CN111025874A - 基于f-p腔的相移相位显微成像新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是一种基于F‑P腔的相移相位显微成像新方法。其特征是：它包括基于F‑P腔的数字全息图记录、相移法计算相位分布、解包裹、三维相位分布重建和三维折射率转换。本发明主要提供一种基于F‑P腔的相移相位显微成像新方法，相比传统的显微成像方法，具有更高的灵敏度。本发明具有结构简单、灵敏度高、测量精确的优点。本发明可用于光学透明物体的高分辨率三维显微成像，可广泛应用于微小生物的无损、无标记、非接触式的三维层析成像等。
Description
(一)技术领域
本发明涉及的是一种基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，可用于光学透明物体的高分辨率三维显微成像，可广泛应用于微小生物的无损、无标记、非接触式的三维层析成像等，属于显微成像技术领域。
(二)背景技术
待测样品的三维折射率分布，是其一种重要的固有属性，对于光学透明的待测样品来说，三维折射率分布，可以反映样品的微结构、密度等信息，因此要实现无损、无标记、非接触式的三维层析成像。
在当代的生命科学研究中，通常采用荧光成像对待测样品进行标记。但是在进行标记的过程中，会对待测样品本身产生一定的影响，从而会影响最终的研究结果。而数字全息层析成像技术是一种新型的无损、无标记、非接触式的新型成像技术，可以重建得到待测样品的三维折射率分布信息，是近年来的一个研究热点。
数字全息层析成像技术结合了数字全息显微成像技术和计算机断层扫描技术，是近年来提出的新技术。近年来，虽然提出了多种应用数字全息层析成像技术的成像方法，但是大部分的思路都是结合马赫曾德尔干涉光路进行数字全息记录。
马赫曾德尔干涉光路成像所用的器件更多，系统稳定性要求更高，操作成为复杂。基于马赫曾德尔干涉光路的方法，对器件的要求更高，而且光路更为复杂且难以调试，因此迫切需要一种新的成像方法，其所用器件更少，光路更为简单，系统稳定性更高，操作更为简便，而且对待测样品测量的灵敏度更高，成像分辨率更高。
本发明提出了一种基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，本发明采用F-P腔干涉光路，其光路简单，所用的器件更少，因此系统的稳定性更高。从原理上来说，光束在F-P腔多次反射，并多次经过待测样品，光程差依次累积，因此测量的灵敏度更高。F-P腔干涉形成的全息图，精细度相比马赫曾德尔干涉更高，全息图的记录更为精确。基于F-P腔的数字全息记录光路属于同轴数字全息技术，不受分辨率的限制，但是会受到零级衍射像和共轭像的干扰，因此在本发明中采用相移干涉技术，可以解决零级衍射像和共轭像干扰的问题。
专利CN201310082100.9公开了一种数字全息成像在线重构显示系统及方法，其特点是采用了马赫曾德尔干涉数字全息记录光路，相比本发明提出的基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，本发明提出的新方法，测量灵敏度更高。
专利CN201610911993.7公开了一种双波长相位显微成像系统和方法、以及对应相位恢复方法，其特点是采用马赫曾德尔干涉光路来实现双波长同轴相移干涉显微系统，与本发明有着本质性的区别，相比本发明提出度新方法，也没法本发明的测量灵敏度高。
专利CN201710518263.5公开了一种三折射率层析显微成像系统及其方法，其虽然可以还原出样本的三维折射率信息，但是在成像光路上，与本发明有着本质区别，且所需器件更为复杂。
专利CN201710904860.1公开了一种光学相干断层扫描成像系统，该成像系统采用了马赫曾德尔干涉光路，其特点是采用了光纤来简化系统，降低成本，但是相比F-P腔的光路结构，仍然较为复杂。
专利CN201810145657.5公开了一种高分辨率数字全息衍射层析成像，其特点是采用马赫曾德尔干涉光路结构，利用合成孔径方法得到N幅合成高分辨率全息图，进而获得被测样品的高分辨率三维折射率再现。相对来说，结构更为复杂，与本发明专利有着本质区别。
专利CN201910136421.X公开了一种超分辨率数字全息成像系统和成像方法，其成像系统的特点是在传统的马赫曾德尔干涉光路前加入一块透射式空间光调制器，对光源进行调制。与采用F-P腔的光路结构的本发明相比，有着本质区别。
本发明公开了一种基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，本发明可用于光学透明物体的高分辨率显微成像，可广泛应用于微小生物的无损、无标记、非接触式的层析成像等领域。该基于F-P腔的相移相位显微成像新方法采用基于F-P腔的数字全息记录光路，运用数字全息层析成像技术和相移技术，对F-P腔光路记录的数字全息图，进行层析重建，还原出待测样品的三维折射率分布。与在先技术相比，由于采用了基于F-P腔的数字全息记录光路，光束在F-P腔中多次反射经过待测样品，测量的灵敏度更高，采用了相移技术，可以解决F-P腔同轴全息的零级衍射像和共轭像干扰的问题。该基于F-P腔的相移相位显微成像新方法具有结构简单、灵敏度高、分辨率更高的优点。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种结构简单、灵敏度高、分辨率更高的基于F-P腔的相移相位显微成像新方法。
本发明的目的是这样实现的：
该基于F-P腔的相移相位显微成像新方法包括基于F-P腔的数字全息图记录、相移法计算相位分布、解包裹、三维相位分布重建和三维折射率转换。在F-P腔中放入待测样品，在θ＝0时，控制锆钛酸铅(PZT)压电陶瓷换能器，记录含有待测样品信息的最优的数字全息图，获得N幅相移全息图，得到N幅透射光的光强分布，代入推导公式，可以得到该角度时只含有待测样品信息的相位分布δi，对相位分布进行解包裹处理。旋转待测样品，记录不同角度时的N幅相移全息图，依次代入推导公式得到该角度时的只含有待测样品信息的相位分布。对所有角度的相位分布做iRadon变换，即可重建待测样品的三维相位分布δ(x,y,z)，由转换公式可以转换得到待测样品的高分辨率三维折射率分布n(x,y,z)。
本发明提出的基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，适用于包括基于F-P腔的数字全息记录光路11、待测样品12、控制模块13和计算显示模块14的测量系统，如图2a所示。所述基于F-P腔的数字全息记录光路11包括光源，扩束器，F-P腔，锆钛酸铅(PZT)压电陶瓷换能器，显微物镜，图像采集器等。所述待测样品12为光学透明物体。所述控制模块13由计算机、仪器控制单元和仪器控制接口组成，对PZT、图像采集器、旋转控制平台等进行控制和操作，完成包含待测样品信息的数字全息图记录。所述计算显示模块14，对记录的数字全息图进行程序处理，并在线显示待测样品12的三维折射率分布信息。
所述基于F-P腔的数字全息记录光路11包括光源，扩束器，F-P腔，PZT，显微物镜，图像采集器等。优选的，光源采用波长为532nm的激光光源，并选用相应波长的扩束器，选用腔长固定的F-P标准具，根据相移步长选用相应参数的PZT，放大倍数为20倍的显微物镜，像素尺寸为3.45μm×3.45μm的Charge Coupled Device(CCD)等器件。
所述待测样品12位于基于F-P腔的数字全息记录光路11中的F-P腔中，光束在F-P腔多次反射，并多次经过待测样品，光程差依次累积，因此测量的灵敏度更高。
所述基于F-P腔的相移相位显微成像新方法中，F-P腔的腔长大于待测样品12的直径，使得待测样品12能够放入F-P腔中。
所述基于F-P腔的相移相位显微成像新方法中，F-P腔的界面反射率在0～1之间。所述的基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，相移步数为3，4，5，…，N-1，N步。
所述基于F-P腔的相移相位显微成像新方法中，F-P腔具有不同长度的腔长，且可以具有不同的形状和尺寸。F-P腔的腔长可以是可调的，当F-P腔的腔长固定时，即是F-P标准具。并且可以通过控制PZT改变腔长。
所述的待测样品12为光学透明物体，具有任意的三维折射率分布。待测样品12为微小物体，光束经过待测样品12时，会产生柱透镜效应，因此需要选择并填充折射率与待测样品12最外层折射率相当的折射率匹配液。
所述控制模块13由计算机、仪器控制单元和仪器控制接口组成，对PZT,图像采集器、旋转控制平台等进行控制和操作，运用相移技术，完成包含待测样品信息的数字全息图记录。搭建完成基于F-P腔的数字全息记录光路11后，利用控制模块13，控制PZT改变F-P腔的腔长，使全息图相移，并控制旋转控制平台带着待测样品12转动一周，同时控制CCD采集包含待测样品12信息的数字全息图且存储图像。
所述计算显示模块14，对存储的数字全息图进行程序处理，并在线显示待测样品12的三维折射率分布信息。根据本发明提供的显微成像新方法，对CCD采集的数字全息图进行处理，可以重建得到待测样品12的高分辨率三维折射率分布。
基于F-P腔的数字全息记录光路11中，光束在F-P腔中多次反射、透射，如图3b所示，多次经过待测样品，记录待测样品的三维信息，光程差依次累积，最终透过F-P腔的干涉光束的光强分布为：
其中，I0是入射F-P腔的光波33的光强分布，R为F-P腔的两平行的平面玻璃板内侧的表面反射率，如图3a中的31和32，δ为待测样品的相位分布。
控制PZT改变F-P腔的腔长，依次记录N幅相移全息图。通过下式可以获得某一角度只含有待测样品信息的相位分布为：
其中，Ii为依次记录的N幅相移全息图的光强分布。
光束沿着传播方向，经过待测样品12内部的每一点的折射率的累积，就是通过数字全息图获得的相位分布，当待测样品12内部及与待测样品12周围的环境介质之间的折射率差较小时，光程差是沿光束路径方向折射率的累积，则三维相位分布与待测样品12的三维折射率分布的关系为：
其中，n(x,y,z)为待测样品12内部的折射率分布，λ为入射光源的波长，z轴是光束传播的方向，n0为待测样品12周围的环境介质的折射率。
对于常见的基于马赫曾德尔干涉的数字全息记录光路，光源经分光棱镜分成两束，一束光经过待测样品作为物光波，另一束光作为参考光。两束光又经分束棱镜合束，在CCD记录平面相遇干涉形成全息图。光束只经过一次待测样品，记录待测样品的三维信息，光程差累积一次。对CCD记录的数字全息图，进行数值重建，再现物光波的复振幅分布为UMZ。同时得到物光波的相位分布为：
其中，UMZ表示再现的物光波的复振幅分布，Re表示取复振幅的实部，Im表示取虚部。
基于马赫曾德尔干涉的数字全息记录光路，光束沿着传播方向，经过待测样品，相位差在待测样品内部沿光束传播方向累积，光束只经过一次待测样品，因此相位分布与待测样品的折射率分布的关系为：
其中，n(x,y,z)为待测样品内部的折射率分布，λ为入射光源的波长，z轴是光束传播的方向，n0为待测样品周围的环境介质的折射率。
对比公式(3)和公式(5)，可以发现，本发明提出的基于F-P腔的基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，光束在F-P腔中多次反射、透射，多次经过待测样品，记录待测样品的三维信息，光程差依次累积，测量灵敏度更高，因此分辨率更高，从原理上优于常见的基于马赫曾德尔干涉的折射率测试方法。
因此在基于F-P腔的数字全息记录光路11中，首先在F-P标准具中放入待测样品。记录该角度含有待测样品12信息的透射光的最优数字全息图，控制PZT改变F-P标准具的腔长，获得该角度时的N幅相移全息图。根据公式(2)即可获得该角度时只含有待测样品12信息的相位分布。控制模块13，依次控制旋转控制平台带着待测样品12转动一周，同时控制CCD采集每一角度时的N幅包含待测样品12信息相移全息图。利用计算显示模块14，由公式(2)，即可依次得到每一角度的只含有待测样品12信息的相位分布，依次将各个截面上所有角度的待测样品12的相位分布，进行iRadon变换，即可重建得到待测样品的三维相位分布δ(x,y,z)。根据公式(3)，可转换得到待测样品12的高分辨率三维折射率分布，通过计算显示模块14，即可在线显示待测样品12的高分辨率三维折射率分布n(x,y,z)。
本发明所述的，基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，主要包括以下步骤：
第一步：在F-P腔中放入待测样品12。
第二步：控制模块13控制PZT工作，记录该角度时放入待测样品后透射光的最优数字全息图，并截取一定大小，获得N幅相移全息图。
第三步：N幅相移全息图，代入公式(2)得到其相位分布。
第四步：对相位分布进行解包裹处理，得到该角度只含有待测样品信息的相位分布。
第五步：控制模块13控制旋转控制平台，使待测样品转动一周，依次重复第二步～第四步，即可得到待测样品12不同角度时各个截面上的相位分布。
第六步：通过计算显示模块14，依次将各个截面上所有角度的待测样品12的相位分布，进行iRadon变换，即可重建得到待测样品12的三维相位分布δ(x,y,z)。
第七步：通过计算显示模块14，根据公式(3)，可转换得到待测样品12的高分辨率三维折射率分布n(x,y,z)。通过计算显示模块14，即可在线显示待测样品12的高分辨率三维折射率分布。
本发明提供的基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，包括基于F-P腔的数字全息图记录、相移法计算相位分布、解包裹、三维相位分布重建和三维折射率转换。与在先技术相比，由于采用了基于F-P腔的数字全息记录光路，光束在F-P腔中多次反射经过待测样品，测量的灵敏度更高。该基于F-P腔的相移相位显微成像新方法具有结构简单、灵敏度高、分辨率更高的优点。
(四)附图说明
图1是一种基于F-P腔的相移相位显微成像新方法的示意图。包括基于F-P腔的数字全息图记录、相移法计算相位分布、解包裹、三维相位分布重建和三维折射率转换。
图2a是本发明提出的一种基于F-P腔的相移相位显微成像新方法适用的测量系统结构图。包括基于F-P腔的数字全息记录光路11、待测样品12、控制模块13和计算显示模块14。图2b是本发明实施例中基于F-P腔的一种数字全息记录光路的示意图。该实施例中，一种基于F-P腔的数字全息记录光路包括光源21、衰减器22、扩束器23、F-P标准具24、微结构光纤25、PZT26、显微物镜27、CCD28和计算机29。
图3a是本发明中F-P腔的示意图。F-P腔由两块平行的平面玻璃板组成，在两块平面玻璃板的向里的两侧31和32处镀有反射率为R的介质膜。图3b是光束入射F-P腔，在F-P腔中多次反射、透射的示意图。33是入射光波，34是入射角，35、37、39是透射光的示意图，36、38是反射光的示意图。
图4是本发明实施例中F-P标准具24与微结构光纤25的示意图。旋转控制平台41控制微结构光纤25旋转，PZT26控制F-P标准具24腔长改变，微结构光纤25插入填充有折射率与微结构光纤25最外层折射率相当的折射率匹配液的比色皿42中，光束传播方向如43所示。
图5是本发明基于F-P腔的相移相位显微成像新方法的步骤流程图。
(五)具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。
实施例1：
图2b给出了一种基于F-P腔的数字全息记录光路的实施例。该光路包括光源21、衰减器22、扩束器23、F-P标准具24、微结构光纤25、PZT26、显微物镜27、CCD28和计算机29。光束由光源21出发，经过衰减器22，光束能量减弱，光束经过扩束器23，光束直径扩大，光束经过放有微结构光纤25的F-P标准具24时，在F-P标准具24多次反射，多次经过微结构光纤25，经过F-P标准具24的每一束透射光在通过显微物镜27后，在CCD28上干涉叠加，由CCD27记录干涉的数字全息图，并保存在计算机29中。通过控制PZT26改变F-P标准具24的腔长，获得N幅相移全息图。
在本实施例中，优选的，光源21采用波长为532nm的激光光源，并选用相应波长的扩束器23，选用可调的衰减器22，选用腔长为10mm的F-P标准具24，根据相移步长选用相应参数的PZT26，放大倍数为20倍的显微物镜27，像素尺寸为3.45μm×3.45μm的CCD28等器件。
在本实施例中，优选的，F-P标准具24如图3a所示，选用内侧表面镀有反射率为0.8的介质膜的两块平行的平面玻璃板，组成腔长为10mm的F-P标准具24。优选的，微结构光纤25为偏芯光纤，并将去除涂覆层的偏芯光纤，放入填充有折射率匹配液的比色皿42中，将比色皿42放入F-P标准具24腔中，如图4所示，调整数字全息记录光路，使光束43的光轴经过微结构光纤25。
在本实施例中，优选的，采用标准的四步相移算法，控制PZT26依次获得4幅相移全息图。
在本实施例中，优选的，旋转控制平台41选用精密的旋转电机，通过控制模块，精密的控制微结构光纤25绕光纤轴向方向旋转一周。比色皿42上带有陶瓷插芯，可以固定微结构光纤25绕轴转动，填充的折射率匹配液折射率与光纤包层的折射率相同。
在本实施例中，所述基于F-P腔的数字全息记录光路包括光源21、衰减器22、扩束器23、F-P标准具24、PZT26、显微物镜27、CCD28等。所述微结构光纤25为偏芯光纤。所述控制模块由计算机29、仪器控制单元和仪器控制接口组成，对PZT26、CCD28、控制微结构光纤25转动的旋转控制平台41等进行控制和操作，完成包含微结构光纤25信息的相移全息图记录。所述计算显示模块，对记录的相移全息图按本发明提出的显微成像方法进行程序处理，并在线显示微结构光纤的三维折射率信息。
本实施例中，运用基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，对微结构光纤25的数字全息图进行处理，并在线显示微结构光纤25的三维折射率信息，如图5所示，主要包括以下步骤：
第一步51：在F-P标准具24中放入微结构光纤25。
第二步52：控制模块控制CCD28记录最优的数字全息图。
第三步53：控制模块控制PZT工作，记录该角度时放入微结构光纤25后透射光的最优数字全息图，并截取一定大小，获得4幅相移全息图。
第四步54：记录的4幅相移全息图，代入公式(2)得到该角度时，微结构光纤25的相位分布。
第五步55：对该角度的相位分布进行解包裹处理，得到该角度只含有微结构光纤25信息的相位分布。
第六步56：控制模块控制旋转控制平台，使微结构光纤25转动一周，依次重复第二步～第五步，即可得到微结构光纤25不同角度时各个截面上的相位分布。
第七步57：通过计算显示模块，依次将各个截面上所有角度的微结构光纤25的相位分布，进行iRadon变换，即可重建得到微结构光纤25的三维相位分布δ(x,y,z)。
第八步58：通过计算显示模块，根据公式(3)，可转换得到微结构光纤25的高分辨率三维折射率分布n(x,y,z)。通过计算显示模块，即可在线显示微结构光纤25的高分辨率三维折射率分布。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，但本发明的保护范围并不局限于此。任何本领域的技术人员根据本发明的精神和范围，对本发明进行各种改动和变化，均应包含在本发明权利要求保护范围内。
Claims (8)
1.一种基于F-P腔的相移相位显微成像新方法。其特征是：它包括基于F-P腔的数字全息图记录、相移法计算相位分布、解包裹、三维相位分布重建和三维折射率转换。在F-P腔中放入待测样品，在θ＝0时，控制锆钛酸铅(PZT)压电陶瓷换能器，记录含有待测样品信息的最优的数字全息图，获得N幅相移全息图，得到N幅透射光的光强分布，代入推导公式，可以得到该角度时只含有待测样品信息的相位分布δi，对相位分布进行解包裹处理。旋转待测样品，记录不同角度时的N幅相移全息图，依次代入推导公式得到该角度时的只含有待测样品信息的相位分布。对所有角度的相位分布做iRadon变换，即可重建待测样品的三维相位分布δ(x,y,z)，由转换公式可以转换得到待测样品的高分辨率三维折射率分布n(x,y,z)。
2.一种基于F-P腔的相移相位显微成像新方法。其特征是：适用于包括基于F-P腔的数字全息记录光路、待测样品、控制模块和计算显示模块的测量系统。所述基于F-P腔的数字全息记录光路包括光源，扩束器，F-P腔，锆钛酸铅(PZT)压电陶瓷换能器，显微物镜，图像采集器等。所述待测样品为光学透明物体。所述控制模块由计算机、仪器控制单元和仪器控制接口组成，对PZT、图像采集器、旋转控制平台等进行控制和操作，完成包含待测样品信息的数字全息图记录。所述计算显示模块，对记录的数字全息图进行程序处理，并在线显示待测样品的三维折射率分布信息。
3.根据权利要求2所述的基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，所述待测样品位于数字全息记录光路中的F-P腔中。
4.根据权利要求2所述的基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，F-P腔的腔长大于待测样品的直径，F-P腔的界面反射率在0～1之间。
5.根据权利要求2所述的基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，F-P腔具有不同长度的腔长，并且可以控制PZT改变腔长。
6.根据权利要求1所述的基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，待测样品可以是具有任意三维折射率分布的光学透明物体等。
7.根据权利要求1所述的基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，相移步数为3，4，5，…，N-1，N步。
8.根据权利要求1所述的基于F-P腔的相移相位显微成像新方法，主要包括以下步骤：
第一步：在F-P腔中放入待测样品。
第二步：控制模块控制PZT工作，记录该角度时放入待测样品后透射光的最优数字全息图，并截取一定大小，获得N幅相移全息图。
第三步：N幅相移全息图，代入公式(1)得到其相位分布。
其中，Ii为N幅相移全息图的光强分布，δ为相位分布。
第四步：对相位分布进行解包裹处理，得到该角度只含有待测样品信息的相位分布。
第五步：控制模块控制旋转控制平台，使待测样品转动一周，依次重复第二步～第四步，即可得到待测样品不同角度时各个截面上的相位分布。
第六步：通过计算显示模块，依次将各个截面上所有角度的待测样品的相位分布，进行iRadon变换，即可重建得到待测样品的三维相位分布δ(x,y,z)。
第七步：根据公式(2)，可转换得到待测样品的高分辨率三维折射率分布，通过计算显示模块，即可在线显示待测样品的高分辨率三维折射率分布n(x,y,z)。
其中，n(x,y,z)为待测样品内部的折射率分布，z轴是光束传播的方向，λ为光源的波长，n0为周围的环境介质的折射率。
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