显微装置；140-半透半反分光镜；142-物镜；144-反射镜；146-检测器；148-透镜；16-原子力显微装置；160-微小悬臂；162-压电陶瓷管扫描器；164-激光位置检测器；1640-激光器；1642-位置检测器；18-样品承载装置；180-样品台；182-方位控制器；20-信息整合输出装置。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于这些附图和实施例。

图1是本发明所述显微分析装置的示意图，包括激光光源装置10、光传导装置12、随机光学重构显微装置14、原子力显微装置16、样品承载装置18和信息整合输出装置20。随机光学重构显微装置14位于样品承载装置18下方，原子力显微装置16位于样品承载装置18上方。

图2为本发明所述显微分析装置中，激光光源装置10和光传导装置12示意图。激光光源装置10包括激光器100和激光汇聚装置102。5个激光器100分别发出波长为640nm、561nm、532nm、473nm和405nm的激光，经5个二色镜组成的激光汇聚装置102，汇聚成一束光源束。

在一个实施方式中，光传导装置12为若干片反射镜，如图2A所示。光源束经过反射镜组成的光传导装置12，进入随机光学重构显微装置14；光源束进入光学重构显微装置14后，经透返镜140、物镜142照射在待测样品的某一位置上，样品发出的荧光经反射镜144达到检测器146上进行成像，如图3A所示。

在另一个实施方式中，光传导装置12由光路衰减器120、光纤耦合器122和光纤124组成，如图2B所示。光源束经过光路衰减器120、光纤耦合器122，由光纤124导入随机光学重构显微装置14，由透镜148扩束后，经透返镜140、物镜142照射在待测样品的某一位置上，样品发出的荧光经反射镜144达到检测器146上进行成像，如图3B所示。

如图3所示，样品承载装置18包括样品台180和方位控制器182；方位控制器182控制着样品台180在三维方向的移动、旋转，由电脑软件实现精确控制。

在光学重构显微装置14对样品承载装置18上所承载的待测样品某一位置成像的同时，原子力显微装置16对同一位置进行原子力显微成像。如图4所示，原子力显微装置16包括微小悬臂160、压电陶瓷管扫描器162和激光位置检测器164。其中，微小悬臂160为力检测部分，检测原子与原子之间的范德华力。激光位置检测器164为位置检测部分，包含激光器1640和位置检测器1642，当微小悬臂160前端的探针与样品之间有了交互作用之后，会使得微小悬臂160摆动，当激光器1640发射的激光照射在微小悬臂160末端时，其反射光位置也会有所改变，从而产生偏移量。位置检测器1642记录偏移量下并转化成电信号，反馈系统根据此电信号，驱使压电陶瓷管扫描器162做适当的移动，以保持样品与针尖保持合适的作用力，最后将样品表面特性以成像的方式呈现出来。

信息整合输出装置20为电脑工作站，将随机光学重构显微装置14的成像信息和原子力显微装置16的成像信息经软件整合输出。

具有步骤如下：

步骤一、激光光源分别发射激光，由一组半透半反光学镜片（二色镜）把多个光束同轴汇集成一束光，经过耦合激光进入光纤中，最后光束导入荧光显微镜光路中。

步骤二、光束由显微镜物镜头发射到样品台上，样品的荧光物质受到激发后发射特定波长的荧光，它经过光路的反射镜照射在CCD检测器上，进行光学成像。

步骤三、原子力显微镜安装在样品台的上方，在荧光成像的同时对同一样品的同一区域进行原子力显微镜成像。

上述的步骤一中，激光器必须选用固定波长、激光品质高的激光器。光路中的半透半反镜片能够透过长波长、阻碍短波长，达到所有波长都能透过并汇聚在同一轴线上。光纤采用单模或多模光纤，达到远程光学稳定输出。

上述的步骤二中，检测物包括单个生物分子、生物膜、细胞、纳米粒子、高分子材料等，并通过荧光标记使样品发射荧光。

上述的步骤三中，原子力显微镜的探针在样品的上方，通过软件控制对样品进行高分辨成像。最终原子力显微镜和荧光显微镜图像在计算机上同时输出。

上述方法可以用于单分子定位，样品高分辨成份分析，涉及到生物、材料领域的应用。本发明的随机重构荧光显微镜和原子力显微镜联用技术能够适合多种荧光显微镜和原子力显微镜。荧光显微镜包括但不限于莱卡、尼康、奥林巴斯等公司，原子力显微镜包括但不限于安捷伦科技公司和布鲁克等公司的原子力显微镜产品。

实施例1

对细胞膜进行高分辨形貌和成份研究，把生物膜样品在样品台上固定于基底表面，进行抗体标记染色。样品承载装置中的方位控制器，控制样品台在三维方向移动和转动，以选取拟测量的样品位置。

5个激光发射器分别发出波长为640nm、561nm、532nm、473nm和405nm的光，经5个二色镜汇聚成光源束。光源束经过光路衰减器、光纤耦合器，由光纤导入随机重构荧光显微镜，利用随机重构荧光显微镜对细胞膜样品中的蛋白进行光学定位，成像结果通过电脑输出图像。在荧光成像的同时，原子力显微镜在细胞膜的上方进行成像，获得纳米级的高分辨图。通过信息整合输出系统，把随机重构荧光显微镜所得信息和原子力显微镜所得信息叠加定位后输出。结果如图5所示，其中A为细胞膜胞质一侧的原子力显微成像图，B为随机光学重构显微成像图。从图中可以看出，原子力显微成像图片呈现高度形貌图，但不能给出样品性质分析，结合随机光学重构显微成像图就可以确定特定细胞膜蛋白的分布特征和属性。

应当指出，对于使本技术领域的专业技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，是能够实现对上述实施例的多种修改的，而这些修改也应视为本发明应该保护的范围内。

Claims (10)

1.一种显微分析装置，其特征在于，包括激光光源装置(10)、光传导装置(12)、随机光学重构显微装置(14)、原子力显微装置(16)、样品承载装置(18)和信息整合输出装置(20)；

所述激光光源装置(10)提供的光源束由光传导装置(12)导入光学重构显微装置(14)，对样品承载装置(18)上待测样品的某一位置进行光学重构显微成像；同时，原子力显微装置(16)对所述待测样品的同一位置进行原子力显微成像；信息整合输出装置(20)将随机光学重构显微装置(14)的成像信息和原子力显微装置(16)的成像信息经整合输出；

所述随机光学重构显微装置(14)包括半透半反分光镜(140)、物镜(142)、反射镜(144)和检测器(146)；所述光源束进入光学重构显微装置(14)后，经半透半反分光镜(140)、物镜(142)照射在待测样品的某一位置上，样品发出的荧光经反射镜(144)达到检测器(146)上进行成像；

所述样品承载装置(18)包括样品台(180)和方位控制器(182)；

所述原子力显微装置(16)包括激光器(1640)；

所述光传导装置(12)为一组折射镜片；激光光源装置(10)提供的光源束经折射后进入光学重构显微装置(14)；或

所述光传导装置(12)为光纤传导装置，包含光路衰减器(120)、光纤耦合器(122)和光纤(124)；激光光源装置(10)提供的光源束经光路衰减器(120)和光纤耦合器(122)后，由光纤(124)导入光学重构显微装置(14)。

2.根据权利要求1所述的显微分析装置，其特征在于，所述激光光源装置包括激光器(100)和激光汇聚装置(102)；所述激光器(100)发出的激光，经激光汇聚装置(102)汇聚成光源束。

3.根据权利要求2所述的显微分析装置，其特征在于，所述激光器(100)的数量大于等于2，其中至少有2个激光器发射的激光波长不同。

4.根据权利要求2所述的显微分析装置，其特征在于，所述激光汇聚装置(102)包括一组半透半反分光镜片。

5.根据权利要求4所述的显微分析装置，其特征在于，所述激光汇聚装置(102)中半透半反分光镜片的数量与激光器(100)的数量相同。

6.根据权利要求1所述的显微分析装置，所述方位控制器(182)控制着样品台(180)在三维方向的移动、旋转。

7.根据权利要求1所述的显微分析装置，所述原子力显微装置(16)包括微小悬臂(160)、压电陶瓷管扫描器(162)和激光位置检测器(164)。

8.根据权利要求1所述的显微分析装置，所述随机光学重构显微装置(14)位于样品承载装置(18)下方，原子力显微装置(16)位于样品承载装置(18)上方。

9.根据权利要求1所述的显微分析装置，其特征在于，所述随机光学重构显微装置(14)包括半透半反分光镜(140)、物镜(142)、反射镜(144)、检测器(146)和透镜(148)；所述光源束由光纤(124)导入光学重构显微装置(14)，由透镜(148)扩束后，经半透半反分光镜(140)、物镜(142)照射在待测样品的某一位置上，样品发出的荧光经反射镜(144)达到检测器(146)上进行成像。

10.根据权利要求9所述的显微分析装置，其特征在于，所述检测器(146)为电荷耦合阵列检测器。