CN104673807A - 一种包含猪流行性腹泻病毒s499-789基因重组沙门氏菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，公开了包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌。本发明包含S_499-789基因重组沙门氏菌免疫产生的针对猪流行性腹泻病毒的特异性抗体水平高，对猪流行性腹泻疾病有良好的保护作用，临床应用前景优良。

Description

一种包含猪流行性腹泻病毒S499-789基因重组沙门氏菌

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种包含S_499-789基因重组沙门氏菌。

背景技术

猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻疾病(Porcine epidemic diarrhea，PED)的病原，该病以产房1-7日龄仔猪淡黄色水样腹泻、严重脱水为主，剖检可见仔猪肠道内胀气、有黄色乳凝块。PEDV主要通过粪-口途径传播，产房仔猪通过消化道摄入病毒后，病毒主要入侵空肠和回肠部位小肠黏膜上皮细胞，并开始病毒复制。PEDV的感染导致上皮细胞膜表面的双糖酶(乳糖酶、蔗糖酶、麦芽糖酶)、氨肽酶、碱性磷酸酶的活性下降；同时，肠绒毛上皮细胞正常结构破坏并发生细胞破碎，造成肠绒毛萎缩，肠道表面积减少，从而导致小肠消化不良、吸收不良等机能障碍，诱发仔猪发生腹泻并脱水。

PEDV最早在英国发现，并流行于欧洲从上世纪八十年代以后，中国、日本、韩国也开始有所报导。2010年至今，该病已广泛流行于中国、韩国、泰国、美国等国。该病对产房仔猪极高的发病率和致死率、较高的治疗成本及防控成本，以及病毒基因发生变异造成强毒株的出现，对世界养猪业造成了巨大的损失。

随着PEDV分子生物学研究的深入，PEDV免疫机理基本清楚，属于典型的局部黏膜免疫为主，存在于血清中PEDV IgG不能提供有效保护，而肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗体(SIgA)才能抵抗PEDV感染，仔猪通过初乳来获得母源SIgA，从而产生对流行性腹泻的被动免疫保护。

目前大多都是传统型灭活苗和弱毒苗，但是它存在毒力返强及散毒的风险，需要改进。为了研制出更为安全、高效、成本低廉、保存和使用方法简易的猪流行性腹泻疫苗，人们开始利用基因工程手段开发黏膜免疫疫苗，以期达到进一步预防和控制该病的目的。如，徐丽丽等构建了可表达PEDV S蛋白COE区域、SD区域的减毒沙门氏菌重组疫苗，其包含的抗原基因长，菌株稳定性越差，同时其包含crp毒力基因，安全性难以保证。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的重组菌株。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明重组载体，包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。优选地，所述的重组载体是重组pVAX1。

本发明重组菌，其特征在于：它包含权利要求2或者3所述的重组载体。

所述的重组菌为重组沙门氏菌或者重组大肠杆菌。

所述的重组沙门氏菌为重组减毒沙门氏菌SL7207。

本发明还提供了一种重组蛋白，它是由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。它的 氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

目的基因S_499-789核苷酸序列(SEQ ID NO：1)：

Gttactttgccatcat ttaatgatca ttcttttgtt aatattactg tctctgcggc ttttggtggt cttagtagtg ccaatctcgt tgcatctgac actactatca atgggtttag ttctttctgt gttgacacta gacaatttac cattacactg ttttataatg ttacaaacag ttatggttat gtgtctaaat cacaggatag taattgtcct ttcaccttgc aatctgttaa tgattacctg tcttttagca aattttgtgt ttcaaccagc cttttggctg gtgcttgtac catagatctt tttggttacc ctgcgttcgg tagtggtgtt aagttgacgt ccctttattt tcaattcaca aaaggtgagt tgattactgg cacgcctaaa ccacttgaag gtatcacaga cgtttctttt atgactctgg atgtgtgtac caagtatact atctatggct ttaaaggtga gggtattatt acccttacaa attctagcat tttggcaggt gtttattata catctgattc tggacagttg ttagccttta agaatgtcac tagtggtgct gtttattctg tcacgccatg ttctttttca gagcaggctg catatgttaa tgatgatata gtgggtgtta tttctagttt gtctaactcc acttttaaca atactaggga gttgcctggt ttcttctacc attctaatga cggctccaat tgtacagagc ctgtgttggt gtatagtaac ataggtgttt gtaaatctgg cagtattggc tatgttccat ctcagtatgg ccaagtcaag attgcaccca cggttactgg gaatattagt attcccacca actttagtat gagtatt 

对应的S_499-789氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：

VKLVKAKARGPRQAGICEVRYTSLVVGSTTKVVSKRVENANVNLVVVDEDVTLNTTGRTVVVDGLAFFESDGFYRHLADADVVIEHPVYKSACELKPVFECDPIPDFPLPVAASVAELCVQTDLLLKNYNTPYKTYSCVVRGDKCCITCTLQFKAPSYVEDAVNFVDLCTKNIGTAGFHEFYITAHEQQDLQGFLTTCCTMSGFECFMPTIPQCPAVLEEIDGGSIWRSFITGLNTMWDFCKRLKVSFGLDGIVVTVARKFKRLGALLAEMYNTYLSTVVENLVLAGVSFK 

在研究过程中，发明人根据经验选择S蛋白的第499-789段基因片段，制备得到了免疫原性非常强的重组菌株，其产生的针对猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体高于灭活疫苗，可以有效预防猪流行性腹泻疾病，取得了意料不到的技术效果。

本发明包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的重组沙门氏菌免疫猪后，可以产生大量针对猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体，用其制备的疫苗对猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻疾病有良好的保护作用，且SEQ ID NO：1所示核苷酸序列短，制备的重组菌株稳定性好，不包含crp毒力基因，安全性好，临床应用前景优良。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 S_499-789基因扩增。M：DNA Marker III；1,2S_499-789基因扩增；

图2 pMD19-T-S_499-789的鉴定。M：DNA Marker III；1:S_499-789基因扩增；2:pMD19-T-S_499-789双酶切鉴定；

图3 pVAX-S_499-789的鉴定。M：DNA Marker III；1：S_499-789基因扩增；2：pVAX-S_499-789双酶切鉴定；

图4 pVAX-S_499-789表达产物的间接免疫荧光鉴定。A：转染pVAX-S_499-789的COS-7细胞；B：转染pVAX1的COS-7细胞；

图5 pVAX-S_499-789表达产物的免疫印迹鉴定。M：蛋白Marker；1：转染pVAX1的COS-7细胞；2：转染pVAX-S_499-789的COS-7细胞；

图6 SL7207(pVAX-S_499-789)菌株的鉴定。M：DNA Marker III；1：沙门氏菌鉴定；2：S_499-789基因的扩增；3：pVAX-S_499-789的双酶切；4：沙门氏菌鉴定；

图7 重组减毒沙门菌株的生长曲线；

图8 重组沙门菌株的体外稳定性分析；

图9 重组沙门菌株的体内稳定性分析；

图10 RT-PCR检测S基因在小鼠肠道内的转录。M：DNA Marker III；1,2,3,4：接种SL7207(pVAX-S_499-789)1,3,5,7天；5,6,7,8：接种SL7207(pVAX)后1,3,5,7天；

图11 重组沙门氏菌菌株在脾脏和肝脏中的增殖，A是脾脏，B是肝脏；

图12 重组减毒沙门氏菌的小鼠安全性分析。A：肠壁固有层与肌层分离；B：小肠绒毛杯状细胞增多；C：小肠绒毛脱落；D：PBS对照组小鼠回肠切片；

图13 免疫仔猪T淋巴细胞增殖实验(*P<0.01)；

图14 免疫仔猪血清样品中抗PEDV IgG的检测(*P<0.01)；

图15 免疫仔猪黏膜样品中抗PEDV IgA的检测(*P<0.01)；

图16 特异性抗体的病毒中和实验。A血清抗体IgG的病毒噬斑减少分析(*P<0.01)；B黏膜抗体IgA的病毒噬斑减少分析(*P<0.01)；

图17 免疫仔猪血清IFN-γ的测定。A IFN-γ标准品的线性回归方程；B血清中IFN-γ水平的变化(*P<0.01)；

图18 免疫仔猪血清IL-4的测定。A IL-4标准品的线性回归方程；B血清中IL-4水平的变化。 

具体实施方式

实验材料和试剂：

1材料

1.1菌株、毒株及实验动物

猪流行性腹泻病毒疫苗株(CV777株)、猪流行性腹泻病毒株，购自中国兽药监察所或四川农业大学动物传染病室分离保存；大肠杆菌DH5α，购自北京天根生物制品有限公司；减毒鼠伤寒沙门菌SL7207由由德国Helmholtz感染研究中心Kai Schulze教授馈赠， COS-7细胞、Vero细胞均购自武汉大学保藏中心均由实验室提供；pVAX1质粒，购自美国Invitrogen公司；BALB/c小鼠(雌性，6周龄，清洁级)购自成都生物制品研究所，20日龄仔猪购自雅安某无PEDV、TGEV、猪轮状病毒感染史猪场。

1.2主要试剂

兔抗PEDV阳性血清由本室制备保存；限制性内切酶、pMD19-T simple Vector、T4DNA连接酶、反转录试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司产品；RNA抽提试剂盒琼脂糖去内毒素质粒提取试剂盒Endo-Free Plasmid Mini Kit、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自美国OMEGA公司；2×Taq PCR Master Mix、TMB底物溶液、DNA分子量标准等，北京天根生物技术有限公司产品RPMI1640，GIBCO公司产品；小鼠用淋巴细胞分离液，天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品；肝素钠、ConA、MTT，Amresco公司产品；HRP标记的羊抗兔IgG酶标二抗，Sigma公司产品；FITC标记羊抗兔IgG抗体为北京博奥森公司产品；Anti-PEDV IgG检测试剂盒、anti-PEDV IgA检测试剂盒、细胞因子γ-干扰素检测试剂盒、IL-4检测试剂盒，均为美国R&D公司产品。

1.3主要仪器

Legend Micro 17R centrifuge离心机、恒温振荡培养箱，美国Thermo公司产品；ECLIPSE TE 2000-U型荧光倒置显微镜，日本Nickon公司产品；半干转印仪、Gene Pulser Xcell电转仪、MyCyclerTM PCR仪、POWER Pac TM电泳仪及水平电泳槽、UNIVERSAL HOOD凝胶成像系统、SmartspecTM Plus核酸蛋白仪、Model 680酶标仪，美国BIO-RAD公司产品；Water Pro Plus超纯水仪，美国LABCONCO公司产品。

实施例1 本发明重组菌的构建

一、构建方法 

1PEDV S_499-789基因的克隆

1.1引物设计

参照GenBank公布的PEDV的S基因cDNA序列(序列号：KC886306)，利用Primer5.0设计引物如下(表1)，其中P1/P3用于扩增S_499-789基因。引物由大连宝生物工程有限公司合成。

S_499-789基因的扩增引物序列及酶切位点标示

1.2PEDV S₄₉₉₇₈₉基因的扩增

1.2.1PEDV RNA的抽提

以实验室冻存的纯化过的PEDV SC-L株病毒液为材料，参照总RNA抽提试剂盒说明书提取病毒RNA，操作方法如下：

(1)取250μL病毒液于2mL EP管中，加入750μL RZ裂解液，用枪头抽打若干次至溶液透明；

(2)在4℃，12000rpm离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管，加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温静置3min；

(3)在4℃，12000rpm离心10min，样品分为三层，取水相层转移到另一新的EP管中；

(4)缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀后，将溶液和沉淀一起转入吸附柱内，4℃，12000rpm离心30s，弃去收集管内液体；

(5)向CR3吸附柱中加入500μL去蛋白液RD，4℃，12000rpm离心30s，弃去收集管内液体；

(6)向CR3吸附柱中加入700μL去漂洗液RW，4℃，12000rpm离心30s，弃去收集管内液体，重复操作一次；

(7)将吸附柱放入收集管，4℃，12000rpm离心2min，将吸附柱开盖晾干；

(8)将CR3吸附柱转入一个新的1.5mL EP管中，加入30μL RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心2min后，吸出离心后液体，再次洗脱一次。

1.2.2PEDV cDNA的合成

以提取的PEDV病毒液总RNA为模板，以Random 6mers为引物，进行反转录合成cDNA。反转录体系如下：

反转录程序为：37℃反应15min，85℃反应5s。

1.2.3PEDVS_499-789基因的扩增

以反转录合成的cDNA为模板，以P1/P3为引物，利用PCR方法分别进行S_499-789基因的扩增，PCR体系如下：

反应条件为95℃预变性5min；94℃变性30s，54℃复性30s，72℃延伸60s，30 个循环；72℃延伸8min。取10μL PCR产物于10g/L琼脂糖凝胶中80V电压，电泳25min检测目的条带。

1.3PEDV SS_499-789基因的克隆

1.3.1PEDVS_499-789片段的回收

参照小量胶回收试剂盒的使用说明书进行S_499-789片段的回收，主要操作步骤如下：

(1)在凝胶成像系统分析仪下切去大小为500bp、900bp左右的目的条带，称重后，以1mg凝胶加入1μL Binding Buffer的比例加入Binding Buffer，置于55℃烘箱内至凝胶完全溶解；

(2)将溶解后液体混匀，转入吸附柱中，10000×g离心1min，弃去收集管内液体；

(3)向吸附柱中加入300μL Binding Buffer，10000×g离心1min，弃去收集管内液体；

(4)向吸附柱中加入700μL Wash Buffer，10000×g离心1min，弃去收集管内液体，重复操作一次；

(5)将吸附柱放入收集管，12000rpm离心2min，将吸附柱开盖，晾干；

(6)将吸附柱转入一个新的1.5mL EP管中，加入30μL Elution Buffer，室温放置2min，12000rpm离心2min后，吸出离心后液体，再次洗脱一次。于琼脂糖凝胶中电泳检测回收效果。

1.3.2PEDV S_499-789基因与T载体的连接

将胶回收的S_499-789基因片段或者直接合成的的S_499-789基因片段与pMD19-T Simple载体连接，连接体系如下：

将上述反应物混合后，置于16℃下连接过夜，取10μL连接产物转化DH5α感受态细胞。

1.3.3DH5α感受态细胞的制备

(1)挑取大肠杆菌DH5α单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃，220r/min，培养12h至对数生长期；

(2)将种子液以1：100的比列接种于40mL LB液体培养基内，37℃，220r/min，培养至OD₆₀₀值在0.5～0.6时，停止培养；

(3)取10mL菌液置于10mL EP管中，冰浴30min后，4℃，4000rpm离心10min；

(4)弃去上清培养液，每管内加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，重悬细胞，冰浴30min后，4℃，4000rpm离心10min，重复该操作一次；

(5)弃去上清液，用400μL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，重悬细胞，冰上放置片刻，即制备成DH5α感受态细胞。

1.3.4连接产物的转化

(1)取100μL新制备的DH5α感受态细胞，加入10μL连接产物，轻轻混匀后，冰浴30min，后于42℃水浴90s后，将混合产物冰浴2min；

(2)冷却后，加入500μL LB液体培养基，37℃，150r/min，培养45min，使细菌回复正常细胞形态后，取100μL菌液涂布于含100μg/mL Amp的LB固体培养基平板上，37℃培养16h。

1.4克隆重组质粒的鉴定

1.4.1克隆重组质粒的小量提取

随机挑取转化后平板上的单菌落，接种于5mL含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，220r/min培养。按照小量质粒提取试剂盒说明书提取质粒，具体操作如下：

(1)取2mL菌液于EP管内，10000×g离心1min，弃去上清；

(2)向收集菌体中加入250μL Solution I，枪头吹打重悬菌体；

(3)加入250μL Solution II，上下轻轻颠倒混匀，以充分裂解菌体；

(4)加入350μL Solution III，上下轻轻颠倒混匀，使之沉淀均匀出现，13000×g离心10min；

(5)将上清液转入吸附柱中，10000×g离心1min，弃去收集管内液体；

(6)向吸附柱中加入500μL Buffer HB，10000×g离心1min，弃去收集管内液体；

(7)向吸附柱CP3中加入700μL Wash Buffer，10000×g离心1min，弃去收集管内液体，重复操作一次；

(8)将吸附柱CP3放入收集管，12000rpm空离2min，吸附柱开盖，晾干；

(9)将吸附柱CP3转入一个新的1.5mL EP管中，加入40μL Elution Buffer，室温放置2min，12000rpm离心2min后，吸出离心后液体，再次洗脱一次。

1.4.2克隆重组质粒的鉴定

取抽提质粒进行进行Hind III/EcoR I双酶切鉴定，反应体系如下：

于37℃下，反应2h。同时另取上述抽提质粒进行50倍稀释后，进行PCR鉴定，PCR反应体系及反应条件如1.2.3。

将双酶切产物、PCR产物于10g/L琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定阳性质粒送至上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，并与亲本株进行序列比对。将获得质粒命名为pMD-T-S_499-789。

2重组质粒pVAX-S_499-789的构建

2.1真核表达质粒的构建与鉴定

参照2.1.4.1方法抽提质粒pMD-T-S_499-789、pVAX1；参照2.1.4.2方法进行对抽提质粒进行双酶切；参照2.1.3.1方法对目的条带进行胶回收，将胶回收产物按照如下体系进行连接：

将上述反应物混合后，置于16℃下连接过夜，参照2.1.3.2方法，取10μL连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含100μg/mL Kan的LB固体培养基平板，37℃培养16h。

参照2.1.4方法对平板上菌落进行鉴定，筛选PCR鉴定、双酶切鉴定为阳性菌株，命名为DH5α(pVAX-S_499-789)。

2.2真核表达质粒的真核转染与表达

2.2.1真核表达质粒的抽提

将DH5α(pVAX-S_499-789)、DH5α(pVAX1)挑取单菌落接种于5mL含100μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃，220r/min培养。按照去内毒素质粒提取试剂盒说明书提取质粒，具体操作如下：

(1)取2mL菌液于EP管内，10000×g离心1min，弃去上清；

(2)向收集菌体中加入250μL Solution I，枪头吹打重悬菌体；

(3)加入250μL Solution II，温和颠倒4～6次，以充分裂解菌体；

(4)加入125μL预冷的Buffer N3，温和颠倒混匀，产生白色沉淀，12000×g离心10min；

(5)将上清液小心转入干净的1.5mLEP管中，加入0.1倍体积的ETR Solution，轻轻混匀，冰浴10min，冰浴过程中颠倒EP管数次；

(6)将EP管42℃水浴5min，溶液重新变浑浊，12000×g离心3min，ETR Solution在EP管底部形成蓝色沉淀；

(7)将上清转移至新的1.5mLEP管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，温和颠倒6～7次，室温放置1-2min；

(8)转移700μL混合液至HiBind^TM DNAMini吸附柱中，10000×g离心1min，除去滤液，加入剩余混合液，10000×g离心1min；

(9)向吸附柱中加入500μL Buffer HB，10000×g离心1min，弃去液体；

(10)向吸附柱中加入700μL Wash Buffer，10000×g离心1min，弃去收集管内液体，重复操作一次；

(11)将吸附柱放入收集管，12000rpm空离2min，吸附柱开盖，晾干；

(12)将吸附柱转入一个新的1.5mL EP管中，加入40μL无内毒素Elution Buffer，室温放置2min，12000rpm离心2min，吸出离心后液体，再次洗脱。

2.2.2真核表达质粒的转染

复苏COS-7细胞，传代二次后，按照Lipofectamine^TM 2000使用说明书，将去内毒素抽提pVAX-S_499-789、pVAX1质粒进行细胞转染。

2.2.3表达产物的间接免疫荧光鉴定

参照《分子克隆实验指南》分别以兔抗PEDV阳性血清为一抗，以FITC标记的羊抗兔IgG为二抗，通过间接免疫荧光法检测转染的真核质粒pVAX-S_499-789、pVAX1在COS-7细胞内的表达情况。

2.2.4表达产物的Western-blotting鉴定

转染质粒36h后，弃去六孔板中的细胞培养液，用PBS轻轻洗涤细胞3次后，参照《分子克隆实验指南》用L型细胞推挂器刮取细胞收集到离心管内，加入1％Trition-100，进行处理后，12000rpm离心5min，取上清液经15％的凝胶进行SDS-PAGE电泳分离后，将蛋白转印至NC膜上，以兔抗PEDV阳性血清为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，对表达蛋白进行Western-blotting鉴定。

3携带S_499-789基因的减毒沙门氏菌的构建

3.1减毒沙门氏菌SL7207感受态细胞的制备

(1)挑取SL7207单菌落，接种于5mL普通LB液体培养基中，37℃，220r/min过夜培养。 

(2)取种子液按1:100比例接种于20mL的LB液体培养基中，37℃，220r/min培养至OD₆₀₀值在0.5～0.6时，停止培养；

(3)取10mL菌液置于10mL EP管中，冰浴30min后，4℃，4000rpm离心10min；

(4)弃去上清培养液，每管内加入5mL预冷的灭菌去离子水，重悬细胞后，冰浴30min后，4℃，4000rpm离心10min，重复该操作二次；

(5)弃去上清液，用400μL预冷的灭菌去离子水，重悬细胞，冰上放置片刻，即制备成SL7207感受态细胞。

3.2减毒沙门氏菌SL7207的电转化

(1)将电转杯分别在70％、100％乙醇中浸泡过夜，用去离子水反复冲洗内壁，以去除杯子中的离子，晾干后，于紫外灯下照射灭菌30min；

(2)向电转杯内分别加入pVAX-S₄₉₉₇₈₉、pVAX1质粒10μL，并加入新制备的SL7207感受态细胞100μL，枪头轻轻搅动混匀后，冰浴30min；

(3)取出电转杯，擦净外壁的水，放入电极孔中进行电转化，电转参数设置如下：电压2.5kV、电阻200Ω、电容25μF、电击时间3s。

(4)电转结束后，立即加入600μL的LB培养液，吸取菌液转入灭菌EP管内，37℃， 150r/min，培养45min，使细菌恢复正常细胞形态；

(5)将EP管4000rpm离心5min后，弃去600μL上清后，重悬菌体沉淀，取100μL菌液涂布于含Kan的LB固体培养基平板上，37℃培养16h。

3.3重组减毒沙门氏菌的鉴定

随机挑取转化后平板的单菌落，接种于含50μg/mL Kan的LB液体培养基中，待菌液浑浊，按照2.1的方法，利用PCR及双酶切方法鉴定重组菌内质粒，同时利用引物对鼠伤寒沙门氏菌进行菌液PCR鉴定，将鉴定为阳性的菌株命名为SL7207(pVAX-S_499-789)。

二、检测结果 

1PEDV S_499-789基因的克隆

1.1PEDVS_499-789基因的扩增

以抽提PEDV的RNA反转录而成的cDNA为模板，分别利用引物P1/P3进行PCR扩增，PCR产物于10g/L琼脂糖凝胶电泳检测。得到与预期相符合的目的条带，大小约为900bp(见图1)。

1.2克隆重组质粒的鉴定

胶回收片段pMD19-T simple载体连接并转化大肠杆菌DH5α，对所抽提的质粒pMD19-T-S_499-789的PCR鉴定及Hind III/EcoR I双酶切鉴定的电泳条带的大小与预期相符(见图2)。S_499-789的基因测序显示，目的基因长度为873bp，序列分析结果显示与PEDV SC-L株S基因完全相同。

2重组质粒pVAX-S_499-789的构建

2.1携带S基因的真核表达载体的鉴定

胶回收的目的基因片段与质粒pVAX1回收片段连接并转化大肠杆菌DH5α成功，对所抽提质粒pVAX-S_499-789的PCR产物与Hind III/EcoR I双酶切产物片段大小与预期相符(见图3)。证明真核表达载体pVAX-S_499-789构建成功。

2.2表达产物的免疫荧光鉴定

分别将重组真核表达质粒pVAX-S_499-789以脂质体法转染COS-7细胞，并以pVAX1作为对照，转染真核表达质粒36h后，以兔抗PEDV阳性血清为一抗，以FITC标记的羊抗兔IgG为二抗，利用间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达效果。IFA鉴定结果显示：pVAX-S_499-789转染组有特异性绿色荧光，而pVAX1转染组无特异性荧光(见图4)，表明pVAX-S_499-789在COS-7细胞中，可正常表达S_499-789蛋白，且能与PEDV特异性抗体发生反应。

2.3表达产物的Western-blotting鉴定

分别将重组真核表达质粒pVAX-S_499-789及空载体pVAX1转染36h的COS7-细胞产物经SDS-PAGE处理后，将蛋白转移至NC膜，以兔抗PEDV阳性血清为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，进行Western-blotting鉴定。鉴定结果显示出大小38KDa左右的特异性印迹，空载体对照组无特异性印迹(见图5)。

3重组减毒沙门氏菌的鉴定

将构建的重组沙门氏菌扩大培养后，抽提质粒，进行PCR及Hind III/EcoR I双酶切产物条带与预期相符；菌液PCR鉴定菌株为减毒鼠伤寒沙门氏菌(见图6)。证明真核表达载体pVAX-S_499-789成功电转入鼠伤寒减毒沙门菌SL7207，SL7207(pVAX-S_499-789)构建成功。

实验结果说明，本发明通过基因工程的方式，重组表达得到了包含S_499-789基因片段的重组沙门氏菌SL7207(pVAX-S_499-789)。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1本发明重组减毒沙门氏菌的特性鉴定

一、实验方法 

取实施例1制备的重组沙门氏菌SL7207(pVAX-S_499-789)，按照如下方法进行鉴定：

1重组减毒沙门氏菌的生物学特性研究

1.1重组减毒沙门氏菌的生长曲线测定

挑取SL7207(pVAX-S_499-789)单菌落，接种于5mL含100μg/mL Kan的LB液体培养基中，待菌液OD₆₀₀值在0.6时，取1mL接种于100mL含100μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃，100r/min，培养24h，每间隔2h吸取少量菌液，连续倍比稀释后涂布于3个含100μg/mL Kan的LB固体平板上，37℃培养18h后，进行菌落计数，以三个平板上菌落平均数绘制重组减毒沙门氏菌不同菌株生长曲线。

1.2重组减毒沙门氏菌的体外稳定性测定

将挑单活化的SL7207(pVAX-S_499-789)以1:100的比例接种于普通LB液体培养基中，37℃100r/min振荡培养。于培养后24h分别取100μL菌液利用灭菌PBS溶液进行适当稀释，取稀释菌液100μL分别涂布3个含100μg/mL Kan和3个不含Kan的LB固体培养基平板，37℃培养16h后进行菌落计数。另取50μL菌液接种于5mL普通LB液体培养基中，继续传代培养24h后，重复此操作，连续重复7次。根据含100μg/mL Kan和3个不含Kan的LB固体培养基平板的菌落平均数，测定非抗性条件下重组减毒沙门氏菌携带质粒的稳定性。

1.3重组减毒沙门氏菌的体内稳定性测定及目的基因转录分析

1.3.1接种用菌液的制备与小鼠接种

(1)挑取SL7207(pVAX-S_499-789)、SL7207(pVAX)单菌落接种于5mL含100μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃，220r/min过夜培养。

(2)取1mL菌液接种于100mL含100μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃，220r/min培养至菌液OD₆₀₀值约为0.8时，停止培养；

(3)将菌液4000rpm离心10min收集菌体，以含5％NaHCO₃的灭菌PBS重悬菌体 浓度为5×10⁹CFU/mL备用；

(4)将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成3组，每组12只，灌胃接种前禁水禁食5h，使用小鼠灌胃针以1×10⁹CFU/只的剂量分组别分别灌胃接种小鼠，免疫1h后恢复饮水与饲喂。

1.3.2重组减毒沙门氏菌的体内稳定性测定

口服灌胃接种重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX-S_499-789)、SL7207(pVAX)后1，3，5，7天，每组分别捕杀小鼠三只，取小鼠回肠、肝脏、脾脏各1g左右，置于2mL含于含0.1％Triton的PBS溶液中研磨静置10min后，分别取100μL组织悬浮液涂布于含100μg/mL Kan和不含Kan的SS平板上，37℃培养16h后，进行菌落计数，根据含100μg/mL Kan和不含Kan的SS平板上菌落数，分析重组菌株在小鼠体内的稳定性。

1.3.3目的基因的体内转录分析

口服灌胃接种重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX-S_499-789)、SL7207(pVAX)后1，3，5，7天后，每组分别捕杀小鼠三只，取派伊尔氏节较为集中的回肠末端约200mg，加入液氮中研磨，参照2.1.2的方法采用RT-PCR检测分析目的基因在回肠组织内的转录情况。

1.4重组减毒沙门氏菌的体内增殖测定及安全性分析

1.4.1小鼠的分组与接种

将6周龄雌性BALB/c随机分成3组，每组15只，参照1.3.1方法制备接种菌液并分组别灌胃接种小鼠，二周后再次接种一次。

1.4.2重组减毒沙门氏菌在小鼠体内的增殖测定

口服灌胃接种重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX-S_499-789)、PBS后1，2，3，4，5周，每组分别捕杀小鼠三只，取小鼠肝脏、脾脏各1g左右，置于2mL含于含0.1％Triton的PBS溶液中研磨静置10min后，分别取100μL组织悬浮液涂布于含100μg/mL Kan的SS平板上，37℃培养16h后，进行菌落计数，根据SS平板上菌落数，分析重组菌株在小鼠体内的增殖及消减情况。

1.4.3重组减毒沙门氏菌的安全性评估

口服灌胃接种重组减毒沙门氏菌、SL7207(pVAX-S_499-789)、PBS后，每天观察小鼠的精神状态、食欲、饮欲有无异常，连续观察35d；首次灌胃接种后1，2，3，4，5周后，每组分别捕杀小鼠三只，剖检观察小鼠小肠、肝脏、脾脏、肾脏等器官有无明显病变；首次灌胃接种后第3周，采集小鼠回肠，于4％甲醛中固定，用于制备组织切片，观察其病理变化，切片制备方法如下：

(1)将固定的肠道样品依次置于75％乙醇溶液、85％乙醇溶液、95％乙醇溶液、100％乙醇溶液分别浸泡处理12h后；依次置于100％乙醇溶液I、100％乙醇溶液II分别浸泡处理2h；依次置于二甲苯I、二甲苯II各1h浸泡处理，置换酒精，使得组织块变得透明；

(2)依次使用甲苯石蜡、纯石蜡处理组织块，最后将组织块包埋于石蜡中；

(3)利用组织切片机将组织切成5μm～6μm厚的薄片，然后将其粘附于载玻片上，37℃温箱作用24h；

(4)将切片依次置于二甲苯I、二甲苯II各10min浸泡处理，再经100％乙醇溶液I、100％乙醇溶液II分别浸泡处理5min，95％乙醇溶液浸泡处理3min，最后在流水作用下处理2min，吸水纸吸干；

(5)使用苏木精和伊红染色后封片，光学显微镜下观察组织病理变化情况。

2重组减毒沙门氏菌的免疫学特性研究

2.1仔猪的分组及免疫

15头25日龄仔猪随机分成五组，每组三头，正常饲养二天后，免疫前夜禁水禁食，免疫前灌胃口服50mL 5％NaHCO₃，以中和胃酸。口服灌胃免疫接种1×10¹²CFU的重组SL7207(pVAX-S_499-789)，SL7207(pVAX)和PBS，另外一组仔猪肌肉注射商品化PEDV灭活苗1mL，免疫后1h恢复饮水与饲喂；二周后加强免疫一次。

2.2样品的采集 

(1)血液样品的采集与处理：在各组仔猪免疫后第0，2，4，6周分别对仔猪进行前腔静脉采血，取一部分血液于4℃过夜析出血清，分装于小EP管，-20℃保存；另取少量血液加入肝素钠抗凝剂，用于进行外周血淋巴细胞的增殖实验；

(2)黏膜样品的采集与处理：在各组仔猪免疫后第0，2，4，6周，利用棉签拭子分别采集仔猪直肠黏液，充分溶解于1mL含0.01M EDTA-Na₂的PBS缓冲液中，4℃离心12000rpm离心10min后，取上清-45℃冻干后溶解于200μL灭菌去离子水中，分装于小EP管，-20℃保存。

2.3外周血T淋巴细胞增殖实验

(1)在无菌操作台内，取0.5mL抗凝血与等剂量的PBS缓冲液混匀后，缓慢滴加于1mL外周血淋巴细胞分离液液面之上，室温下1500rpm离心15min；

(2)离心后，溶液共分为四层，取环状乳白色淋巴细胞层转入新的EP管中，加入PBS重悬洗涤后，以1800rpm离心10min，去除上清后，分别利用PBS及不完全RPMI1640各洗涤一次，最后利用完全RPMI1640将细胞稀释为5×10⁶个/mL的单细胞悬液；

(3)取单细胞悬液100μL分别加入96孔细胞培养板内，每个样品做三个重复，然后加入100μL 50μg/mL的ConA溶液，轻轻混匀后，于5％CO₂，37℃条件下培养68h；

(4)每孔内加入10μL体积浓度为5mg/mL的MTT，继续培养4h；

(5)每孔中加入100μL DMSO终止反应，震荡5min后，测定各孔OD₄₉₀值。

2.4血清抗体IgG的测定

使用商品化PEDV-IgG ELISA试剂盒利用双抗体一步夹心法检测血清中抗PEDV IgG水平。操作严格按照试剂盒使用说明书，具体操作步骤如下：

(1)从-20℃冰箱中取出待测血清样品，室温解冻，从4℃冰箱中取出抗体检测试剂盒，室温平衡20min；

(2)从铝箔袋中取出96孔板，待测样品孔中加入待测样品10μL，再加入样品稀释液40μL；

(3)待测样品孔中分别加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体50μL，用封板膜封住反应孔，置于湿盒内，37℃恒温箱孵育60min；

(4)弃去液体，吸水纸拍干，每孔加满洗涤液，震荡1min，甩去洗涤液，吸水纸拍干，如此重复洗涤五次；

(5)每孔避光加入底物A、B各50μL，置于湿盒内，37℃避光孵育15min；

(6)所有孔中加入终止液50μL，测定各孔OD₄₅₀值。

2.5黏膜抗体IgA的测定

使用商品化PEDV-IgA ELISA试剂盒利用双抗体一步夹心法检测血清中抗PEDV IgA水平。操作严格按照试剂盒使用说明书，具体操作步骤如下：

(1)从-20℃冰箱中取出待测血清样品，室温解冻，从4℃冰箱中取出抗体检测试剂盒，室温平衡20min；

(2)从铝箔袋中取出96孔板，待测样品孔中加入待测样品10μL，再加入样品稀释液40μL；

(3)待测样品孔中分别加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体50μL，用封板膜封住反应孔，置于湿盒内，37℃恒温箱孵育60min；

(4)弃去液体，吸水纸拍干，每孔加满洗涤液，震荡1min，甩去洗涤液，吸水纸拍干，如此重复洗涤五次；

(5)每孔避光加入底物A、B各50μL，置于湿盒内，37℃避光孵育15min；

(6)所有孔中加入终止液50μL，测定各孔OD₄₅₀值。

2.6特异性抗体的病毒中和实验

采用固定病毒-稀释血清法测定血清抗体IgG、黏膜抗体IgA对病毒的中和能力，主要操作如下：

(1)将血清样品和黏膜样品于56℃处理30min后，-80℃保存备用； 

(2)将Vero细胞接种于96孔板，5％CO₂，37℃条件下培养至生长为单层细胞；

(3)将稀释为100TCID₅₀/100μl的PEDV与1:2、1:8、1:32、1:128、1:512稀释的血清37℃作用1h，同时设立病毒与细胞对照孔；

(4)将混合物接种至单层细胞上，37℃作用1h后，弃去混合物，加入1％的甲基纤维素继续培养48h，观察其致细胞病变效应CPE，对CPE进行计数，采用减数噬斑法计算病毒抑制率。

病毒抑制率＝(病毒对照孔CPE-待测样品孔CPE)/(病毒对照孔CPE-细胞对照孔CPE)×100％。

2.7免疫仔猪血清IFN-γ的测定

使用商品化猪IFN-γELISA试剂盒利用生物素双抗体夹心法检测血清中IFN-γ水平。 操作严格按照试剂盒使用说明书，具体操作步骤如下：

(1)从-20℃冰箱中取出待测血清样品，室温解冻，从4℃冰箱中取出抗体检测试剂盒，室温平衡20min；

(2)将标准品进行连续倍比稀释，稀释的终浓度分别为1200pg/mL、600pg/mL、300pg/mL、150pg/mL、75pg/mL；

(3)从铝箔袋中取出96孔板，标准孔内加入标准品50μL，链霉素-HRP 50μL，待测样品孔中加入待测样品40μL，抗IFN-γ抗体10μL，链霉素-HRP 50μL，空白孔什么都不加；用封板膜封住反应孔，置于湿盒内，37℃恒温箱孵育60min；

(4)弃去液体，吸水纸拍干，每孔加满洗涤液，震荡1min，甩去洗涤液，吸水纸拍干，如此重复洗涤五次；

(5)每孔避光加入底物A、B各50μL，置于湿盒内，37℃避光孵育15min；

(6)所有孔中加入终止液50μL，测定各孔OD₄₅₀值。

(7)根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准品的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应浓度。

2.8免疫仔猪血清IL-4的测定

使用商品化猪IL-4ELISA试剂盒利用生物素双抗体夹心法检测血清中IL-4水平。操作严格按照试剂盒使用说明书，具体操作步骤如下：

(1)从-20℃冰箱中取出待测血清样品，室温解冻，从4℃冰箱中取出抗体检测试剂盒，室温平衡20min；

(2)将标准品进行连续倍比稀释，稀释的终浓度分别为800pg/mL、400pg/mL、200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL；

(3)从铝箔袋中取出96孔板，标准孔内加入标准品50μL，链霉素-HRP 50μL，待测样品孔中加入待测样品40μL，抗IL-4抗体10μL，链霉素-HRP 50μL，空白孔什么都不加；用封板膜封住反应孔，置于湿盒内，37℃恒温箱孵育60min；

(4)弃去液体，吸水纸拍干，每孔加满洗涤液，震荡1min，甩去洗涤液，吸水纸拍干，如此重复洗涤五次；

(5)每孔避光加入底物A、B各50μL，置于湿盒内，37℃避光孵育15min；

(6)所有孔中加入终止液50μL，测定各孔OD₄₅₀值。

(7)根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准品的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应浓度。

3实验数据的分析

实验数据使用GraphPad Prism 5软件(GraphPad software Inc.,San Diego.CA)进行分析处理；组间差异利用ANOVA方法进行分析，组间差别P<0.05判定为差异显著，P<0.01判定为差异极显著。

二、实验结果 

1重组减毒沙门氏菌的生物学特性研究

1.1重组减毒沙门氏菌的生长曲线测定

重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX-S_499-789)菌株的生长曲线测定结果显示：重组沙门菌在接种第4h后迅速进入对数生长期；在培养第6-16h时，为细菌生长稳定期；于接种16h后，细菌开始进入衰亡期。不同重组减毒沙门氏菌株的生长曲线结果相近(见图7)。

1.2重组减毒沙门氏菌的体外稳定性测定

重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX-S_499-789)菌株的体外培养稳定性实验表明，在不含Kan抗性的培养环境下，重组沙门氏菌中的质粒随着细菌的增殖而逐渐丢失，在连续培养4d后(传代约100代)，质粒携带率降至50％以下；连续培养7d时(传代约175代)，SL7207(pVAX-S_499-789)仍均保持在6％以上；不同重组减毒沙门氏菌株的体内稳定性相近(见图8)。

1.3重组减毒沙门氏菌的体内稳定性测定及目的基因转录分析

1.3.1重组减毒沙门氏菌的体内稳定性测定

重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX-S_499-789)菌株的小鼠体内稳定性显示：随着重组沙门氏菌株在小鼠体增殖，菌体携带的质粒也逐渐稳定丢失。在免疫后第7天，重组菌株质粒携带率为50％，不同重组减毒沙门氏菌株的体内稳定性相近(见图9)。

1.3.2目的基因的体内转录分析

小鼠灌胃接种SL7207(pVAX-S_499-789)菌株后第1，3，5，7天采集回肠末端，提取细胞总RNA，通过RT-PCR检测抗原基因在组织内的转录情况，结果显示在免疫后第3，5，7天可扩增出预期片段；对照组PBS免疫小鼠肠道总RNA的RT-PCR结果为阴性(见图10)。

1.4重组减毒沙门氏菌的体内增殖测定及安全性分析

1.4.1重组减毒沙门氏菌的体内稳定性测定

脏器悬液菌落计数显示，在首次免疫后第一周，不同菌株免疫组小鼠肝、脾内均可分离到重组细菌；首免后第二周，菌落数有所下降；二次免疫后第一周，菌落数略微上升后急剧下降，二免后第三周脾脏中的菌落数为零。这表明重组沙门氏菌完成质粒传递后，逐渐被机体清除，不同重组减毒沙门氏菌株的体内稳定性相近(见图11、图11B)。

1.4.2重组减毒沙门氏菌的小鼠安全性分析

连续5周对各组试验小鼠进行观察，灌胃后的1～2d，由于应激反应，部分小鼠出现扎堆、精神不振和食欲降低的现象；继续观察，小鼠的食欲、饮欲和精神状况逐渐恢复正常。解剖小鼠，重组减毒沙门菌菌株免疫组小鼠与PBS对照组小鼠的肝、脾及小肠等器官均未见明显病理变化。回肠组织病理切片显示：回肠组织出现肠壁固有层与肌层分离；小肠绒毛脱落变短；小肠绒毛上皮细胞减少，杯状细胞增多等病理变化(见图12)。

2.1外周血T淋巴细胞增殖实验

使用MTT法对免疫仔猪外周血T淋巴细胞增殖进行测定，结果显示仔猪免疫后2，4， 6周，SL7207(pVAX-S_499-789)、PEDV灭活苗和SL7207(pVAX)免疫组仔猪外周血T淋巴细胞增殖能力逐渐增强。

在首免后2～6周，PEDV灭活苗免疫组T淋巴细胞增殖能力高于SL7207(pVAX-S_499-789)免疫组，且差异极显著(P<0.01)；SL7207(pVAX)免疫组T淋巴细胞增殖能力高于PBS免疫组，且差异极显著(P<0.01)(见表1，图13)。

表1免疫仔猪外周血T淋巴细胞的增殖情况

2.2血清抗体IgG的测定

使用ELISA检测试剂盒对免疫仔猪血清样品中抗PEDV IgG值进行测定，结果显示仔猪免疫后2，4，6周SL7207(pVAX-S_499-789)、PEDV灭活苗免疫组血清样品中抗PEDV IgG值逐渐增高。

在首免后2～6周，PEDV灭活苗免疫组血清样品中抗PEDV IgG值高于SL7207(pVAX-S_499-789)免疫组，且差异极显著(P<0.01)(见表2，图14)。

表2免疫仔猪血清样品中抗PEDV IgG的检测

2.3黏膜抗体IgA的测定

使用ELISA检测试剂盒对免疫仔猪黏膜样品中抗PEDV IgA值进行测定，结果显示仔猪免疫后2，4，6周，SL7207(pVAX-S_499-789)免疫组黏膜样品中抗PEDV IgA值逐渐增高。

在首免后4～6周，SL7207(pVAX-S_499-789)免疫组黏膜样品中抗PEDV IgA值高于PEDV灭活苗免疫组，且差异极显著(P<0.01)(见表3，图15)。

表3免疫仔猪黏膜样品中抗PEDV IgA的检测

2.4特异性抗体的病毒中和实验

病毒噬斑减少分析免疫仔猪血清样品中抗PEDV IgG的病毒中和活性，结果显示随着免疫后第6周血清样品稀释倍数的增加，抗体对病毒的抑制逐渐减弱，在1:2、1:8、1:32、1:128、1:512稀释度时，PEDV灭活苗免疫组血清IgG中和活性高于SL7207(pVAX-S_499-789)免疫组，且差异极显著(P<0.01)；

在1:2、1:8、1:32、1:128稀释度时SL7207(pVAX-S_499-789)免疫组血清IgG中和活性高于SL7207(pVAX)、PBS免疫组，且差异极显著(P<0.01)(见表4A，图16A)。

表4A血清抗体IgG的病毒噬斑减少分析

病毒噬斑减少分析免疫仔猪黏膜样品中抗PEDV IgA的病毒中和活性，结果显示随着 仔猪免疫后第6周黏膜样品稀释倍数的增加，对病毒的抑制逐渐减弱，其中，在1:2、1:8、1:32、1:128稀释度时，SL7207(pVAX-S_499-789)免疫组黏膜IgA中和活性显著高于PEDV灭活苗、SL7207(pVAX)、PBS免疫组，且差异极显著(P<0.01)；在1:2、1:8稀释度时，PEDV灭活苗免疫组黏膜IgA中和活性显著高于SL7207(pVAX)、PBS免疫组，且差异极显著(P<0.01)(见表4B，图16B)。

表4 B黏膜抗体IgA的病毒噬斑减少分析

2.5免疫仔猪血清IFN-γ的测定

使用IFN-γELISA检测试剂盒对免疫仔猪血清样品IFN-γ进行测定，得到IFN-γ标准浓度的线性回归方程，该方程式为y＝0.0011x+0.1129，R²＝0.9666(见图17A)。根据该线性回归方程计算出待测样品的浓度(见表5)。结果显示仔猪免疫后2，4，6周，SL7207(pVAX-S_499-789)、PEDV灭活苗和SL7207(pVAX)免疫组仔猪血清样品IFN-γ水平逐渐上升。在首免后2～6周，PEDV灭活苗免疫组血清样品IFN-γ水平高于SL7207(pVAX-S_499-789)免疫组，且差异极显著(P<0.01)；SL7207(pVAX)免疫组血清样品IFN-γ水平高于PBS免疫组，且差异极显著(P<0.01)(图17B)。

表5血清中IFN-γ水平的变化

2.6免疫仔猪血清IL-4的测定

使用IL-4ELISA检测试剂盒对免疫仔猪血清样品IL-4进行测定，得到IL-4标准浓度的线性回归方程，该方程式为y＝0.0018x+0.2235，R²＝0.9206(见图18A)。根据该线性回归方程计算出待测样品的浓度(见表6)。结果显示仔猪免疫后2，4，6周，SL7207(pVAX-S_499-789)、PEDV灭活苗、SL7207(pVAX)和PBS免疫组仔猪血清样品IL-4水平稳定，基本保持在90±10pg/mL的范围内浮动，变化幅度极小。 各免疫组间差异不显著(图18B)。

表6血清中IL-4水平的变化

综上，本发明采用基因工程的方式成功的构建了包含S_499-789基因片段的重组沙门氏菌SL7207(pVAX-S_499-789)，该重组菌具有良好的免疫原性，口服免疫后产生的猪流行性腹泻病毒特异性抗体水平高，保护性强，可以制备成为疫苗，临床应用前景良好。

Claims (8)

1.一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是重组pVAX1。

4.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2或者3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为重组沙门氏菌或重组大肠杆菌。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述的重组沙门氏菌为重组减毒沙门氏菌SL7207。

7.一种重组蛋白，其特征在于：它是由权利要求1所述核苷酸序列编码。

8.根据权利要求7所述的重组蛋白，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。