CN104664088A - 一种玉米豆粕日粮用复合酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米豆粕日粮用复合酶及其制备方法，属于酶制剂领域；所述玉米豆粕日粮用复合酶，由以下重量份数的原料组成：β-葡聚糖酶5-10，木聚糖酶8-10，纤维素酶8-15，中温α-淀粉酶3-5，半乳糖苷酶1-2，酸性蛋白酶1-2，甘露聚糖酶0.5-1，植物乳杆菌胶囊1-2，植物制剂2-4份，生姜提取物1-2份，甘草1-2份。本发明产品中采用植物制剂、生姜提取物、甘草科学复配，有效减缓酶制剂的回潮；可增强复合酶的耐冻、耐热性能，保持相同的酶活力；保护剂与酶制剂、植物制剂和生姜提取物共同协同作用，使复合酶酶活力和效力最大限度发挥，提高饲料的利用率和动物的生长率，增强动物的食欲和抗病能力，延长产品的保质期、保护了环境。

Description

一种玉米豆粕日粮用复合酶及其制备方法

技术领域

本发明属于酶制剂领域，具体涉及一种玉米豆粕日粮用复合酶及其制备方法。

背景技术

开发玉米豆粕类饲料用的复合酶制剂有利于提高玉米豆粕型饲料的消化吸收效率，提高养殖效益，有良好的市场前景。

名称为一种玉米豆粕型饲料复合酶添加剂及其应用发明专利，申请号：201110041719.6发明提供了一种玉米豆粕型复合酶添加剂及其应用,复合酶添加剂由以下组分组成:木聚糖酶10％-15％；纤维素酶8％-15％；β-甘露聚糖酶3％-8％；α-半乳糖苷酶5％-15％；酸性蛋白酶5％-10％；中温淀粉酶10％-20％；糖化酶5％-10％；载体7％-54％。-该发明所述复合酶添加剂可以分解玉米豆粕中的营养物质和畜禽难以消化的粗纤维等大量抗营养因子等,从而充分发掘玉米豆粕中的能量,帮助畜禽提高对玉米豆粕型饲料的消化能力,降低料肉比；提高营养物质消化率和表观代谢能,减少回肠微生物数量；与类似添加剂相比具有高效性、专一性和添加量少等优点；使用所述复合酶添加剂可促进动物生长、提高饲料转化效率。

杜仲，富含苯丙素类化合物、环烯醚萜类等活性成分，具有清除体内垃圾，加强细胞物质代谢，分解体内胆固醇，降低体内脂肪，广谱抗菌，提高白血球数量，增强免疫力等显著功效。杜仲纯粉在动物实验上的结果表明:可促进胆固醇和脂质代谢；添加杜仲纯粉饲养的鳗鱼,具有天然鳗鱼的味道；将杜仲纯粉添加到饲料中可提高肉鸡的品质,使之具有诱人的香味和品质。

茯苓具有利水渗湿，健脾化痰，宁心安神，败毒抗癌的作用，可松弛消化道平滑肌，抑制胃酸分泌，防止肝细胞坏死，抗菌等功效；所含茯苓酸具有增强免疫力、抗肿瘤以及镇静、降血糖等的作用；茯苓多糖能降低点带石斑鱼血清A/G值，提高血清补体C3含量，提高血液白细胞数和白细胞吞噬率，提高其非特异性免疫力。

玉米豆粕日粮用复合酶的应用有着其广阔的市场空间和巨大的经济价值，但玉米豆粕日粮用复合酶的热稳定性、安全性、复配全面性及作用效果的充分发挥仍是酶制剂生产厂家和广大养殖户共同关注的一个重要问题，制备更安全，更全面，酶作用效果更好的玉米豆粕日粮用复合酶是本行业技术人员的共同责任和追求。

发明内容

本发明所解决的技术问题提供一种玉米豆粕日粮用复合酶及其制备方法；

所述玉米豆粕日粮用复合酶，由以下重量份数的原料组成：β-葡聚糖酶5-10，木聚糖酶8-10，纤维素酶8-15，中温α-淀粉酶3-5，半乳糖苷酶1-2，酸性蛋白酶1-2，甘露聚糖酶0.5-1，植物乳杆菌胶囊1-2，植物制剂2-4份，生姜提取物1-2份，甘草1-2份。

所述木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、中温α-淀粉酶等均为食品级酶制剂；

所述植物制剂的制备方法如下：

称取决明子10-18份；杜仲5-15份；茯苓10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，添加上述混合物料组分质量1-2％的酸性纤维素酶，控制温度45-55℃，pH：3.5-4，保持1-2h，随后添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60℃-78℃保持3-4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得植物制剂。

所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1-1.5；乙醇浓度为95％；丙醇浓度为100％；

所述生姜提取物的制备方法如下：

将粉碎至粒径为2毫米以下生姜置于容器中，添加生姜3-6倍重量的水，控制温度50℃-60℃保持2-3h，添加生姜2-3倍重量乙醇和甲醇的混合物，控制温度至30℃-40℃保持3-8h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得生姜提取物。

所述乙醇和甲醇的质量比例为1：2，乙醇浓度85-95％；甲醇浓度100％。

所述植物乳杆菌胶囊的制备方法如下：

植物乳杆菌胶囊产品由壁材、植物乳杆菌、冻干保护剂、水苏糖和羊肚菌酶解粉组成。

所述的壁材由酶解大豆分离蛋白、壳聚糖、黄原胶、卡拉胶、甘油和海藻糖组成；上述各物质配成混合溶液时的浓度分别为：酶解大豆分离蛋白7-10％、壳聚糖1-2％、黄原胶1-3％、卡拉胶0.1-0.5％、甘油0.3-1％、海藻糖0.5-2％。

酶解大豆分离蛋白的制备方法为：配制浓度为10-13％大豆分离蛋白溶液加热到30-45℃，调整pH到3-5,加入大豆分离蛋白重量0.1-1％的酸性蛋白酶保温酶解0.5-1.5小时，酶解后溶液喷雾干燥获得酶解大豆分离蛋白。

羊肚菌酶解粉制备方法如下：

(1)羊肚菌子实体干燥粉碎；

(2)水溶均质：将粉碎的羊肚菌子实体加入不锈钢筒中，加入子实体3-6倍重量的水，浸泡3-5小时，然后将此羊肚菌子实体液通过胶体磨，胶体磨操作条件为：调整胶体磨定子与转子的间隙为0.5-1微米，胶体磨流量为0.4-1吨/小时；

(3)升温酶解：将经过胶体磨处理的羊肚菌子实体液混合液转移到不锈钢酶解罐中加热到50-60℃，调整pH到4.5-6.0,加入羊肚菌子实体重量0.05-0.1％的纤维素酶、0.01-0.1％ 的β-葡聚糖酶、0.01-0.1％的蛋白酶，保温酶解0.5-1.5小时，酶解过程中不断搅拌。

(4)干燥：酶解后的醪液过滤后干燥获得羊肚菌酶解粉。

所述干燥可以采用常规喷雾干燥、冷冻干燥等干燥形式。

所述冻干保护剂由脱脂奶粉、海藻糖和麦芽糊精组成。

本发明胶囊产品包含的植物乳杆菌优选CGMCC NO.9405。

上述植物乳杆菌胶囊产品制备方法如下：

1)制备芯材：向经发酵罐发酵培养的植物乳杆菌发酵液中添加发酵液质量3-5％的水苏糖和5-8％的羊肚菌酶解粉，然后与冻干保护剂溶液混合，-50℃下预冻0.5h，然后在真空冷冻干燥机中冻干10-18h，冻干后研磨粉碎制成芯材；

所述发酵液与冻干保护剂溶液的比例为1:1.4-0.8；所述冻干保护剂溶液由脱脂奶粉、海藻糖和麦芽糊精溶液组成；三种溶液的体积比为脱脂奶粉：海藻糖：麦芽糊精＝3:1:0.5；

所述脱脂奶粉、海藻糖和麦芽糊精溶液的浓度分别为：脱脂奶粉5％，海藻糖1％，麦芽糊精2％。

2)包被：将芯材悬浮在流化床中，壁材喷雾包被，从一个喷头中喷入壳聚糖、甘油和海藻糖的混合液，从另一个喷头中喷入黄原胶、卡拉胶和酶解大豆分离蛋白的混合液，喷雾速度控制相同，包被过程中流化床内温度在25-38℃之间，30分钟后即形成胶囊。此干燥方法采用专利201120503311.1中设备处理。

所述中温α-淀粉酶具有以下特性：

(1)该酶温度适应范围较宽，温度在55-75℃之间活性较高，最适作用温度为65℃；

热稳定性：该酶在65℃条件下保存24h仍具有80-83％酶活，70℃条件下保存12h仍具有50-60％以上酶活。

(2)该酶最适反应pH值为5.0；在pH值4.0-6.0之间均有较高酶活力；

酸稳定性：在pH4-6下保存18h后仍有80％以上的酶活。

(3)酶活性：菌株304通过发酵制备的酸性中温α-淀粉酶酶活力为7000-9600U/ml，特别适合液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。

所述淀粉酶为中温α-淀粉酶，采用液体发酵法培养获得。

本发明提供的产中温α-淀粉酶的菌株具体为枯草芽孢杆菌304(Bacillus subtilis)304。该菌株已于2013年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学)，保藏号为CCTCC NO:M 2013600。

所述枯草芽孢杆菌304由一株分离自酸性土壤的产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌出发菌株经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，菌株特点如下：所述菌株在固体平板 上菌落颜色为乳白色，表面干燥褶皱，色暗不透明，边缘整齐，镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性，周生鞭毛，芽孢呈椭圆形。

本发明玉米豆粕日粮用复合酶的制备方法如下：

将所述甘草、植物制剂和生姜提取物分别超微粉碎，然后与木聚糖酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶，中温α-淀粉酶，半乳糖苷酶，酸性蛋白酶，甘露聚糖酶，植物乳杆菌胶囊均匀混合后密封包装即得成品复合酶。

所述玉米豆粕日粮用复合酶适用于饲料加工厂和养殖场自配饲料，使用时应与饲料中的其它原料混合均匀，可事先将本发明与少量饲料混合均匀，再混合到大批饲料中，直接饲喂。建议每吨全价料添加量为:100-150g。

有益效果：

本发明以中温α-淀粉酶采用梯度降温和梯度升温的发酵工艺，同时予以追加接种和适时补料，使得本发明所产中温α-淀粉酶活力高、耐受温度高、稳定性强、适于工业化生产。酶活力为9500U/ml。中温α-淀粉粗酶液样品于40-90℃下保存不同的时间后测定酶活，结果显示，样品在65℃条件下保存24h仍具有83％酶活，70℃条件下保存12h仍具有60％以上酶活。

本发明产品中采用植物制剂、生姜提取物、甘草科学复配，有效减缓了酶制剂的回潮；同时可增强复合酶的耐冻、耐热性能，保持相同的酶活力，其耐热温度可提高10-15℃，耐冷冻温度可降低5-10℃，有效防止了复合酶在运输、保存和使用过程中酶活力的损失，延长了复合酶的保质期，达到同样的酶活力，同类产品保质期可延长3-5个月。

本发明产品添加的植物制剂既可延长复合酶制剂的保质期，又可提高饲养畜禽的免疫力，有效防止畜禽流行性疾病的发生。

本发明提供的乳酸菌微胶囊，其壁材中添加了改性大豆分离蛋白，改性大豆分离蛋白比大豆分离蛋白乳化能力提高25％、胶凝能力提高15-25％，改性大豆分离蛋白黄原胶和卡拉胶及壳聚糖的配合使用，凝胶强度提高了10％以上，增强了胶囊的耐胃酸性；本发明胶囊采用改性大豆分离蛋白，具有很好的肠溶性，胶囊到达肠道后在1-1.5小时内即可完全崩解释放出植物乳杆菌，并迅速增殖成为优势菌群，从而达到抑制病原菌生长等作用。

本发明产品中保护剂与酶制剂、植物制剂、生姜提取物与酶制剂的共同协同作用，使得复合酶的酶活力和效力最大限度的发挥，并相应的提高了饲料的利用率和动物的生长率，增强了动物的食欲和抗病能力，延长了产品的保质期和保护了环境。有效降解饲料中的纤维素、木聚糖、β—葡聚糖等非淀粉多糖抗营养因子，降低食糜粘度，防腹泻。促进植物细胞内营养物质释放，提高饲料中营养物质利用率。补充畜禽体内内源酶的分泌不足，促进营养物质 的消化吸收.提高饲料利用率。促进肠道有益菌的生长而抑制有害菌的繁殖，提高动物免疫力和饲养成功率。平衡原料批次差异化，稳定饲料品质。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2014,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9405，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2014年7月2日。

实施例1

本发明所用植物乳杆菌CGMCC No.9405的选育过程如下：

原始出发菌种→试管活化→硫酸二乙酯(DES)诱变→亚硝基胍(NTG)诱变→等离子体诱变→平板初筛→摇瓶复筛→传代稳定性试验。

本发明所采用的出发菌株在MRS葡萄糖培养基中，其乳酸的生产速率为1.5g/L/d,当培养基pH为3.5时几乎停止生长，对亚硝酸钠的分解速率为0.34mg/h/kg白菜。出发菌株由李政采集于宁夏盐池县育肥羊场的青储饲料，采集时间2013年9月15日。

为了提高其乳酸生产速率、耐酸能力和亚硝酸盐的分解速率，依次采用DES和NTG技术对该菌种进行诱变，诱变后菌株采用MRS碳酸钙平板进行初筛，然后采用500mL摇瓶发酵，生物传感器分析仪对高产菌进行复筛，选育优良的植物乳杆菌菌株，然后做传代实验，评价其遗传稳定性。

植物乳杆菌tlj-2014遗传稳定性结果表明：经过连续传代十次，各项性能指标都比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把植物乳杆菌tlj-2014作为选育得到的目的菌株。

经验证发现：该诱变菌株的乳酸生产速率可以达到35g/L/d，该菌株经过71小时发酵后乳酸浓度达到95g/L；能够在pH为1.80的条件下存活。降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到9.8mg/h/kg(自然发酵过程亚硝酸盐积累的速率大约为1.1mg/h/kg)，能够耐1％胆盐。

1)DES诱变选育

a.在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌L一环(出发菌)，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长 前期。

b.取5mL菌液，5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。

c.用pH7.0磷酸缓冲液稀释成10⁷个/mL菌悬液。

d.取32mL pH7.0的磷酸钾缓冲液、8mL菌悬液、0.4mL DES在预先放入转子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最终浓度为1％(v/v)。

e.在37℃摇床中150rpm反应30min，取1mL混合液，加入0.5mL 25％Na₂S₂O₃溶液中止反应。

f.适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基(含100g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中。在37℃培养2～3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株转印到pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS培养基(低pH值改性MRS培养基)上和亚硝酸钠筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上。

g.在37℃培养2～3天后，挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛选培养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取出的菌落命名为植物乳杆菌L1。

2)亚硝基胍诱变 

a.在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌L1一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为60g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。

b.取5mL菌液5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。

c.用pH6.0磷酸缓冲液稀释成10⁷个/mL菌悬液。

d.取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。

e.在37℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。

f.适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基(含100g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中。在37℃培养2～3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株转印到pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS培养基(低pH值改性MRS培养基)上和亚硝酸钠筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上。

g.挑选菌株方法：挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛选培养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取100支符合以上条件的菌落。

3)摇瓶复筛

a.在超净台上分别取各试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼 脂)(葡萄糖浓度为100g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养15h左右，使菌体处于对数生长中期。

b.分别取5mL菌液，接入装有50mL碳酸钙筛选液体培养基(含250g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中、pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS液体培养基(低pH值改性MRS培养基)和亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上(注：采用250mL三角瓶)。200rpm，37℃培养3-4天，每天分别检测碳酸钙筛选液体培养基中L-乳酸产生速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。发酵结束后，比较100株菌种的碳酸钙筛选液体培养基中L-乳酸产生速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。

c.选择兼具高L-乳酸产生速率、耐受低pH(该菌种仅能在最低为pH1.8的培养基中生长)和亚硝酸盐的消耗速率高的菌株，将其命名为L2菌。

4)遗传稳定性试验

将L2菌在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。菌株命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2014。

5)5L发酵罐试验 

a.取斜面上的植物乳杆菌L2一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。

b.将对数期的菌种接入装有3L MRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌L2的乳酸产量达到95g/L。

c.将对数期的菌种接入装有3L pH为1.8的LPHMRS液体培养基(初始葡萄糖为50g/L)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧，整个过程用0.5mol/L的氢氧化钠将发酵液pH控制在1.8，总培养时间为48小时。发酵结束后，检测植物乳杆菌L2的生物量为2.5g/L，说明植物乳杆菌L2能够在pH1.8的环境中生存。

d.将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌L2对亚硝酸钠的降解速率。结果发现：在该条件下，L2对亚硝酸钠的降解速率可以达到563mg/h/L。

实施例2

一种中温α-淀粉酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化

将保存完好的枯草芽孢杆菌304的斜面菌种接种于斜面培养基，31℃培养24h进行菌种活化，如此活化2次；

所述斜面培养基组成为：牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，葡萄糖2g,琼脂15g，蒸馏水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min；

(2)液体种子扩大培养

①一级种子培养：将步骤(1)活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床250rpm，培养温度31℃，培养时间10h；

②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

③三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床250rpm，培养温度38℃，培养时间10h；

④一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度31℃，搅拌速度200rpm，通风量(V/V)1:1,罐压0.05Mpa,培养时间10h；

所一级、二级、三级种子培养基重量组成为：

酵母粉0.3％，葡萄糖1％，蛋白胨0.3％，牛肉膏0.5％，磷酸氢二钾0.8％，中草药剂粉1.5％，海藻糖1％，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠1g，不足部分纯净水补足，pH值6，121℃灭菌30min。

所述种子罐培养基重量组成为：

麦芽糊精5％，酵母粉0.4％，中草药剂粉1.5％，海藻糖1％，蛋白胨0.1％，玉米浆0.1％，磷酸氢二钾0.8％，硫酸镁0.05％，柠檬酸钠0.1％，不足部分纯净水补足，pH值6，121℃灭菌30min。

所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x 10⁸个/ml；

(3)发酵罐发酵 

将种子罐发酵液以6％接种量接入发酵罐，培养温度35℃，搅拌速度250r/min，通风量(V/V)1:2,培养时间13h；然后以1.5℃/h降温速率缓慢降温至15℃，恒温培养13h；继续以1.5℃/h降温速率缓慢降温至3℃，此时，将一级种子罐发酵液以2％接种量追加接入发酵罐，恒温培养13h；最后以1.5℃/h升温速率缓慢升至35℃，恒温培养30h。

pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在6.5；

所述发酵培养基组成为：麦芽糊精100g，玉米粉55g，豆饼粉20g，中草药剂粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值6.5，121℃灭菌20min；

所述中草药粉剂的制备方法如下：

称取黄芪25份，党参15份，柴胡15份，黄芩10份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度到33℃，pH值6.5，按混合物料质量比添加0.3％纤维素酶酶解1.5小时，控制温度80℃保持8分钟，然后降温至50℃，pH为6.0，按混合物料重量比分别加入0.20％的木瓜蛋白酶和果胶酶酶解50分钟，冷却到8℃保持2小时，升高温度到90℃保持15分钟，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至70℃保持3.4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。

所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.2。

(1)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温α-淀粉酶。

经上述制备方法得到发酵液经离心取上清液所得的中温α-淀粉粗酶液酶活力为9500U/ml。中温α-淀粉粗酶液样品于40-90℃下保存不同的时间后测定酶活，结果显示，样品在65℃条件下保存24h仍具有83％酶活，70℃条件下保存12h仍具有60％以上酶活；

实施例3

植物乳杆菌胶囊产品由壁材、植物乳杆菌、冻干保护剂、水苏糖和羊肚菌酶解粉组成。

所述的壁材由酶解大豆分离蛋白、壳聚糖、黄原胶、卡拉胶、甘油和海藻糖组成；上述各物质配成混合溶液时的浓度分别为：酶解大豆分离蛋白10％、壳聚糖1％、黄原胶3％、卡拉胶0.1％、甘油0.5％，海藻糖0.5％。

酶解大豆分离蛋白的制备方法为：配制浓度为10-13％的大豆分离蛋白溶液加热到30-33℃，调整pH到3,加入大豆分离蛋白重量0.2％的酸性蛋白酶保温酶解1.5小时，酶解后溶液喷雾干燥获得酶解大豆分离蛋白。

植物乳杆菌为保藏编号CGMCC NO.9405菌种。

所述羊肚菌酶解粉的制备方法如下：

(1)羊肚菌子实体干燥粉碎；

(2)水溶均质：将粉碎的羊肚菌子实体加入不锈钢筒中，加入子实体3倍重量的水，浸泡5小时，然后将此羊肚菌子实体液通过胶体磨，胶体磨操作条件为：调整胶体磨定子与转子的间隙为0.6±1微米，胶体磨流量为0.5吨/小时；

(3)升温酶解：将经过胶体磨处理的羊肚菌子实体液混合液转移到不锈钢酶解罐中加热 到50℃，调整pH到6.0,加入羊肚菌子实体重量0.05％的纤维素酶、0.01％的β-葡聚糖酶、0.1％的蛋白酶，保温酶解1.5小时，酶解过程中不断搅拌。

(4)干燥：酶解后的醪液过滤后喷雾干燥获得羊肚菌酶解粉。

上述植物乳杆菌胶囊产品的制备过程如下：

1)制备芯材：向经发酵罐发酵培养的植物乳杆菌发酵液中添加发酵液质量3％的水苏糖和8％的羊肚菌酶解粉，然后与冻干保护剂溶液混合，-50℃下预冻0.5h，然后在真空冷冻干燥机中冻干10h，冻干后研磨粉碎制成芯材；发酵液与冻干保护剂溶液的比例为1:1.4；冻干保护剂溶液由脱脂奶粉、海藻糖和麦芽糊精溶液组成；三种溶液的体积比为脱脂奶粉：海藻糖：麦芽糊精＝3:1:0.5；

所述脱脂奶粉、海藻糖和麦芽糊精溶液的浓度分别为：脱脂奶粉5％，海藻糖1％，麦芽糊精2％。

2)包被：将芯材悬浮在流化床中，壁材喷雾包被，从一个喷头中喷入壳聚糖、甘油和海藻糖的混合液，从另一个喷头中喷入黄原胶、卡拉胶和酶解大豆分离蛋白的混合液，喷雾速度控制相同，包被过程中流化床内温度在28℃，30分钟后即形成胶囊。采用如专利201120503311.1所述装置制备。

植物乳杆菌胶囊产品耐胆盐测试。

将实施例2、3中的胶囊产品置于37℃的猪胆盐溶液(溶液浓度3.0％)中保温并不断搅拌，2h后取出，用灭菌生理盐水洗涤，用解囊液溶解，测定乳酸菌存活率，并与未包埋的菌液进行比较。测试结果如下表所示。

	形态变化	存活率
			实施例1	不崩解	87.5％
实施例2	不崩解	89.3％
			未包被对照	--	0.65％

实施例4

一种玉米豆粕日粮用复合酶，由以下重量份数的原料组成：木聚糖酶9，纤维素酶10，β-葡聚糖酶8，中温α-淀粉酶4，半乳糖苷酶1，酸性蛋白酶1，甘露聚糖酶0.8，植物乳杆菌胶囊1，植物制剂3份，生姜提取物1份，甘草1.5份。

所述植物制剂的制备方法如下：

称取决明子15份；杜仲10份；茯苓12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，添加上述混合物料组分质量2％的酸性纤维素酶，控制温度50℃，pH：3.8，保持1h，随后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物， 控制温度至70℃保持3h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得植物制剂。

所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1；乙醇浓度为95％；丙醇浓度为100％；

所述生姜提取物的制备方法如下：

将粉碎至粒径为2毫米以下生姜置于容器中，添加生姜4倍重量的水，控制温度55℃保持2h，添加生姜3倍重量乙醇和甲醇的混合物，控制温度至35℃保持5h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得生姜提取物。

所述乙醇和甲醇的质量比例为1：2，乙醇浓度90％；甲醇浓度100％。

实施例5

基本同例1-4

一种玉米豆粕日粮用复合酶，由以下重量份数的原料组成：木聚糖酶10，纤维素酶15，β-葡聚糖酶5，中温α-淀粉酶5，半乳糖苷酶2，酸性蛋白酶2，甘露聚糖酶1，植物乳杆菌胶囊2，植物制剂4份，生姜提取物2份，甘草2份。

所述酸性木聚糖酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、中温α-淀粉酶、酸性蛋白酶均为食品级酶制剂；

实施例6

一种玉米豆粕日粮用复合酶，由以下重量份数的原料组成：木聚糖酶8，纤维素酶8，β-葡聚糖酶10，中温α-淀粉酶5，半乳糖苷酶1，酸性蛋白酶1，甘露聚糖酶0.5，植物乳杆菌胶囊1，植物制剂2份，生姜提取物2份，甘草1份。

本发明玉米豆粕日粮用复合酶的制备方法如下：

将所述甘草、植物制剂和生姜提取物分别超微粉碎，然后与木聚糖酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶，中温α-淀粉酶，半乳糖苷酶，酸性蛋白酶，甘露聚糖酶，植物乳杆菌胶囊均匀混合后密封包装即得成品玉米豆粕日粮用复合酶。

实施例7

饲喂试验：

材料与方法

试验猪的选择及分组

在湖南某一大型正规养猪场，选取36头体重为(30±2)kg的健康杜长大三元杂交生长猪，随机分成3组，每组2栏重复，每重复6头，阉公猪和小母猪各半。正式试验前进行为期1周的预试，并完成驱虫和常规免疫工作。试验分前后两期进行，前期(30kg-60kg)，后期(61kg～90kg)。

饲养管理

饲喂干粉料，自由采食，以吃饱不剩为限，自动饮水器饮水。前期日喂三次，后期日喂二次，以栏为单位记录耗料量。猪舍为砖瓦结构、水泥地面、单列式，试猪分别饲养于9栏内，各栏舍的环境条件一致，每日上下午清扫圈舍各一次，同时观察猪的行为、食欲、粪便。试验期间记录疾病及治疗情况。

饲料及配方

以全价国标生长猪饲料为基础，每吨饲料添加试验组、对照组1和对照组2的生长猪专用酶100g；

测试指标：在试验前(30kg-60kg)、中期和试验后期(61kg～90kg)结束时，分别称个体重，称重均在早晨空腹进行。分阶段，以栏为单位记录其每日耗料量、发病率，同时计算日采食量和饲料利用效率，并对上述数据进行统计分析，生长猪生长性能见表2。

表2

对上述试验全期测试结果进行分析如表3：

表3

项目	试验组	对照组1	偏差(％)	对照组2	偏差(％)
						日增重(g)	877	746	131(17.56)	657	220(33.49)
采食量(kg)	189.73	193.46	-3.73(-1.92)	210.17	-20.44(-9.7)
						料重比	2.80	3.36	-0.56(-16.67)	4.15	-1.35(-32.53)
腹泻率(％)	0	4	-4(-100)	17	-17(-100)
						毛色评分	9	6.5	2.5(38.46)	4	5(125)

从上述统计结果分析：试验组与对照组1和对照组2相比，在试验材料、试验环境、试验方法和实验设施等试验条件相同的情况下，日增重分别提高了17.56％和33.49％；采食量分别降低了1.92％和9.7％；料重比分别降低了16.67％和32.53％；腹泻率分别降低了100％；外观毛色质量分别提高了38.46％和125％；使用本发明的玉米豆粕日粮用复合酶具有优良的生长性能和显著的免疫能力，提高了养殖产量和质量，降低了养殖成本，提高了养殖经济效益。

Claims (9)

1.一种玉米豆粕日粮用复合酶，由以下重量份数的原料组成：β-葡聚糖酶5-10，木聚糖酶8-10，纤维素酶8-15，中温α-淀粉酶3-5，半乳糖苷酶1-2，酸性蛋白酶1-2，甘露聚糖酶0.5-1，植物乳杆菌胶囊1-2，植物制剂2-4份，生姜提取物1-2份，甘草1-2份。

2.根据权利要求1所述玉米豆粕日粮用复合酶，其特征在于，所述植物制剂的制备方法如下：

称取决明子10-18份；杜仲5-15份；茯苓10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，添加上述混合物料组分质量1-2％的酸性纤维素酶，控制温度45-55℃，pH：3.5-4，保持1-2h，随后添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60℃-78℃保持3-4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得植物制剂。

3.根据权利要求1所述玉米豆粕日粮用复合酶，其特征在于，所述生姜提取物的制备方法如下：

将粉碎至粒径为2毫米以下生姜置于容器中，添加生姜3-6倍重量的水，控制温度50℃-60℃保持2-3h，添加生姜2-3倍重量乙醇和甲醇的混合物，控制温度至30℃-40℃保持3-8h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得生姜提取物。

4.据权利要求1所述玉米豆粕日粮用复合酶，其特征在于，所述植物乳杆菌胶囊的制备方法如下：

植物乳杆菌胶囊产品由壁材、植物乳杆菌、冻干保护剂、水苏糖和羊肚菌酶解粉组成；

所述的壁材由酶解大豆分离蛋白、壳聚糖、黄原胶、卡拉胶、甘油和海藻糖组成；上述各物质配成混合溶液时的浓度分别为：酶解大豆分离蛋白7-10％、壳聚糖1-2％、黄原胶1-3％、卡拉胶0.1-0.5％、甘油0.3-1％，海藻糖0.5-2％；酶解大豆分离蛋白的制备方法为：配制浓度为10-13％大豆分离蛋白溶液加热到30-45℃，调整pH到3-5,加入大豆分离蛋白重量0.1-1％的酸性蛋白酶保温酶解0.5-1.5小时，酶解后溶液喷雾干燥获得酶解大豆分离蛋白。

5.据权利要求4所述玉米豆粕日粮用复合酶，其特征在于，植物乳杆菌优选CGMCC NO.9405。

6.据权利要求1-4所述玉米豆粕日粮用复合酶，其特征在于，植物乳杆菌胶囊产品制备方法如下：

1)制备芯材：向经发酵罐发酵培养的植物乳杆菌发酵液中添加发酵液质量3-5％的水苏糖和5-8％的羊肚菌酶解粉，然后与冻干保护剂溶液混合，-50℃下预冻0.5h，然后在真空冷冻干燥机中冻干10-18h，冻干后研磨粉碎制成芯材；

所述发酵液与冻干保护剂溶液的比例为1:1.4-0.8；所述冻干保护剂溶液由脱脂奶粉、海藻糖和麦芽糊精溶液组成；三种溶液的体积比为脱脂奶粉：海藻糖：麦芽糊精＝3:1:0.5；

所述脱脂奶粉、海藻糖和麦芽糊精溶液的浓度分别为：脱脂奶粉5％，海藻糖1％，麦芽糊精2％；

2)包被：将芯材悬浮在流化床中，壁材喷雾包被，从一个喷头中喷入壳聚糖、甘油和海藻糖的混合液，从另一个喷头中喷入黄原胶、卡拉胶和酶解大豆分离蛋白的混合液，喷雾速度控制相同，包被过程中流化床内温度在25-38℃之间，30分钟后即形成胶囊。

7.据权利要求1所述玉米豆粕日粮用复合酶，其特征在于，所述中温α-淀粉酶具有以下特性：

(1)该酶温度适应范围较宽，温度在55-75℃之间活性较高，最适作用温度为65℃；

热稳定性：该酶在65℃条件下保存24h仍具有80-83％酶活，70℃条件下保存12h仍具有50-60％以上酶活；

(2)该酶最适反应pH值为5.0，在pH值4.0-6.0之间均有较高酶活力；酸稳定性：在pH4-6下保存18h后仍有80％以上的酶活；

(3)酶活性：菌株304通过发酵制备的酸性中温α-淀粉酶酶活力为7000-9600U/ml；特别适合液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求；产中温α-淀粉酶的菌株具体为枯草芽孢杆菌304Bacillus subtilis304，保藏号为CCTCC NO:M 2013600。

8.据权利要求1-7所述玉米豆粕日粮用复合酶，其特征在于，由以下重量份数的原料组成：木聚糖酶9，纤维素酶10，β-葡聚糖酶8，中温α-淀粉酶4，半乳糖苷酶1，酸性蛋白酶1，甘露聚糖酶0.8，植物乳杆菌胶囊1，植物制剂3份，生姜提取物1份，甘草1.5份；

一种玉米豆粕日粮用复合酶，由以下重量份数的原料组成：木聚糖酶10，纤维素酶15，β-葡聚糖酶5，中温α-淀粉酶5，半乳糖苷酶2，酸性蛋白酶2，甘露聚糖酶1，植物乳杆菌胶囊2，植物制剂4份，生姜提取物2份，甘草2份；

一种玉米豆粕日粮用复合酶，由以下重量份数的原料组成：木聚糖酶8，纤维素酶8，β-葡聚糖酶10，中温α-淀粉酶5，半乳糖苷酶1，酸性蛋白酶1，甘露聚糖酶0.5，植物乳杆菌胶囊1，植物制剂2份，生姜提取物2份，甘草1份。

9.据权利要求1-7所述玉米豆粕日粮用复合酶的制备方法，如下：

将所述甘草、植物制剂和生姜提取物分别超微粉碎，然后与木聚糖酶，纤维素酶，β-葡聚糖酶，中温α-淀粉酶，半乳糖苷酶，酸性蛋白酶，甘露聚糖酶，植物乳杆菌胶囊均匀混合后密封包装即得成品玉米豆粕日粮用复合酶。