CN104651351B - 从馆藏干制麻蝇标本中扩增dna条码全长方法及试剂盒 - Google Patents
从馆藏干制麻蝇标本中扩增dna条码全长方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长的方法及试剂盒。该方法提供四条引物，分别为LCO1490、HCO1856、HCO2198和LCO1728；以馆藏干制麻蝇标本的基因组DNA为模板，通过LCO1490和HCO1856为引物对进行PCR，得到片段A，通过HCO2198和LCO1728为引物对进行PCR，得到片段B；将片段A和片段B拼接，得到馆藏干制麻蝇标本的DNA条形码全长。实现该方法的试剂盒包含引物LCO1490、HCO1856、HCO2198和LCO1728。本发明提供的方法准确、快速，其扩增结果与其他直接扩增全长相比，对麻蝇通用性好，扩增效率高，具有更大的可靠性和适应性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长的方法及试剂盒。
背景技术
DNA条形码技术是近几年新兴的利用生物本身普遍具有的一段保守性适中、容易获得的基因片段作为标准，建立在现代先进的DNA扩增、测序和比对技术基础之上的一种物种鉴定手段。与传统的形态鉴定相比，利用DNA条形码进行物种鉴定具有以下优势：对物种的鉴定将不再受物种发育状态的限制，克服了卵、幼虫、蛹等无法直接鉴定的缺点；对鉴定者的经验和专业背景知识大大降低，减少主观判断的干扰；物种的鉴定更加准确快速，数据共享使构建生物全球分子鉴定平台成为可能。但由于国际上现有的数据库中的数据有限，往往得到的种类的DNA条形码数据在数据库中不能找到相匹配的数据，达不到种类鉴定的目的。
新采集的标本由于缺少相应的分类专家得不到准确的鉴定，环境的改变和人为的干扰，致使许多过去的常见种变成了濒危种甚至灭绝。博物馆中储存着大量的昆虫标本，多数是干制标本，经专家鉴定过的馆藏干制昆虫标本，尤其是物种定名用的模式标本是获取准确种类DNA条形码数据的重要来源，但由于馆藏干制昆虫标本储存年代久，长期处在高防虫和防霉化学试剂的环境中，DNA降解严重，用一般的扩增方法，很难获得长片段。动物中尤其是昆虫等节肢动物作为DNA条形码的COI片段长度包括引物在内为710bp左右，在保存时间过长，干制昆虫标本中的DNA降解严重的情况下，一般不能或者很难扩增出DNA条形码全长的序列。因此很有必要研制一种有效的可以扩增DNA条形码全长的方法。
发明内容
本发明的首要目的是克服现有技术的缺点与不足之处，提供一种从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长的方法。该方法速度快且重复性好。
本发明的另一目的在于提供一种从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长的试剂盒。
本发明通过下述技术方案实现：一种从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长的方法，包含以下步骤：
(1)设计PCR所需要引物，如下：
LCO1728：5'-TCCTCGAATAAATAATATAAGTTTT-3'；
HCO1856：5'-GATAAACAGTTCATCCTGTTCCAGC-3'；
LCO1490：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
HCO2198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'；
(2)提取馆藏干制麻蝇标本的基因组DNA；
(3)扩增：
①以步骤(2)得到的基因组DNA为模板，以LCO1490为上游引物，HCO1856为下游引物，进行PCR，得到片段A；
②以步骤(2)得到的基因组DNA为模板，以LCO1728为上游引物，HCO2198为下游引物，进行PCR，得到片段B；
(4)测序：将步骤(3)得到的片段A和片段B分别克隆到克隆载体上，测序；拼接，得到从馆藏干制麻蝇标本的DNA条形码全长；
所述的麻蝇包括羚足鬃麻蝇(Sarcorohdendorfia antilope)、拟羚足鬃麻蝇(Sarcorohdendorfia inextricata)、白头亚麻蝇(Parasarcophaga albiceps)、海南刺麻蝇(Sinonipponia hainanensis)、曲突钩麻蝇(Harpagophalla kempi)、棕尾别麻蝇(Boettcherisca peregrina)、郭氏欧麻蝇(Heteronychia quoi)、拟东方辛麻蝇(Seniorwhitea reciproca)、黑尾黑麻蝇(Helicophagella melanura)和盘突缅麻蝇(Burmanomyia pattoni)等等；
步骤(2)中所述的基因组DNA优选通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取得到；
为了提高PCR所得的产物的准确性，在PCR过程中最好使用高保真酶；步骤(3)中所述的PCR的反应体系优选为：5倍Phusion HF缓冲液10μl，10mM dNTPs 1μl，正向引物和反向引物各1μl，Phusion超保真DNA聚合酶0.5μl，基因组DNA 2μl，用ddH2O补足50μl；
步骤(3)中所述的PCR的条件优选为：94℃变性5min；94℃40S、54℃40S、72℃1min，29个循环；72℃延伸10min；
步骤(4)中所述的克隆载体优选为T载体。
一种从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长的试剂盒，包含如下两对引物：
第一对：
LCO1490：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
HCO1856：5'-GATAAACAGTTCATCCTGTTCCAGC-3'；
第二对：
HCO2198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'；
LCO1728：5'-TCCTCGAATAAATAATATAAGTTTT-3'；
所述的试剂盒还包含PCR扩增所用的试剂，如酶、dNTP、反应缓冲液；
所述的酶优选为Phusion超保真DNA聚合酶。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明为从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长提供了一种方法。本发明通过引物的设计与筛选，得到通用的一组引物，所建立的体系可重复性高，经多次试验稳定性好。其扩增结果与直接扩DNA条形码全长相比，扩增效率高，具有更大的可靠性和适应性，提高了扩增效率，从而为从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长提供了一种可靠的方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)根据Genbank中发表的一部分麻蝇种类的COI序列(序列号：JQ413458、JQ413452、JQ582102、JQ582072、JQ413461、JQ582073、JQ582071、JQ582069、JN231272)为依据，进行序列分析，设计如下引物，委托大连宝生物技术有限公司合成DNA条形码序列的扩增引物。
LCO1490：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
LCO1637：5'-ATTGTTACAGCTCATGCTTTTATTA-3'；
LCO1728：5'-TCCTCGAATAAATAATATAAGTTTT-3'；
HCO1856：5'-GATAAACAGTTCATCCTGTTCCAGC-3'；
HCO1995：5'-AATACCTGTTGATCGTATATTAAT-3'；
HCO2198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。
(2)以1960年的羚足鬃麻蝇(来自中山出入境检验检疫局媒介生物标本室)的一条后腿为材料，用动物组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN；编号：DP304)中的裂解液浸泡5个小时以上，用动物组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。以LCO1490和HCO1856为引物，经PCR，反应体系为：5倍Phusion HF缓冲液10μl，10mM dNTPs 1μl，正向引物和反向引物(浓度为20pmol/L)各1μl，Phusion超保真DNA聚合酶0.5μl，基因组DNA 2μl，用ddH2O补足50μl；PCR的条件为：94℃变性5min；94℃40S、54℃40S、72℃1min，29个循环；72℃延伸10min；使用质量体积比1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，对目的条带进行切胶，使用琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒进行纯化，将目的基因克隆到质粒pGMT(TIANGEN；编号：VT202，按说明书操作)，经转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化液涂布含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，通过引物LCO1490和HCO1856对菌落进行PCR，筛选得到阳性克隆，抽提得到重组载体pGMT-1A，送测序，得到片段1A的序列如下：
AACTTTATATTTTATTTTCGGGGCCTGAGCAGGAATAGTAGGAACTTCACTAAGAATTCTTATTCGAGCAGAATTAGGTCACCCAGGGGCACTAATTGGTGATGATCAAATTTATAATGTAATTGTTACAGCACATGCCTTTATTATAATTTTCTTTATAGTTATACCAATCATAATTGGAGGATTTGGAAATTGACTAGTACCTATTATGTTAGGAGCTCCAGATATAGCTTCTCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCCCCAGCATTAACACTTCTTCTAGTAAGTAGTATAGTAGAAAATGGA。
(3)以HCO2198和LCO1728为引物，PCR的反应条件和体系同步骤(2)，扩增获得PCR片段1B，将片段1B克隆到质粒pGMT(克隆转化步骤同步骤(2))，得到重组载体pGMT-1B。片段1B的序列如下：
AAAAAGATGTTGGTATAAAATTGGGTCTCCTCCTCCTGCAGGATCAAAAAATGAAGTATTAATATTTCGGTCAGTTAATAATATAGTAATTGCTCCGGCAAGTACGGGTAAAGAAAGTAATAAAAGTAAGGCTGTAATTACTACTGATCAAACGAATAGAGGCATTCGATCAAAAGTGATACCTGTTGATCGTATATTAATAACTGTAGTAATAAAGTTTACAGCTCCTAAAATTGAGGAAATTCCAGCTAGATGTAGGGAAAAAATAGCTAAGTCAACTGAAGCTCCTCCATGAGCAATATTAGATGATAGGGGAGGGTAAACAGTTCATCCTGTTCCAGCTCCATTTTCTACTATACTACTTACTAGAAGAAGTGTTAATGCTGGGGGTAAAAGTCA。
(4)拼接序列1A和序列1B，得到1960年的羚足鬃麻蝇的DNA条形码序列全长，序列如下：
AACTTTATATTTTATTTTCGGGGCCTGAGCAGGAATAGTAGGAACTTCACTAAGAATTCTTATTCGAGCAGAATTAGGTCACCCAGGGGCACTAATTGGTGATGATCAAATTTATAATGTAATTGTTACAGCACATGCCTTTATTATAATTTTCTTTATAGTTATACCAATCATAATTGGAGGATTTGGAAATTGACTAGTACCTATTATGTTAGGAGCTCCAGATATAGCTTCTCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCCCCAGCATTAACACTTCTTCTAGTAAGTAGTATAGTAGAAAATGGAGCTGGAACAGGATGAACTGTTTACCCTCCCCTATCATCTAATATTGCTCATGGAGGAGCTTCAGTTGACTTAGCTATTTTTTCCCTACATCTAGCTGGAATTTCCTCAATTTTAGGAGCTGTAAACTTTATTACTACAGTTATTAATATACGATCAACAGGTATCACTTTTGATCGAATGCCTCTATTCGTTTGATCAGTAGTAATTACAGCCTTACTTTTATTACTTTCTTTACCCGTACTTGCCGGAGCAATTACTATATTATTAACTGACCGAAATATTAATACTTCATTTTTTGATCCTGCAGGAGGAGGAGACCCAATTTTATACCAACATCTTTTT。
(5)以HCO2198和LCO1490为引物，PCR的反应条件和体系同步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
(6)以LCO1490和HCO1995为引物对，PCR的反应条件和体系同步骤(2)，未扩增到明显的特异条带；HCO2198和LCO1637为引物对，PCR的反应条件和体系同步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
实施例2
(1)与实施例1步骤(2)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1980年的拟羚足鬃麻蝇(中山出入境检验检疫局媒介生物标本室)的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-2A。片段2A的序列如下：
AACTTTATATTTTATTTTCGGAGCTTGAGCAGGAATAGTAGGAACATCACTAAGAATTCTTATTCGAGCAGAATTAGGTCACCCAGGAGCATTAATTGGTGATGATCAAATTTATAATGTAATCGTTACAGCACATGCCTTTATTATAATTTTCTTCATGGTAATACCAATCATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTACCTATCATACTAGGAGCTCCAGACATGGCTTTTCCTCGAATAAACAATATAAGTTTTTGACTTTTACCACCAGCATTAACACTTCTTCTAGTAAGCAGTATAGTAGAAAATGGA。
(2)与实施例1步骤(3)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1980年的拟羚足鬃麻蝇的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-2B。片段2B的序列如下：
AAATAGATGTTGGTATAAAATAGGATCTCCTCCTCCTGCTGGGTCAAAAAATGAAGTATTAATATTTCGGTCAGTTAATAATATAGTAATTGCTCCAGCAAGTACTGGTAAAGAAAGTAATAGTAGTAAAGCTGTAATTACTACTGATCAAACAAATAGAGGTATTCGGTCAAAGGTAATACCTGTTGATCGTATATTAATAACTGTAGTAATAAAATTTACAGCTCCTAAAATTGAAGAAATTCCAGCTAGATGAAGAGAAAAAATAGCTAAGTCAACTGAAGCTCCTCCGTGAGCAATATTAGAGGATAGGGGAGGGTAAACAGTTCATCCGGTTCCAGCTCCATTTTCTACTATACTGCTTACTAGAAGAAGTGTTAATGCTGGTGGTAAAAGTCA。
(3)拼接序列2A和序列2B，得到1980年的拟羚足鬃麻蝇的DNA条形码序列全长，序列如下：
AACTTTATATTTTATTTTCGGAGCTTGAGCAGGAATAGTAGGAACATCACTAAGAATTCTTATTCGAGCAGAATTAGGTCACCCAGGAGCATTAATTGGTGATGATCAAATTTATAATGTAATCGTTACAGCACATGCCTTTATTATAATTTTCTTCATGGTAATACCAATCATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTACCTATCATACTAGGAGCTCCAGACATGGCTTTTCCTCGAATAAACAATATAAGTTTTTGACTTTTACCACCAGCATTAACACTTCTTCTAGTAAGCAGTATAGTAGAAAATGGAGCTGGAACCGGATGAACTGTTTACCCTCCCCTATCCTCTAATATTGCTCACGGAGGAGCTTCAGTTGACTTAGCTATTTTTTCTCTTCATCTAGCTGGAATTTCTTCAATTTTAGGAGCTGTAAATTTTATTACTACAGTTATTAATATACGATCAACAGGTATTACCTTTGACCGAATACCTCTATTTGTTTGATCAGTAGTAATTACAGCTTTACTACTATTACTTTCTTTACCAGTACTTGCTGGAGCAATTACTATATTATTAACTGACCGAAATATTAATACTTCATTTTTTGACCCAGCAGGAGGAGGAGATCCTATTTTATACCAACATCTATTT。
(4)以HCO2198和LCO1490为引物，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
(5)以LCO1490和HCO1995为引物对，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带；HCO2198和LCO1637为引物对，PCR的反应条件和体系同步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
实施例3
(1)与实施例1步骤(2)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取2001年的白头亚麻蝇(中山出入境检验检疫局媒介生物标本室)的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-3A。片段3A的序列如下：
AACTTTATACTTTATTTTTGGAGCTTGAGCAGGTATAGTAGGAACTTCACTAAGAATTCTTATTCGAGCAGAATTAGGTCATCCTGGTGCATTAATTGGAGATGACCAAATTTATAATGTAATTGTTACAGCTCATGCTTTTATTATAATTTTCTTTATAGTAATACCTATTATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAGTACCAATTATATTAGGAGCTCCAGACATGGCATTCCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCTCCAGCATTAACATTGCTTCTAGTAAGTAGTATAGTAGAAAATGGA。
(2)与实施例1步骤(3)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取2001年的白头亚麻蝇的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-3B。片段3B的序列如下：
AAATAAATGTTGGTATAAAATTGGGTCTCCTCCTCCAGCTGGATCGAAGAATGAGGTATTAATATTTCGATCAGTTAATAATATTGTAATTGCTCCTGCAAGTACTGGTAAAGATAGTAATAAAAGTAAAGCAGTAATTACTACTGATCATACAAATAAAGGTATTCGATCAAATGTAATACCTGTAGATCGTATATTAATAACTGTAGTAATAAAATTTACTGCTCCTAAAATTGAAGAAATTCCAGCTAAATGTAAAGAGAAAATAGCTAAATCAACAGAGGCTCCTCCATGAGCAATATTAGAAGATAAAGGAGGGTAAACAGTTCATCCTGTTCCAGCTCCATTTTCTACTATACTACTTACTAGAAGCAATGTTAATGCTGGAGGTAAAAGTCA。
(3)拼接序列3A和序列3B，得到2001年的白头亚麻蝇的DNA条形码序列全长，序列如下：
AACTTTATACTTTATTTTTGGAGCTTGAGCAGGTATAGTAGGAACTTCACTAAGAATTCTTATTCGAGCAGAATTAGGTCATCCTGGTGCATTAATTGGAGATGACCAAATTTATAATGTAATTGTTACAGCTCATGCTTTTATTATAATTTTCTTTATAGTAATACCTATTATAATTGGAGGGTTTGGAAATTGACTAGTACCAATTATATTAGGAGCTCCAGACATGGCATTCCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCTCCAGCATTAACATTGCTTCTAGTAAGTAGTATAGTAGAAAATGGAGCTGGAACAGGATGAACTGTTTACCCTCCTTTATCTTCTAATATTGCTCATGGAGGAGCCTCTGTTGATTTAGCTATTTTCTCTTTACATTTAGCTGGAATTTCTTCAATTTTAGGAGCAGTAAATTTTATTACTACAGTTATTAATATACGATCTACAGGTATTACATTTGATCGAATACCTTTATTTGTATGATCAGTAGTAATTACTGCTTTACTTTTATTACTATCTTTACCAGTACTTGCAGGAGCAATTACAATATTATTAACTGATCGAAATATTAATACCTCATTCTTCGATCCAGCTGGAGGAGGAGACCCAATTTTATACCAACATTTATTT。
(4)以HCO2198和LCO1490为引物，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
(5)以LCO1490和HCO1995为引物对，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带；HCO2198和LCO1637为引物对，PCR的反应条件和体系同步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
实施例4
(1)与实施例1步骤(2)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1996年的海南刺麻蝇(中山出入境检验检疫局媒介生物标本室)的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-4A。片段4A的序列如下：
AACTTTATACTTTATTTTCGGAGCTTGAGCAGGTATAGTAGGAACTTCATTAAGAATTCCTATTCGAGCAGAATTAGGTCATCCTGGTGCATTAATTGGAGATGATCAAATTTATAATGTAATTGTTACAGCTCACGCCTTCATTATAATTTTTTTTATAGTAATACCAATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCCAATTATATTAGGAGCCCCAGACATAGCCTTTCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCTCCAGCATTAACATTACTTCTAGTAAGCAGTATAATAGAAAATGGA。
(2)与实施例1步骤(3)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1996年的海南刺麻蝇的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-4B。片段4B的序列如下：
AAATAAATGTTGGTATAAAATTGGATCTCCTCCCCCTGCTGGATCAAAGAATGAAGTATTAATATTTCGGTCAGTTAATAATATAGTAATTGCTCCTGCAAGAACAGGAAGGGAAAGTAATAAAAGTAGAGCTGTGATTACTACTGATCAAACAAATAAAGGTATTCGGTCGAAAGTAATACCTGTAGATCGTATATTAATAACTGTAGTAATAAAATTTACTGCTCCTAAAATTGAGGAAATTCCAGCTAAATGAAGTGAGAAAATAGCTAAATCAACAGAAGCTCCTCCATGAGCAATATTAGAAGATAAGGGAGGATAAACAGTTCATCCTGTTCCAGCTCCATTTTCTATTATACTGCTTACTAGAAGTAATGTTAATGCTGGAGGTAAAAGTCA。
(3)拼接序列4A和序列4B，得到1996年的海南刺麻蝇的DNA条形码序列全长，序列如下：
AACTTTATACTTTATTTTCGGAGCTTGAGCAGGTATAGTAGGAACTTCATTAAGAATTCCTATTCGAGCAGAATTAGGTCATCCTGGTGCATTAATTGGAGATGATCAAATTTATAATGTAATTGTTACAGCTCACGCCTTCATTATAATTTTTTTTATAGTAATACCAATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCCAATTATATTAGGAGCCCCAGACATAGCCTTTCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCTCCAGCATTAACATTACTTCTAGTAAGCAGTATAATAGAAAATGGAGCTGGAACAGGATGAACTGTTTATCCTCCCTTATCTTCTAATATTGCTCATGGAGGAGCTTCTGTTGATTTAGCTATTTTCTCACTTCATTTAGCTGGAATTTCCTCAATTTTAGGAGCAGTAAATTTTATTACTACAGTTATTAATATACGATCTACAGGTATTACTTTCGACCGAATACCTTTATTTGTTTGATCAGTAGTAATCACAGCTCTACTTTTATTACTTTCCCTTCCTGTTCTTGCAGGAGCAATTACTATATTATTAACTGACCGAAATATTAATACTTCATTCTTTGATCCAGCAGGGGGAGGAGATCCAATTTTATACCAACATTTATTT。
(4)以HCO2198和LCO1490为引物，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
(5)以LCO1490和HCO1995为引物对，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带；HCO2198和LCO1637为引物对，PCR的反应条件和体系同步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
实施例5
(1)与实施例1步骤(2)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1983年的曲突钩麻蝇(中山出入境检验检疫局媒介生物标本室)的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-5A。片段5A的序列如下：
AACTTTATACTTTATTTTCGGAGCTTGAGCAGGAATAGTAGGAACTTCACTAAGAATTTTAATTCGAGCAGAATTAGGTCACCCAGGTGCACTAATTGGTGATGATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCTCATGCCTTTATTATAATTTTTTTTATAGTAATACCTATCATAATTGGAGGATTTGGAAACTGATTAGTACCAATTATACTAGGAGCTCCAGATATAGCTTTCCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCTCCTGCACTAACATTACTTCTAGTAAGCAGTATAGTAGAAAATGGG。
(2)与实施例1步骤(3)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1983年的曲突钩麻蝇的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-5B。片段5B的序列如下：
AAATAAATGTTGGTATAAAATAGGATCTCCTCCTCCGGCTGGGTCAAAGAATGACGTATTAATATTTCGGTCTGTTAGTAACATAGTAATTGCTCCAGCTAATACAGGTAAAGAAAGTAATAATAATAGAGCTGTAATCACTACTGATCATACGAATAAAGGTATTCGATCAAAGGTAATACCTGTTGATCGTATATTAATTACTGTAGTAATAAAATTAACTGCCCCTAAAATTGAAGAAATTCCTGCTAAATGAAGTGAGAAAATAGCTAAATCTACGGAAGCTCCTCCATGAGCAATGTTGGATGATAATGGAGGATAGACAGTTCATCCTGTTCCAGCCCCATTTTCTACTATACTGCTTACTAGAAGTAATGTTAGTGCAGGAGGTAAAAGTCA。
(3)拼接序列5A和序列5B，得到1983年的曲突钩麻蝇的DNA条形码序列全长，序列如下：
AACTTTATACTTTATTTTCGGAGCTTGAGCAGGAATAGTAGGAACTTCACTAAGAATTTTAATTCGAGCAGAATTAGGTCACCCAGGTGCACTAATTGGTGATGATCAAATTTATAATGTAATTGTAACAGCTCATGCCTTTATTATAATTTTTTTTATAGTAATACCTATCATAATTGGAGGATTTGGAAACTGATTAGTACCAATTATACTAGGAGCTCCAGATATAGCTTTCCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCTCCTGCACTAACATTACTTCTAGTAAGCAGTATAGTAGAAAATGGGGCTGGAACAGGATGAACTGTCTATCCTCCATTATCATCCAACATTGCTCATGGAGGAGCTTCCGTAGATTTAGCTATTTTCTCACTTCATTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGGGCAGTTAATTTTATTACTACAGTAATTAATATACGATCAACAGGTATTACCTTTGATCGAATACCTTTATTCGTATGATCAGTAGTGATTACAGCTCTATTATTATTACTTTCTTTACCTGTATTAGCTGGAGCAATTACTATGTTACTAACAGACCGAAATATTAATACGTCATTCTTTGACCCAGCCGGAGGAGGAGATCCTATTTTATACCAACATTTATTT。
(4)以HCO2198和LCO1490为引物，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
(5)以LCO1490和HCO1995为引物对，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带；HCO2198和LCO1637为引物对，PCR的反应条件和体系同步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
实施例6
(1)与实施例1步骤(2)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1973年的棕尾别麻蝇(中山出入境检验检疫局媒介生物标本室)的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-6A。片段6A的序列如下：
AACTTTATACTTTATTTTCGGAGCTTGAGCAGGTATAGTAGGAACTTCATTAAGAATTCTTATTCGAGCAGAATTAGGTCACCCTGGTGCATTAATTGGAGATGACCAAATTTATAACGTAATTGTTACAGCTCATGCCTTTATTATAATTTTTTTTATAGTAATGCCAATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGACTGGTACCAATTATATTAGGAGCCCCAGATATAGCTTTTCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCTCCAGCATTAACACTACTTCTAGTAAGCAGCATAGTAGAAAATGGA。
(2)与实施例1步骤(3)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1973年的棕尾别麻蝇的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-6B。片段6B的序列如下：
AAATAGATGTTGGTATAGAATTGGGTCTCCTCCTCCTGCAGGATCAAAAAATGAAGTATTAATATTTCGATCAGTTAATAATATTGTAATTGCTCCGGCAAGAACGGGTAAAGAAAGTAATAAAAGTAAAGCTGTAATTACTACTGATCATACAAATAAAGGCATTCGATCAAATGTAATACCAGAAGATCGTATATTAATAACTGTAGTAATAAAATTTACTGCTCCTAAAATTGATGAAATTCCAGCTAAATGAAGGGAGAAGATAGCTAAATCAACAGAAGCACCTCCATGGGCAATATTAGAAGATAAAGGAGGGTAAACAGTTCATCCTGTTCCAGCTCCATTTTCTACTATGCTGCTTACTAGAAGTAGTGTTAATGCTGGAGGTAAAAGTCA。
(3)拼接序列6A和序列6B，得到1973年的棕尾别麻蝇的DNA条形码序列全长，序列如下:
AACTTTATACTTTATTTTCGGAGCTTGAGCAGGTATAGTAGGAACTTCATTAAGAATTCTTATTCGAGCAGAATTAGGTCACCCTGGTGCATTAATTGGAGATGACCAAATTTATAACGTAATTGTTACAGCTCATGCCTTTATTATAATTTTTTTTATAGTAATGCCAATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGACTGGTACCAATTATATTAGGAGCCCCAGATATAGCTTTTCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCTCCAGCATTAACACTACTTCTAGTAAGCAGCATAGTAGAAAATGGAGCTGGAACAGGATGAACTGTTTACCCTCCTTTATCTTCTAATATTGCCCATGGAGGTGCTTCTGTTGATTTAGCTATCTTCTCCCTTCATTTAGCTGGAATTTCATCAATTTTAGGAGCAGTAAATTTTATTACTACAGTTATTAATATACGATCTTCTGGTATTACATTTGATCGAATGCCTTTATTTGTATGATCAGTAGTAATTACAGCTTTACTTTTATTACTTTCTTTACCCGTTCTTGCCGGAGCAATTACAATATTATTAACTGATCGAAATATTAATACTTCATTTTTTGATCCTGCAGGAGGAGGAGACCCAATTCTATACCAACATCTATTT。
(4)以HCO2198和LCO1490为引物，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
(5)以LCO1490和HCO1995为引物对，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带；HCO2198和LCO1637为引物对，PCR的反应条件和体系同步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
实施例7
(1)与实施例1步骤(2)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1989年的郭氏欧麻蝇(中山出入境检验检疫局媒介生物标本室)的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-7A。片段7A的序列如下：
AACTTTATATTTTATTTTTGGAGCTTGAGCTGGTATAGTAGGAACCTCTTTAAGAATCCTTATTCGAGCAGAATTAGGTCATCCAGGTGCATTAATTGGAGATGACCAAATTTATAATGTAATTGTTACAGCCCACGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAGTAATACCTATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTCCCAATTATATTAGGAGCACCAGATATAGCCTTCCCCCGAATGAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCTCCTGCCCTAACACTTCTTCTAGTGAGCAGCATAGTAGAAAATGGA。
(2)与实施例1步骤(3)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1989年的郭氏欧麻蝇的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-7B。片段7B的序列如下：
AAATAAATGTTGATATAAGATAGGATCTCCACCTCCTGCGGGATCAAAAAAGGAAGTATTGATGTTTCGATCAGTTAATAGTATAGTGATAGCTCCGGCAAGTACAGGTAAAGAAAGTAATAATAGCAATGCAGTAATTACTACTGATCACACAAATAGAGGTATTCGATCAAAAGTAATACCTGTAGATCGTATATTAATTACTGTGGTAATAAAATTTACTGCTCCTAAAATTGAGGAAATTCCCGCTAAATGTAAAGAAAAAATAGCTAAATCAACAGAAGCTCCTCCATGTGCAATATTAGATGATAGTGGAGGGTAAACAGTTCATCCAGTTCCAGCTCCATTTTCTACTATGCTGCTCACTAGAAGAAGTGTTAGGGCAGGAGGTAAAAGTCA。
(3)拼接序列7A和序列7B，得到1989年的郭氏欧麻蝇的DNA条形码序列全长，序列如下：
AACTTTATATTTTATTTTTGGAGCTTGAGCTGGTATAGTAGGAACCTCTTTAAGAATCCTTATTCGAGCAGAATTAGGTCATCCAGGTGCATTAATTGGAGATGACCAAATTTATAATGTAATTGTTACAGCCCACGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAGTAATACCTATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTCCCAATTATATTAGGAGCACCAGATATAGCCTTCCCCCGAATGAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCTCCTGCCCTAACACTTCTTCTAGTGAGCAGCATAGTAGAAAATGGAGCTGGAACTGGATGAACTGTTTACCCTCCACTATCATCTAATATTGCACATGGAGGAGCTTCTGTTGATTTAGCTATTTTTTCTTTACATTTAGCGGGAATTTCCTCAATTTTAGGAGCAGTAAATTTTATTACCACAGTAATTAATATACGATCTACAGGTATTACTTTTGATCGAATACCTCTATTTGTGTGATCAGTAGTAATTACTGCATTGCTATTATTACTTTCTTTACCTGTACTTGCCGGAGCTATCACTATACTATTAACTGATCGAAACATCAATACTTCCTTTTTTGATCCCGCAGGAGGTGGAGATCCTATCTTATATCAACATTTATTT。
(4)以HCO2198和LCO1490为引物，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
(5)以LCO1490和HCO1995为引物对，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带；HCO2198和LCO1637为引物对，PCR的反应条件和体系同步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
实施例8
(1)与实施例1步骤(2)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1991年的拟东方辛麻蝇(中山出入境检验检疫局媒介生物标本室)的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-8A。片段8A的序列如下：
AACTTTATACTTTATTTTCGGAGCTTGAGCGGGAATAGTAGGAACTTCCCTAAGAATCTTAATTCGAGCAGAATTAGGTCATCCAGGAGCACTAATTGGTGATGATCAAATTTATAACGTAATTGTCACAGCTCACGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAGTAATACCTATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTGCCAATTATATTAGGAGCCCCAGATATAGCTTTTCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCCCCTGCTCTAACATTACTTCTAGTAAGTAGTATAGTAGAAAATGGA。
(2)与实施例1步骤(3)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1991年的拟东方辛麻蝇的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-8B。片段8B的序列如下：
AAATAAATGTTGGTATAAAATAGGGTCTCCTCCTCCAGCTGGATCAAAGAATGATGTATTGATATTTCGATCTGTTAATAATATAGTAATGGCTCCGGCCAATACAGGTAAAGAAAGTAATAAAAGAAGAGCTGTAATTACTACTGATCATACGAATAAAGGTATTCGATCAAAAGTAATTCCTGTTGATCGTATATTAATTACTGTAGTAATAAAATTTACTGCTCCTAAAATTGAAGAAATTCCTGCTAAATGAAGTGAAAAAATAGCTAAATCTACAGAAGCTCCTCCATGAGCAATATTAGATGATAACGGAGGGTAAACAGTTCATCCTGTTCCAGCTCCATTTTCTACTATACTACTTACTAGAAGTAATGTTAGAGCAGGGGGTAAAAGTCA。
(3)拼接序列8A和序列8B，得到1991年的拟东方辛麻蝇的DNA条形码序列全长，序列如下：
AACTTTATACTTTATTTTCGGAGCTTGAGCGGGAATAGTAGGAACTTCCCTAAGAATCTTAATTCGAGCAGAATTAGGTCATCCAGGAGCACTAATTGGTGATGATCAAATTTATAACGTAATTGTCACAGCTCACGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAGTAATACCTATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTGCCAATTATATTAGGAGCCCCAGATATAGCTTTTCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGACTTTTACCCCCTGCTCTAACATTACTTCTAGTAAGTAGTATAGTAGAAAATGGAGCTGGAACAGGATGAACTGTTTACCCTCCGTTATCATCTAATATTGCTCATGGAGGAGCTTCTGTAGATTTAGCTATTTTTTCACTTCATTTAGCAGGAATTTCTTCAATTTTAGGAGCAGTAAATTTTATTACTACAGTAATTAATATACGATCAACAGGAATTACTTTTGATCGAATACCTTTATTCGTATGATCAGTAGTAATTACAGCTCTTCTTTTATTACTTTCTTTACCTGTATTGGCCGGAGCCATTACTATATTATTAACAGATCGAAATATCAATACATCATTCTTTGATCCAGCTGGAGGAGGAGACCCTATTTTATACCAACATTTATTT。
(4)以HCO2198和LCO1490为引物，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
(5)以LCO1490和HCO1995为引物对，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带；HCO2198和LCO1637为引物对，PCR的反应条件和体系同步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
实施例9
(1)与实施例1步骤(2)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1986年的黑尾黑麻蝇(中山出入境检验检疫局媒介生物标本室)的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-9A。片段9A的序列如下：
AACTTTATACTTTATTTTCGGAGCTTGAGCAGGTATAGTAGGAACTTCATTAAGAATTCTTATTCGAGCAGAATTAGGTCATCCTGGTGCATTAATTGGAGATGATCAAATTTATAACGTAATCGTTACAGCTCATGCTTTTATTATAATTTTCTTTATAGTGATACCAATTATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGATTAGTACCAATTATACTAGGAGCCCCAGATATAGCTTTCCCTCGAATAAATAATATAAGATTTTGACTTTTACCTCCAGCATTAACACTACTTCTAGTAAGCAGTATAGTAGAAAACGGA。
(2)与实施例1步骤(3)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1986年的黑尾黑麻蝇的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-9B。片段9B的序列如下：
AAATAAATGTTGATATAAAATAGGGTCTCCTCCTCCTGCAGGATCAAAAAATGAGGTATTAATATTTCGGTCAGTTAATAATATAGTAATTGCTCCCGCAAGTACAGGTAATGAGAGTAATAGAAGTAAAGCTGTAATTACTACTGATCATACAAATAAAGGTATTCGATCAAAAGTAATTCCTGTAGATCGTATATTAATAACTGTAGTAATAAAATTTACGGCTCCTAAAATTGAAGAGATTCCAGCTAGATGAAGAGAGAAAATAGCTAAATCAACAGAAGCACCCCCATGAGCAATATTAGATGATAAAGGAGGGTAAACAGTTCATCCTGTTCCAGCTCCGTTTTCTACTATACTGCTTACTAGAAGTAGTGTTAATGCTGGAGGTAAAAGTCA。
(3)拼接序列9A和序列9B，得到1986年的黑尾黑麻蝇的DNA条形码序列全长，序列如下：
AACTTTATACTTTATTTTCGGAGCTTGAGCAGGTATAGTAGGAACTTCATTAAGAATTCTTATTCGAGCAGAATTAGGTCATCCTGGTGCATTAATTGGAGATGATCAAATTTATAACGTAATCGTTACAGCTCATGCTTTTATTATAATTTTCTTTATAGTGATACCAATTATAATCGGAGGGTTTGGAAATTGATTAGTACCAATTATACTAGGAGCCCCAGATATAGCTTTCCCTCGAATAAATAATATAAGATTTTGACTTTTACCTCCAGCATTAACACTACTTCTAGTAAGCAGTATAGTAGAAAACGGAGCTGGAACAGGATGAACTGTTTACCCTCCTTTATCATCTAATATTGCTCATGGGGGTGCTTCTGTTGATTTAGCTATTTTCTCTCTTCATCTAGCTGGAATCTCTTCAATTTTAGGAGCCGTAAATTTTATTACTACAGTTATTAATATACGATCTACAGGAATTACTTTTGATCGAATACCTTTATTTGTATGATCAGTAGTAATTACAGCTTTACTTCTATTACTCTCATTACCTGTACTTGCGGGAGCAATTACTATATTATTAACTGACCGAAATATTAATACCTCATTTTTTGATCCTGCAGGAGGAGGAGACCCTATTTTATATCAACATTTATTT。
(4)以HCO2198和LCO1490为引物，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
(5)以LCO1490和HCO1995为引物对，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带；HCO2198和LCO1637为引物对，PCR的反应条件和体系同步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
实施例10
(1)与实施例1步骤(2)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1987年的盘突缅麻蝇(中山出入境检验检疫局媒介生物标本室)的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-10A。片段10A的序列如下：
AACTTTATATTTTATTTTCGGAGCTTGAGCTGGAATAGTAGGAACTTCTCTAAGAATTTTAATTCGAGCAGAATTAGGTCACCCAGGAGCCCTAATTGGAGATGACCCAATTTATAACGTAATTGTTACAGCTCATGCATTTATTATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTATAATTGGTGGATTCGGAAATTGATTAGTACCAATTATACTGGGAGCCCCAGATATAGCTTTCCCTCGAATAAACAATATAAGTTTTTGACTTTTACCTCCCGCTTTAACACTTCTTCTAGTAAGCAGTATAGTAGAAAATGGA。
(2)与实施例1步骤(3)相同，区别在于模板为通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取1987年的盘突缅麻蝇的一条后腿得到的基因组DNA，得到重组载体pGMT-10B。片段10B的序列如下：
AAATAAGTGTTGGTATAGAATAGGATCTCCTCCTCCTGCTGGGTCAAAAAATGAAGTATTAATATTTCGATCAGTTAATAATATAGTAATAGCTCCGGCAAGAACAGGTAAAGAAAGGAGTAAAAGTAAAGCTGTAATTACTACTGATCAAACAAATAACGGTATTCGATCAAAAGTAATACCCGTTGATCGTATATTAATAACTGTAGTAATAAAATTTACTGCTCCTAGAATTGAAGAAATTCCAGCTAAATGAAGAGAGAAAATAGCTAAATCAACTGAAGCTCCTCCATGAGCAATATTAGATGATAAAGGAGGGTAAACAGTTCATCCTGTTCCAGCTCCATTTTCTACTATACTGCTTACTAGAAGAAGTGTTAAAGCGGGAGGTAAAAGTCA。
(3)拼接序列10A和序列10B，得到1987年的盘突缅麻蝇的DNA条形码序列全长，序列如下：
AACTTTATATTTTATTTTCGGAGCTTGAGCTGGAATAGTAGGAACTTCTCTAAGAATTTTAATTCGAGCAGAATTAGGTCACCCAGGAGCCCTAATTGGAGATGACCCAATTTATAACGTAATTGTTACAGCTCATGCATTTATTATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTATAATTGGTGGATTCGGAAATTGATTAGTACCAATTATACTGGGAGCCCCAGATATAGCTTTCCCTCGAATAAACAATATAAGTTTTTGACTTTTACCTCCCGCTTTAACACTTCTTCTAGTAAGCAGTATAGTAGAAAATGGAGCTGGAACAGGATGAACTGTTTACCCTCCTTTATCATCTAATATTGCTCATGGAGGAGCTTCAGTTGATTTAGCTATTTTCTCTCTTCATTTAGCTGGAATTTCTTCAATTCTAGGAGCAGTAAATTTTATTACTACAGTTATTAATATACGATCAACGGGTATTACTTTTGATCGAATACCGTTATTTGTTTGATCAGTAGTAATTACAGCTTTACTTTTACTCCTTTCTTTACCTGTTCTTGCCGGAGCTATTACTATATTATTAACTGATCGAAATATTAATACTTCATTTTTTGACCCAGCAGGAGGAGGAGATCCTATTCTATACCAACACTTATTT。
(4)以HCO2198和LCO1490为引物，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
(5)以LCO1490和HCO1995为引物对，PCR的反应条件和体系同实施例1步骤(2)，未扩增到明显的特异条带；HCO2198和LCO1637为引物对，PCR的反应条件和体系同步骤(2)，未扩增到明显的特异条带。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长的方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)设计PCR所需要引物，如下：
LCO1728：5'-TCCTCGAATAAATAATATAAGTTTT-3'；
HCO1856：5'-GATAAACAGTTCATCCTGTTCCAGC-3'；
LCO1490：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
HCO2198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'；
(2)提取馆藏干制麻蝇标本的基因组DNA；
(3)扩增：
①以步骤(2)得到的基因组DNA为模板，以LCO1490为上游引物，HCO1856为下游引物，进行PCR，得到片段A；
②以步骤(2)得到的基因组DNA为模板，以LCO1728为上游引物，HCO2198为下游引物，进行PCR，得到片段B；
(4)测序：将步骤(3)得到的片段A和片段B分别克隆到克隆载体上，测序；拼接，得到从馆藏干制麻蝇标本的DNA条形码全长。
2.根据权利要求1所述从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长的方法，其特征在于：所述的麻蝇为羚足鬃麻蝇(Sarcorohdendorfia antilope)、拟羚足鬃麻蝇(Sarcorohdendorfia inextricata)、白头亚麻蝇(Parasarcophaga albiceps)、海南刺麻蝇(Sinonipponia hainanensis)、曲突钩麻蝇(Harpagophalla kempi)、棕尾别麻蝇(Boettcherisca peregrina)、郭氏欧麻蝇(Heteronychia quoi)、拟东方辛麻蝇(Seniorwhitea reciproca)、黑尾黑麻蝇(Helicophagella melanura)或盘突缅麻蝇(Burmanomyia pattoni)。
3.根据权利要求1所述从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的基因组DNA是通过动物组织基因组DNA提取试剂盒提取得到。
4.根据权利要求1所述从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的PCR中所使用的酶为Phusion超保真酶。
5.根据权利要求4所述从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的PCR的反应体系为：5倍Phusion HF缓冲液10μl，10mM dNTPs 1μl，正向引物和反向引物各1μl，Phusion超保真DNA聚合酶0.5μl，基因组DNA 2μl，用ddH2O补足50μl。
6.根据权利要求1所述从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的PCR的条件为：94℃变性5min；94℃40S、54℃40S、72℃1min，29个循环；72℃延伸10min。
7.根据权利要求1所述从馆藏干制麻蝇标本中扩增DNA条形码全长的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的克隆载体为T载体。
8.一种能实现权利要求1所述的方法的试剂盒，其特征在于包含如下两对引物：
第一对：
LCO1490：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
HCO1856：5'-GATAAACAGTTCATCCTGTTCCAGC-3'；
第二对：
HCO2198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'；
LCO1728：5'-TCCTCGAATAAATAATATAAGTTTT-3'。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：还包含酶、dNTP和反应缓冲液中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述的酶为Phusion超保真DNA聚合酶。
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2014
- 2014-07-28 CN CN201410364117.8A patent/CN104651351B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102367480A (zh) * | 2011-11-07 | 2012-03-07 | 中国农业大学 | 用于实蝇种类鉴定的方法及其专用pcr前体系 |
| CN102605093A (zh) * | 2012-04-10 | 2012-07-25 | 董志平 | 一种二点委夜蛾的分子鉴定方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| An optimised protocol for barcoding museum collections of decapod crustaceans：a case-study for a 10-40-years-old collection;Dario Zuccon et al.;《Invertebrate Systematics》;20121231;592-600 * |
| Recovering full DNA barcodes from natural history collections of Tephritid fruitflies (Tephritidae, Diptera) using mini barcodes;J.K.J.VAN HOUDT et al.;《Molecular Ecology Resources》;20101231;459-465 * |
| 应用DNA条形码技术鉴定未知双翅目蛹;岳巧云 等;《中国国境卫生检疫杂志》;20111031;第34卷(第5期);343-347 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104651351A (zh) | 2015-05-27 |
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