CN104666320B - 曲札茋苷在制备治疗癌症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及曲札茋苷在制备治疗癌症药物中的应用。本发明通过MTT法测试曲札茋苷对12株体外培养的人体肿瘤细胞及1株人体正常细胞的细胞毒作用，发现曲札茋苷对人肺癌细胞株、人肠癌细胞株、人白血病细胞株、人胃癌细胞株和人乳腺癌细胞株的增殖有较好的抑制效果，并且对人体正常细胞的增殖没有抑制作用。本发明还测试了曲札茋苷对人体肺癌细胞株A549裸鼠移植瘤的疗效，结果表明：曲札茋苷连续静脉注射14天后对人体肺癌A549裸鼠移植瘤的增殖有明显的抑制作用，量效关系明显。

Description

曲札茋苷在制备治疗癌症药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物制备技术领域，特别涉及曲札茋苷在制备治疗癌症药物中的应用。

背景技术

拉萨大黄属蓼科大黄属植物，产于西藏东部、四川等地，生于海拔4200-4600米山坡草地，是藏族民间用草药，藏名为曲札，具有重要的药用价值。专利CN101244129A对拉萨大黄的化学成分和生物活性进行了研究，发现拉萨大黄具有高含量的二苯乙烯类化合物，以二苯乙烯类化合物为主要成分的提取物具有预防和治疗心脑血管疾病的作用。

曲札茋苷是一种二苯乙烯类化合物，从拉萨大黄中提取得到，含量为3%-5%，还可以从芋大黄、河套大黄和华北大黄中提取获得或化学合成获得。化学名称为：（E）-1-(3，5-二羟苯基)-2-（3-羟基-4-ο-β-D-吡喃葡萄糖苯基）乙烯，分子式：C₂₀H₂₂O₉，分子量为406.13，化学结构如式Ⅰ所示：

由于曲札茋苷的糖苷取代位于非间位羟基取代的苯环上，而且分子中含有较多酚羟基，上述结构特性使其具有特殊的活性。专利CN101787061A研究表明，曲札茋苷具有较强的清除DPPH自由基的能力，这使其在保护缺血性心脑组织损伤中更具优势。曲札茋苷的提取物和纯品能明显降低冠状动脉结扎致心肌缺血大鼠血清CK-MB及LDH的释放，减小心肌梗死的范围，抑制血小板凝集，提示其对心肌缺血有明显保护作用；动物试验表明，曲札茋苷可以明显减少MCAO大鼠脑梗塞范围，使其行为障碍程度得到明显改善，对缺血性心脑血管疾病具有显著的保护作用；安全性试验表明曲札茋苷的安全性良好。因此报道了曲札茋苷在制备预防和治疗心脑缺血药物方面的用途。此后，专利CN102276666A对此化合物进一步研究，开发了一种生物利用度高的曲札茋苷的晶型，而且提供了以此晶型的曲札茋苷为有效成分的预防和治疗心脑缺血疾病的药物。但曲札茋苷其他方面尤其是在治疗癌症方面的医药用途至今未见报道。

癌症是一大类恶性肿瘤的统称，血癌也称白血病，是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。癌细胞可以无限制、无止境地增殖，使患者体内的营养物质被大量消耗，同时癌细胞释放出多种毒素，使人体产生一系列症状，因此癌症严重危害着人类的健康。世界卫生组织调查表明癌症患者正在逐年增加，我国癌症年发病人数在120万左右，每年死于癌症的人数高达90万人以上，现已成为仅次于心血管病的第二大杀手，攻克癌症一直是世界瞩目的研究课题。科学研究发现，癌症发生的主要机制为细胞的异常增殖和细胞分化受抑制。细胞的增殖受到药物、放射线等多种因素的影响，可以用药物治疗、放射治疗、手术治疗等多种方法治疗癌症，其中药物治疗是首选方法。药物治疗与其他治疗方法相配合，可以大大提高癌症的治疗效果，并有效地控制癌细胞的扩散和转移。临床用于癌症治疗的药物种类较多，但多数药物长期服用，副作用让病人难以忍受，而且长期服用一种药物容易使癌细胞产生耐药性，从而易导致癌症的复发，因此，新的抗癌药物的研发具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了曲札茋苷在制备治疗癌症药物中的应用。本发明通过体外肿瘤细胞毒性试验和动物移植瘤试验发现：曲札茋苷可以较好的抑制人体多种癌细胞的增殖，且对正常细胞的增殖未造成影响；因此，本发明提供了曲札茋苷作为制备治疗癌症药物的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了曲札茋苷在制备治疗癌症药物中的应用。

本发明首先通过MTT法测试曲札茋苷对12株体外培养的人体肿瘤细胞及1株人体正常细胞的细胞毒作用，发现曲札茋苷对人肺癌细胞株（A549、95-D）、人肠癌细胞株（HCT116、colo205）、人白血病细胞株（HL-60、CCRF-CEM）、人胃癌细胞株（BGC-823）和人乳腺癌细胞株（ZR-75-30）的增殖有较好的抑制效果，而且对人体正常细胞（MRC-5）的增殖没有抑制效果。

MTT法也称比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等，是一种灵敏度高、经济的筛选方法。

在MTT法检测之后，本发明将曲札茋苷抑制增殖效果较好的A549人肺癌细胞株用于裸鼠移植瘤模型的构建，并将构建好的A549裸鼠移植瘤模型进行曲札茋苷疗效的检测，检测结果显示：曲札茋苷连续静脉注射14天后对人体肺癌A549裸鼠移植瘤的增殖有明显的抑制作用，量效关系明显。

在抗肿瘤新药的筛选中，裸鼠移植瘤是必备的动物模型，所以建立细胞的裸鼠移植瘤模型是筛选新药的必备条件。裸鼠移植瘤模型有皮下接种、腹腔接种和原位移植等几种，因皮下接种操作简单，创伤小，肿瘤表浅易于观察，多采用此法建立模型。

以上结果显示，曲札茋苷可以有效地抑制癌细胞的增殖，因此，本发明提供了曲札茋苷制备治疗癌症药物的应用。

优选的，所述癌症为肺癌、肠癌、胃癌、血癌或乳腺癌。本发明所述的曲札茋苷还可以用于本试验没有测试但也有抑制作用的癌症的治疗。

为了达到治疗癌症的目的，作为优选的，1kg人体中曲札茋苷的有效剂量为2.0～10mg，即1kg人体中摄入2.0～10mg的曲札茋苷可以减缓或抑制癌细胞的增殖，或能杀灭癌细胞；更优选的，1kg人体中曲札茋苷的有效剂量为2.5～10mg。

作为优选，药物包含曲札茋苷及药学上可接受的辅料，曲札茋苷在药物中的重量百分含量为大于0，小于等于100%的任意数值。

作为优选，曲札茋苷在药物中的重量百分含量为1%～99%。

作为优选，曲札茋苷在药物中的重量百分含量15%～90%。

更优选的，曲札茋苷在药物中的重量百分含量为50%～66.7%。

作为优选，药物的剂型为经胃肠道给药剂型或非经胃肠道给药剂型。

更优选的，经胃肠道给药剂型为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂或混悬剂。

更优选的，非经胃肠道给药剂型为注射给药剂型、呼吸道给药剂型、皮肤给药剂型、粘膜给药剂型或腔道给药剂型。

更优选的，注射给药剂型为注射液或粉针剂；呼吸道给药剂型为喷雾剂、气雾剂或粉雾剂；皮肤给药剂型为溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂或贴剂；粘膜给药剂型为滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂、粘贴片剂或贴膜剂；腔道给药剂型为栓剂、气雾剂、泡腾片剂、滴剂或滴丸剂。

本发明提供的曲札茋苷的给药途径为经胃肠道给药或非经胃肠道给药途径；其中非胃肠道给药为注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药或腔道给药；注射给药为静脉注射给药、肌肉注射给药、皮下注射给药、皮内注射给药或腔内注射给药；腔道给药为直肠给药、阴道给药、尿道给药或耳道给药。

本发明提供了曲札茋苷在制备治疗癌症药物中的应用。本发明通过MTT法测试曲札茋苷对12株体外培养的人体肿瘤细胞及1株人体正常细胞的细胞毒作用，根据试验数据计算出受试药物曲札茋苷、阳性对照DOX、阴性对照羟丙基-β-环糊精对人体肿瘤细胞和1株人体正常细胞作用72h后的IC₅₀值，将三者IC₅₀值对比后发现：受试药物曲札茋苷可以较好地抑制人肺癌细胞株（A549、95-D）、人肠癌细胞株（HCT116、colo205）、人白血病细胞株（HL-60、CCRF-CEM）、人胃癌细胞株（BGC-823）和人乳腺癌细胞株（ZR-75-30）的增殖，而且对人正常细胞的增殖没有抑制作用；本发明还进行了曲札茋苷对人体肺癌细胞株A549裸鼠移植瘤的疗效测试，测试结果表明：曲札茋苷在剂量100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg时连续尾静脉注射14天，对人体肺癌A549的相对肿瘤增殖抑制率分别为79.47%、56.45%、33.88%；阳性对照CTX在剂量30mg/kg时连续尾静脉注射7天，对人体肺癌A549的相对肿瘤增殖抑制率为84.88%。由此可见，曲札茋苷在剂量为100mg/kg时连续尾静脉注射14天对肿瘤细胞的抑制效果和阳性对照相似，即曲札茋苷剂量为100mg/kg时连续静脉注射14天，对人体肺癌A549裸鼠移植瘤的增殖有明显的抑制作用，量效关系明显。因此，本发明提供了曲札茋苷作为制备治疗癌症药物的应用。

具体实施方式

本发明提供了曲札茋苷在制备治疗癌症药物中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的曲札茋苷在制备治疗癌症药物中应用的检测试验中，所用原料的来源如下：

受试药物：曲札茋苷，由昆明制药集团股份有限公司提供，昆明制药集团股份有限公司生产，产品批号为20121031-01；

阳性对照药物：阿霉素（DOX），由浙江海正药业股份有限公司生产；规格：原料药；性状：红色粉末；

阳性对照药物：环磷酰胺（CTX）；由江苏恒瑞医药股份有限公司生产；规格：200mg/瓶；批号：11031921；

溶剂辅料：羟丙基-β-环糊精，由昆明制药集团股份有限公司提供，批号：20121205；性状：白色粉末；

细胞株：A549（人肺腺癌细胞株）、HCT116（人肠癌细胞株）、colo205（人肠癌细胞株）、HL-60（人白血病）、BGC-823（人胃癌细胞株）、CCRF-CEM（人白血病）、MDA-MB-231（人乳腺癌细胞株）、HepG2（人肝癌细胞株）、95-D（人肺癌细胞株）、ZR-75-30（人乳腺癌细胞株）、PANC-1（人胰腺腺癌细胞株）、PC-3（人前列腺癌细胞株）和MRC-5（正常人胚肺细胞株）；以上细胞株均由实验室液氮保存和传代；

动物：裸鼠；品系：BALB/C裸鼠（SPF级）；来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司；生产许可证号：SCXK（沪）2008-0016；使用许可证号：SYXK（沪）2009-0068；性别：雄性；体重：18-20g；

移植性肿瘤：人体肺癌A549，本实验室保种；

仪器：全波长多功能酶标仪：型号：Varioskan Flash；生产厂商：Thermoscientific；

其他材料：DMEM培养基（GIBCO产品）、进口胎牛血清（LifeTechnologies Corporation New Zealandlimited）、细胞消化液（Trypsin+EDTA）（，Life Technologies Corporation New Zealandlimited）、PBS(-)（，Life Technologies Corporation NewZealandlimited）、MTT（5mg/mL）（，LifeTechnologies Corporation New Zealandlimited）、细胞溶解液（50mM Tris-HCl pH7.4、150mM NaCl、1mM PMSF、1mM EDTA、5μg/ml Aprotinin、5μg/ml Leupeptin、1%Triton x-100、1%Sodium deoxycholate、0.1%SDS）；

药物辅料：玉米淀粉、羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、β-环糊精、蔗糖粉、滑石粉、泊洛沙姆、明胶、葡萄糖粉、苯甲醇、阿拉伯胶、吐温-60、甘油、蒸馏水、乙基纤维素均由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1MTT法检测曲札茋苷对体外培养的人体肿瘤细胞和人体正常细胞的细胞毒作用

分别取对数生长期的A549、HCT116、colo205、HL-60、BGC-823、CCRF-CEM、MDA-MB-231、HepG2、95-D、ZR-75-30、PANC-1、PC-3和MRC-5细胞，贴壁细胞先消化后用新鲜培养液配制成4-5×10⁴个/mL，96孔板各孔加100μL，置于37℃，5%CO₂培养箱内培养。24h后加样品，分别将受试样品曲札茋苷、阳性对照阿霉素（DOX）和溶剂辅料羟丙基-β-环糊精用PBS(-)稀释，稀释至最终浓度为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001μg/mL，稀释后加入各孔内（10μL/孔），同一样品同一浓度设3复孔。继续培养72h后，每孔加5mg/mL的MTT溶液20μL，置培养箱内4h后，每孔加100μL溶解液，培养箱内过夜。次日，用全波长多功能酶标仪测570nm处OD值。通过计算细胞生长抑制率，计算出IC₅₀（半数抑制浓度）。试验重复进行2次。

试验结果如表1所示。

表1曲札茋苷、DOX、溶剂辅料分别作用72h后对12株人体肿瘤细胞和1株人正常细胞的IC₅₀(μg/mL)值

根据表1中数据可知：曲札茋苷作用72h后，对人肺癌细胞株（A549、95-D）、人肠癌细胞株（HCT116、colo205）、人白血病细胞株（HL-60、CCRF-CEM）、人胃癌细胞株（BGC-823）和人乳腺癌细胞株（ZR-75-30）的IC₅₀与阳性对照DOX相比略高，但远远小于溶剂辅料，因此，曲札茋苷对上述细胞的增殖具有较好的抑制效果，而且，根据重复试验可知，试验重现性良好。

曲札茋苷作用72h后，对MDA-MB-231（人乳腺癌细胞株）、HepG2（人肝癌细胞株）、PANC-1（人胰腺腺癌细胞株）、PC-3（人前列腺癌细胞株）的IC₅₀值均大于100，未显现出对上述细胞增殖的抑制活性。

曲札茋苷作用72h后对MRC-5（正常人胚肺细胞株）的IC₅₀值大于100，说明此药物对于人体正常细胞的增殖没有抑制作用。

综上所述，本发明发现了曲札茋苷对人肺癌细胞株（A549、95-D）、人肠癌细胞株（HCT116、colo205）、人白血病细胞株（HL-60、CCRF-CEM）、人胃癌细胞株（BGC-823）和人乳腺癌细胞株（ZR-75-30）的增殖有较好的的抑制效果，而且对人体正常细胞的增殖没有抑制作用，因此，曲札茋苷可以用于制备治疗癌症的药物。

实施例2曲札茋苷对人体肿瘤裸鼠异种移植模型的疗效

取生长良好的A549实体瘤，无菌条件下切割成约3mm大小的均匀小块，用套管针在每只裸鼠右腋皮下接种一块。接种后13天根据肿瘤大小重新分组，淘汰肿瘤过大和过小的裸鼠，每组肿瘤平均体积基本一致，设以下5组：

空白对照组：灭菌生理盐水（0.9%氯化钠注射液）；（25mL/kg，iv×14）；12只裸鼠；

阳性对照组：CTX（30mg/kg，iv×7）；用灭菌生理盐水稀释；8只裸鼠；

试验组1：曲札茋苷L（25mg/kg，iv×14）；用PBS(-)稀释；8只裸鼠；

试验组2：曲札茋苷M（50mg/kg，iv×14）；用PBS(-)稀释；8只裸鼠；

试验组3：曲札茋苷H（100mg/kg，iv×14）；用PBS(-)稀释；8只裸鼠；

开始给药，每4天称量裸鼠的体重；并用游标卡尺每4天测瘤块的长径（a）、短径（b），计算肿瘤体积（tumor volume,TV）、相对肿瘤体积（relative tumor volume,RTV），相对肿瘤增殖抑制率，并进行T检验，d16天（接种后29天）处死动物，解剖取瘤块，拍照。

计算公式为：

肿瘤体积TV=1/2×a×b²

相对肿瘤体积RTV=V_t/V₀

相对肿瘤增殖抑制率(%)＝（1－T_RTV/C_RTV）×100%

V₀为分笼时（即d₀）测量所得肿瘤体积，V_t为每一次测量时的肿瘤体积。T_RTV为阳性对照组或试验组RTV，C_RTV为空白对照组RTV。

曲札茋苷在裸鼠中的有效剂量和人体有效剂量的换算公式为：

裸鼠有效剂量(mg/kg)=人体有效剂量×换算系数

依据徐叔云，如濂，陈修主编《药理实验方法学》（第三版）附录1861页附表11-8计算。

试验结果如表2、表3、表4所示。

表2曲札茋苷对移植于裸鼠的人体肺癌A549的抑瘤作用，

与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

由表2可知，曲札茋苷在剂量100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg时，连续尾静脉注射14天对人体肺癌A549的相对肿瘤增殖抑制率分别为79.47%、56.45%、33.88%；阳性对照组CTX剂量为30mg/kg时，连续尾静脉注射7天，对人体肺癌A549的相对肿瘤增殖抑制率为84.88%。

从试验组1、2、3之间的对比可以看出，曲札茋苷随着剂量的加大（25mg/kg～100mg/kg），相对肿瘤增殖抑制率也不断增强（33.88%～79.47%），并且曲札茋苷在100mg/kg剂量时连续尾静脉注射14天，对人体肺癌A549的相对肿瘤增殖抑制率为79.47%，与阳性对照CTX剂量为30mg/kg时连续尾静脉注射7天的抑制率84.88%相近。

综合上述试验结果，曲札茋苷100mg/kg剂量时，连续静脉注射14天对人体肺癌A549裸鼠移植瘤的增殖有显著的抑制作用，量效关系明显，与阳性对照CTX剂量为30mg/kg时连续尾静脉注射7天的抑制率相近。

表3曲札茋苷对移植于裸鼠的人体肺癌A549肿瘤体积的影响

由表3可以看出，试验16天之后，肿瘤细胞体积的增大量为：空白对照组>试验组1>试验组2>试验组3>阳性对照组，由此可知，曲札茋苷可以有效抑制肿瘤细胞的增殖，所用剂量在25mg/kg～100mg/kg范围内时，随着曲札茋苷浓度的增大，对肿瘤细胞的抑制作用也相应增强，曲札茋苷剂量为100mg/kg时，连续静脉注射14天抑制肿瘤细胞增殖的活性，与阳性对照CTX剂量为30mg/kg时，连续静脉注射7天的抑制肿瘤细胞增殖的活性接近。因此，曲札茋苷具有较好的抑制人体肺癌A549细胞增殖的作用。

表4曲札茋苷对荷人体肺癌A549裸鼠体重的影响

与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

根据表4可以看出：裸鼠体重增长量为：空白对照组＞试验组1～试验组3＞阳性对照组，由此可见，相对于阳性对照，本发明提供的曲札茋苷对动物体的毒性较小。

综合上述结果分析，曲札茋苷对人体肺癌A549细胞的增殖有很好的抑制作用，且毒副作用小，量效关系明显。曲札茋苷换算成人体的有效剂量为2.0～10mg/kg，因此，60kg体重人体的有效剂量为120～600mg。

实施例3药物的制备

称取以下原料：

将以上原料粉碎，混合均匀，造粒，干燥，压片，即得曲札茋苷片剂。

实施例4药物的制备

称取以下原料：

原料 重量/g

曲札茋苷 99

β-环糊精 1

将以上原料粉碎，混合均匀，包装，即得曲札茋苷散剂。

实施例5药物的制备

称取以下原料：

将以上原料粉碎，混合均匀，制成颗粒，干燥，包装，即得曲札茋苷颗粒剂。

实施例6药物的制备

称取以下原料：

原料 重量/g

曲札茋苷 90

玉米淀粉 10

将以上原料粉碎，混合均匀，将得到的混合物装入硬明胶胶囊，包装，即得曲札茋苷胶囊剂。

实施例7药物的制备

称取以下原料：

将以上原料粉碎，混合均匀，灭菌后真空包装，即得曲札茋苷粉针剂。

实施例8药物的制备

称取以下原料：

将以上原料粉碎，混合均匀，包装，即得曲札茋苷干混悬剂。

实施例9药物的制备

称取以下原料：

将以上原料混合均匀，包装，即得曲札茋苷凝胶剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.曲札茋苷在制备治疗癌症药物中的应用；

所述癌症为肺癌、肠癌、胃癌、血癌或乳腺癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，1kg人体中曲札茋苷的有效剂量为2.0～10mg。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包含曲札茋苷及药学上可接受的辅料。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述曲札茋苷在所述药物中的重量百分含量为1％～99％。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述曲札茋苷在所述药物中的重量百分含量为15％～90％。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述曲札茋苷在所述药物中的重量百分含量为50％～66.7％。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物剂型为经胃肠道给药剂型或非经胃肠道给药剂型。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述经胃肠道给药剂型为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂或混悬剂。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述非经胃肠道给药剂型为注射给药剂型、呼吸道给药剂型、皮肤给药剂型、粘膜给药剂型或腔道给药剂型。