CN104644573B - 载三氧化二砷pH响应介孔二氧化硅纳米粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种载三氧化二砷pH响应介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，主要包括共沉淀法制备氨基改性介孔二氧化硅、静电吸附载入ATO、PAA酸碱共轭制备PAA‑ATO‑MSNs的步骤。本发明制备的PAA‑ATO‑MSNs透射电镜下外观呈圆形或类圆形，平均粒径为（158.6±1.32）nm，Zeta电位为（‑28.40±0.34）mV，包封率和载药量分别为（40.95±3.21）%，（11.42±1.75）%。体外释药具有pH响应性，累积释药量随pH减小而增大。药动学研究表明，与ATO‑Sol和ATO‑MSNs相比，PAA‑ATO‑MSNs的t1/2β显著延长，AUC显著增大（P<0.01）。PAA‑ATO‑MSNs体外释药具有明显的pH响应性及缓释特性，能明显改善大鼠体内药动学行为，该载体作为ATO肿瘤靶向递药系统具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备聚丙烯酸(PAA)修饰氨基改性介孔二氧化硅(MSNs)载三氧化二砷(ATO)纳米粒(PAA-ATO-MSNs)及其制备方法。
背景技术
三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是中药砒霜的有效活性成分，临床上主要用于急性早幼粒细胞白血病的治疗。有学者发现，ATO对多种实体瘤细胞也具有抑制生长和诱导凋亡作用，但由于ATO在体内分布缺乏特异性，达到有效浓度时对其他正常组织往往会产生严重的不良反应；此外，ATO半衰期短，给药后消除迅速，因此限制了其在实体瘤中的应用。
介孔二氧化硅纳米粒(mesoporous silica nanoparticles，MSNs)是一种新型的无机介孔材料，具有比表面积和孔容大，介孔结构高度有序，内外表面存在大量易于修饰的硅羟基，生物相容性好等优点。具有环境响应性(包括光敏、酶敏、温敏和pH敏等)的MSNs可以通过病灶微环境刺激药物载体而实现药物靶向释放，考虑到肿瘤部位的酸性(pH 5.5-6.5)比正常组织(pH 7.4)强，构建ATO pH响应递药系统对于提高药物肿瘤靶向性具有重要意义。
聚丙烯酸(polyacrylic acid，PAA)是一种无毒、可降解、带有负电荷、溶解度随pH减小而变差的pH敏感材料。本发明将MSNs内外表面氨基改性以期通过酸碱之间的静电作用包载弱酸性的ATO，再利用PAA对MSNs外表面进行酸碱共轭修饰，以封堵介孔，将ATO包封于MSNs内孔道；在酸性肿瘤部位，由于PAA溶解度减小质子化后从载体脱落打开介孔而释放药物，达到pH响应释药目的。本发明制备了聚丙烯酸修饰氨基改性介孔二氧化硅载三氧化二砷纳米粒(polyacrylic acid grafted arsenic trioxide amino-functionedmesoporous silica nanoparticles，PAA-ATO-MSNs)，并考察了其理化性质、体外释药特性及大鼠体内药动学行为，为ATO新型递药系统的构建及在肿瘤治疗中的应用提供参考。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚丙烯酸(PAA)修饰氨基改性介孔二氧化硅(MSNs)载三氧化二砷(ATO)纳米粒(PAA-ATO-MSNs)的制备方法。
为了实现上述技术目的，本发明采用了以下技术方案：
载三氧化二砷pH响应介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)NH2-MSNs的制备：0.3～0.6g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶于超纯水中，加入2mol/L NaOH溶液调节pH至11.5；80℃下磁力搅拌0.5h后，将含四乙氧基硅烷(TEOS)1mL和氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)0.5～1mL的混合液逐滴加到CTAB溶液中，反应2h，静置熟化6h，20000r/min离心30min，用酸性乙醇洗涤除去模板剂CTAB，所述酸性乙醇中无水乙醇与浓盐酸体积比10:1；水洗，离心，冷冻干燥，即得NH2-MSNs；
(2)PAA-ATO-MSNs的制备：称取NH2-MSNs冻干粉末40mg，加至10mL浓度为1mg/mL的三氧化二砷(ATO)溶液中，搅拌24h；20000r/min高速离心30min，除去游离ATO，水洗，离心，冷冻干燥，即得ATO-MSNs；称取ATO-MSNs冻干粉20mg溶于20mLDMF中，加入20mg聚丙烯酸(PAA)，100℃下搅拌反应2h，20 000r/min离心30min，产物用无水乙醇洗涤后水洗，离心，冷冻干燥，即得PAA-ATO-MSNs。
本发明的另一个目的在于提供一种由上述合成方法获得的载三氧化二砷pH响应介孔二氧化硅纳米粒。
本发明制备的PAA-ATO-MSNs透射电镜下外观呈圆形或类圆形，平均粒径为(158.6±1.32)nm，Zeta电位为(-28.40±0.34)mV，包封率和载药量分别为(40.95±3.21)％，(11.42±1.75)％。体外释药具有pH响应性，累积释药量随pH减小而增大。药动学研究表明，与ATO-Sol和ATO-MSNs相比，PAA-ATO-MSNs的t1/2β显著延长，AUC显著增大(P<0.01)。PAA-ATO-MSNs体外释药具有明显的pH响应性及缓释特性，能明显改善大鼠体内药动学行为，该载体作为ATO肿瘤靶向递药系统具有较好的应用前景。
本发明利用共沉淀法一步合成氨基改性介孔二氧化硅纳米粒，此方法制备的MSNs内外表面兼有氨基，介孔有序，具有较大的比表面积和孔容，Zeta电位大于40mV，为载酸性ATO提供了良好条件。实验结果表明，NH2-MSNs载药后，其Zeta电位明显下降，但仍带正电荷，可通过静电作用吸附带负电荷的PAA。FTIR图中在1693.22cm-1、1720.22cm-1出现酰胺和羧基中C＝O的伸缩振动峰，证明了PAA的存在。PAA的成功修饰依赖于与ATO-MSNs表面氨基及硅羟基的共价结合和静电吸附双重作用。此外，通过小角粉末衍射、氮气吸脱附等表征可以发现载药和PAA包裹后MSNs介孔结构有序性降低，比表面积、孔容和孔径均减小，这些归因于静电吸附作用使ATO占据了NH2-MSNs内部孔道且PAA修饰后封堵了部分介孔。文献表明，粒径在100-200nm范围内的纳米粒因其可增强EPR效应更易于在肿瘤部位蓄积。本发明制备的PAA-ATO-MSNs粒径大小在158.6nm左右，为PAA-ATO-MSNs向肿瘤组织富集提供了可能。
ATO为水溶性药物，为考察PAA-ATO-MSNs体外释药特性，选取不同pH(5.0、6.0、7.4)的PBS溶液作为释放介质。PAA-ATO-MSNs的体外释药行为表现出明显的pH响应性，在pH7.4条件下，ATO释放缓慢，24h仅释放40.52％；随pH减小释放量有所增大，在pH 5.0条件下24h累积释药量可达76.15％。主要由于在酸性条件下PAA质子化，溶解度变差易从载体上脱落，从而封堵的介孔被打开，释放出ATO；在中性或较高pH值条件下ATO则不易释放[15]。不同pH条件下，ATO-MSNs的释药也表现出微弱的pH响应性，可能是由于随着pH降低，MSNs内表面氨基质子化，且酸性药物ATO带电性下降，导致MSNs与ATO吸附能力减弱，从而利于药物释放。由释放曲线还可看出，酸性条件下，PAA-ATO-MSNs中药物在2h内存在一定的突释现象，而在pH 7.4下则很难释放，此结果提示了PAA-ATO-MSNs中ATO较适合肿瘤递药，在正常生理条件下不释药，而更好的蓄积于肿瘤组织后快速释药，从而发挥增加对肿瘤抑制作用，减小对正常组织细胞毒性作用。
本发明以ATO-Sol、ATO-MSNs为对照组，研究了大鼠尾静脉注射PAA-ATO-MSNs后体内药动学行为。药动学结果表明，将ATO制备成PAA-ATO-MSNs后，CL降低约为ATO-Sol、ATO-MSNs的1/3、1/2，t1/2β延长为ATO-Sol、ATO-MSNs的2.3倍、1.7倍，可能是因为PAA在pH近中性的血液中溶解度较大，去质子化后与MSNs表面氨基酸碱共轭结合，ATO不易释放，与体外释药研究结果相符。因此，PAA-ATO-MSNs在大鼠体内释药具有缓释特性，可延长药物在血液循环中的滞留时间，有望促进药物向肿瘤靶部位分布。
附图说明
图1是透射电镜图(A：NH2-MSNs；B：PAA-ATO-MSNs)。
图2是粒径图(A:NH2-MSNs；B:ATO-MSNs；C:PAA-ATO-MSNs)。
图3是Zeta图(A:NH2-MSNs；B:ATO-MSNs；C:PAA-ATO-MSNs)。
图4是NH2-MSNs和PAA-ATO-MSNs的小角射线衍射图。
图5是MSNs,NH2-MSNs and PAA-MSNs FTIR图。
图6是NH2-MSNs和PAA-ATO-MSNs氮气吸附-脱附等温线示意图。
图7是NH2-MSNs和PAA-ATO-MSNs孔径分布示意图。
图8是NH2-MSNs、ATO-MSNs和PAA-ATO-MSNs热重分析图。
图9是体外释药百分率曲线图。
图10是大鼠静脉给药后血浆药时曲线(n＝6)。
具体实施例
实施例1：纳米粒的制备
NH2-MSNs的制备：采用共沉淀法一步制备氨基化介孔二氧化硅。0.3g CTAB溶于超纯水中，加入适量2mol/L NaOH溶液调节pH至11.5左右。80℃下磁力搅拌0.5h后，将含TEOS1mL和APTES 0.5mL的混合液逐滴加到CTAB溶液中，反应2h，静置熟化6h，20 000r/min离心30min，酸性乙醇(无水乙醇与盐酸体积比10:1)洗涤三次以除去模板剂CTAB。超纯水洗三次，离心，冷冻干燥，即得NH2-MSNs。
PAA-ATO-MSNs的制备：精密称取MSNs冻干粉末40mg，加至1mg/mL ATO溶液10mL中，搅拌24h。20 000r/min高速离心30min，除去游离ATO，超纯水洗三次，离心，冷冻干燥，即得ATO-MSNs。精密称取ATO-MSNs冻干粉20mg溶于20mL DMF中，加入20mgPAA，100℃下搅拌反应2h，20 000r/min离心30min，产物用无水乙醇洗涤三次，超纯水洗涤三次，离心，冷冻干燥，即得PAA-ATO-MSNs。
采用高倍透射电子显微镜观察制备的MSNs的形貌，NH2-MSNs、PAA-ATO-MSNs形态见图1(×60 000)；室温下采用激光粒度仪测定纳米粒的粒径、粒径分布、Zeta电位，结果见表1和图2、3。NH2-MSNs、PAA-ATO-MSNs外观呈圆形或类圆形，粒径均一；由透射电镜放大图中可以看到，NH2-MSNs具有介孔网格结构，PAA-ATO-MSNs中则不明显。由图1PAA-ATO-MSNs形态放大图中还可看到，PAA-ATO-MSNs粒子表面光滑且具有“壳”层，即为修饰在MSNs表面的PAA层。NH2-MSNs载药后Zeta电位由43.60mV减小为19.97mV，PAA修饰后Zeta电位变为负值(-28.40mV)。
表1NH2-MSNs、ATO-MSNs和PAA-ATO-MSNs粒径、PDI、Zeta电位
采用X-射线衍射仪观察粒子的小角度X-射线衍射行为，衍射角为1～8°，扫描速度为1°/min，工作电压为40kV，工作电流为200mA，小角X射线衍射谱图见图4。在2～3°之间出现明显的衍射峰，表明产物具有有序介孔结构，当载药且PAA修饰包裹后衍射峰几乎消失。
采用红外光谱仪测定样品的红外吸收光谱，用溴化钾压片，4 000～400cm-1范围内扫描，红外光谱图见图5。在MSNs的红外图谱中，1083.82cm-1处处出现最大吸收峰，为Si-O-Si键的反对称伸缩振动；在800.33cm-1、462.84cm-1处分别为Si-O-Si键的对称伸缩振动和弯曲振动；在956.54cm-1、3446.23cm-1附近出现吸收峰分别为Si-OH的弯曲振动吸收和反对称伸缩振动峰，可以看到氨基化后峰强度均减弱。氨基化后1508.09cm-1处出现吸收峰为N-H的弯曲振动峰，说明介孔二氧化硅被氨基改性；PAA-MSNs红外图可知，1652.72cm-1、1720.22cm-1分别为酰胺和羧基中C＝O的伸缩振动峰。
采用氮气吸附仪绘制样品的氮气吸附-脱附等温线，计算样品的比表面积、孔径。样品测
定前150℃真空脱附6h，吸附-脱附等温线和孔径分布见图6和图7。使用软件计算得NH2-MSNs的比表面积、孔径、孔容分别为997.33m2/g、3.71nm、1.02cm3/g。样品具有介孔材料典型的Ⅳ型吸附等温线，吸附-脱附等温线几乎平行，属于H1型滞后环，说明介孔形状规则且孔径均一。当NH2-MSNs载ATO且表面修饰PAA后，比表面积、孔径、孔容分别
减小为512.28m2/g、2.56nm、
0.23cm3/g，这是由于ATO和PAA链占据了部分NH2-MSNs内外孔道表面。
利用热重分析仪测定PAA的接枝率，氮气保护下加热速率为10℃/min。如图8所示，由100℃加热到800℃时，NH2-MSNs、ATO-MSNs和PAA-ATO-MSNs的重量损失为18.5wt％、29.6wt％和39.8wt％。因此，PAA的接枝率为10.2wt％，ATO的载药量为11.1％。
实施例2：包封率和载药量的测定
仪器工作条件
RF功率：1150W；等离子体流量：50L/min；辅助气流量：0.5L/min；雾化器流量：0.3L/min；泵速：50r/min；仪器稳定延时：5s；清洗时间：30s；载气：氩气(纯度99.99％)；分析谱线：189nm。
线性关系考察
精密移取砷标准溶液适量，至100mL容量瓶中，用稀硝酸稀释至刻度，得质量分数为0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/L系列砷标准溶液。测定标准空白溶液和各标准溶液中各元素在189nm处的发射强度，以发射强度(Y)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，由软件iTAVA绘制出标准曲线并得相关系数：Y＝1847.2C+19.606(r＝0.9999)，表明砷质量浓度在0～8.0mg/L内线性关系良好。
包封率和载药量测定
量取载药纳米粒混悬液适量，置于具塞离心管中，室温下20 000r/min离心40min，精密量取上清液100μL于10mL容量瓶中，用稀硝酸稀释至刻度，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液按上述工作条件测定游离ATO含量，按下列公式分别计算MSNs中ATO的包封率和载药量。经计算，PAA-ATO-MSNs的包封率和载药量分别为(40.95±3.21)％，(11.42±1.75)％；该方法计算的载药量与热重分析法计算的载药量相近。
包封率＝(W0–W1)/W0×100％
载药量＝(W0–W1)/Wt×100％
其中，W0为总投药量；W1为MSNs中的游离药物量；Wt为MSNs的总重量。
实施3：体外释药研究
选用不同pH的PBS(5.0，6.0，7.4)溶液为释放介质，考察载药纳米粒中ATO的释放特征，精密称取适量ATO原药、ATO-MSNs及PAA-ATO-MSNs冻干粉(含ATO 0.5mg)用2mL释放介质溶解或分散，置于预先处理过的透析袋内，排除气泡后密封，置于100mL释放介质中，于(37±0.5)℃恒温水浴振荡(75r/min)，分别于0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24h准确取样2mL，并立即补加等量同温同pH新鲜释放介质，样品经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液稀释后测定释放介质中药物含量，计算累积释药率(Q％)，绘制释药曲线如图9。由图可知，ATO-Sol在不同pH条件下释药情况无显著性差异，在2h内几乎可达90％。ATO-MSNs的释药曲线表现出较弱的pH响应性，而PAA-ATO-MSNs则具有显著的pH响应性，随pH降低，ATO的释放量有所增加，在pH 5.0、6.0下24h累积释药量可达76.15％、59.80％，而pH 7.4下仅为40.52％。与ATO-Sol相比，ATO-MSNs和PAA-ATO-MSNs的体外释药均具有一定的缓释特征，而后者缓释特征更明显。
实施例4：大鼠体内药动学研究
给药方案及血样采集：精密称取ATO原药、ATO-MSNs、PAA-ATO-MSNs适量，于10mL容量瓶中，用0.9％生理盐水溶解并稀释至刻度，得ATO溶液、ATO-MSNs混悬液、PAA-ATO-MSNs混悬液。取健康SD大鼠18只，禁食12h，自由饮水，随机分为3组，每组6只。按ATO 1mg/kg单剂量尾静脉注射分别给予ATO溶液和PAA-ATO-MSNs混悬液。给药后分别于0.08、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24h经股动脉插管取血0.3mL，置肝素钠预处理的2mL具塞离心管中，3000r/min离心10min，分离血浆后，置-80℃低温冰箱保存待测。将离心后血细胞用与血清体积等量的0.9％生理盐水溶解，每次取血后立即由颈静脉插管补回。
血浆样品处理：精密移取血浆样品100μL置2mL具塞离心管中，加入高氯酸40μL，涡旋混合3min，于12 000r/min离心10min，取上清液100μL用稀硝酸稀释至5mL，充分涡旋振荡后进样分析。
血浆中ATO测定方法的建立：仪器工作条件RF功率：1500W；冷却气流量：15L/min；等离子气流量：15L/min；载气流量：0.81L/min；辅助气流量：0.22L/min；采样深度：8.1mm；采样锥孔径：1.0mm；截取锥孔径：0.4mm；扫描次数：3；重复次数：3；雾化器：100μL石英同心微流雾化器。
线性关系考察：精密移取砷标准溶液适量，至50mL容量瓶中，用稀硝酸稀释至刻度，配成质量浓度为20mg/L的砷标准溶液，临用前稀释为系列浓度。精密吸取空白血浆100μL 7份，分别加入系列浓度的标准溶液100μL，得质量浓度分别为0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50mg/L系列砷血浆溶液处理后稀释进样。以分析峰的响应值(Y)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制出标准曲线并得相关系数：Y＝2045.6C+1001.2(r＝0.9997)，表明砷质量浓度在0～2.50mg/L内线性关系良好。
回收率和精密度试验：精密移取砷标准溶液适量，配制低、中、高3个质量浓度(0.05、0.5、2.5mg/L)的血浆样品处理后进样测定，每个浓度平行测定3次，计算回收率。分别于日内测定5次，计算日内精密度。连续测定5天，计算日间精密度。结果显示，低、中、高3个质量浓度血浆样品的回收率分别为(90.17±4.38％)％、(91.65±5.12％)、(90.34±4.57％)；日内精密度分别为4.68％、4.25％、3.41％；日间精密度分别为9.77％、6.23％、5.46％。
数据处理：采用PKSolver药代动力学程序分析物浓度数据，并计算药代动力学参数。采用SPSS 17.0软件对同类参数间进行t检验，P<0.05表示有显著性差异。
药动学结果：大鼠尾静脉注射ATO-Sol、ATO-MSNs混悬液、PAA-ATO-MSNs混悬液后，平均血药浓度-时间(c-t)曲线见图10。药动学数据经拟合后符合开放式二室模型，所得主要药动学参数见表2，并对其进行统计学分析。由图10可以看出，PAA-ATO-MSNs组前5h较ATO-Sol组和ATO-MSNs混悬液组药物浓度下降缓慢，5h后各组血药浓度下降趋势相似。由表2可知，与ATO-Sol组和ATO-MSNs混悬液组相比，PAA-ATO-MSNs混悬液组t1/2β延长，体内清除率CL减小，AUC显著提高(p<0.01)，说明ATO制成PAA-ATO-MSNs后在大鼠体内具有缓释特点，PAA-MSNs改变了ATO在大鼠体内的药动学行为。
表2大鼠尾静脉给药后药动学参数(n＝6)
与ATO-Sol相比，**p<0.01；与ATO-MSNs相比，△△p<0.01
由实验结果可知，PAA-ATO-MSNs体外释药具有明显的pH响应性及缓释特性，能明显改善大鼠体内药动学行为，该载体作为ATO肿瘤靶向递药系统具有较好的应用前景。
Claims (2)
1.载三氧化二砷pH响应介孔二氧化硅纳米粒的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)NH2-MSNs的制备：0.3g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶于超纯水中，加入2mol/LNaOH溶液调节pH至11.5；80℃下磁力搅拌0.5h后，将含四乙氧基硅烷(TEOS)1mL和氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)0.5mL的混合液逐滴加到CTAB溶液中，反应2h，静置熟化6h，20000r/min离心30min，用酸性乙醇洗涤除去模板剂CTAB,所述酸性乙醇中无水乙醇与盐酸体积比10:1；水洗，离心，冷冻干燥，即得NH2-MSNs；
(2)PAA-ATO-MSNs的制备：称取NH2-MSNs冻干粉末40mg，加至10mL浓度为1mg/mL的三氧化二砷(ATO)溶液中，搅拌24h；20000r/min高速离心30min，除去游离ATO，水洗，离心，冷冻干燥，即得ATO-MSNs；称取ATO-MSNs冻干粉20mg溶于20mL DMF中，加入20mg聚丙烯酸(PAA)，100℃下搅拌反应2h，20 000r/min离心30min，产物用无水乙醇洗涤后水洗，离心，冷冻干燥，即得PAA-ATO-MSNs。
2.由权利要求1所述制备方法获得的载三氧化二砷pH响应介孔二氧化硅纳米粒。
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