CN104628878B - 一种树头菜多糖提取纯化方法及其用途 - Google Patents

一种树头菜多糖提取纯化方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种树头菜多糖提取纯化方法及其用途，特点是取树头菜进行微波脱水，微波功率为650W，脱水时间为10min，然后用刀式粉碎机粉碎直至粒度为40目得到树头菜干粉，将树头菜干粉置于回流装置中，加入体积浓度为95%的乙醇溶液，然后在97℃的恒温下回流提取3.6h得到树头菜粗多糖，将树头菜粗多糖加水溶解，用Sevag法重复进行纯化直至树头菜粗多糖在紫外检测中于260 nm和280 nm处无特征吸收峰为止，然后用丙酮、乙酸乙酯依次洗涤沉淀3次，最后在50℃条件下烘干得到纯度99.2%的树头菜多糖，该树头菜多糖具有在制备抗氧化剂方面的用途，优点是提取效率高、产品纯度高以及抗氧化剂性能强。

Description

一种树头菜多糖提取纯化方法及其用途
技术领域
本发明涉及一种多糖提取方法，尤其是涉及一种树头菜多糖提取纯化方法及其用途。
背景技术
树头菜(crateva unilocalaris Buch.)又名刺苞菜，我国多野生于云南、广东与广西等山区，素有森林蔬菜的美誉。树头菜的外形似香椿，多在春天采摘食用。它是一种刺藤乔木的伞状嫩尖，肥大香鲜。由于树头菜多生长于海拔1500米左右的湿润山区，需要适宜的气候条件才能生长，目前还没有被人工驯化与栽培。
树头菜具有很高的食用营养价值和中药药用价值。它含有丰富的蛋白质以及矿物质元素，对人体健康有着促进作用。同时，树头菜还是人们餐桌上的宠儿，可以凉拌也可翻炒，色香味俱全。树头菜还可入药，具有清热解毒、舒活筋络的疗效。在民间常作为清热解毒、舒筋活络的中草药使用。其根、叶均可入药，味苦性寒。根可治肝炎、痢疾、腹泻、风湿性关节炎、疟疾等；叶具有健胃之效；可解毒，治烂疮。树头菜营养丰富，含有氨基酸、维生素、矿物质、黄酮、糖类、挥发油、有机酸等多种生物活性成分，是一种典型的无污染、高品质的绿色蔬菜，具有很好的药食两用价值。多糖是一类重要的生物活性物质，广泛存在于各种植物中，具有增强免疫力、抗肿瘤、抗辐射、抗疲劳、降血糖、降血脂、延缓衰老等作用。目前对树头菜的研究主要以化学成分及分析方法为主，还没有针对树头菜多糖提取工艺的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提取效率高、产品纯度高以及抗氧化剂性强的树头菜多糖提取纯化方法及其用途。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种树头菜多糖提取纯化方法，具体步骤如下：取树头菜在室温条件下进行微波脱水，微波功率为650W，脱水时间为10min，然后用刀式粉碎机粉碎直至粒度为40目得到树头菜干粉，将树头菜干粉置于回流装置中，加入体积浓度为95%的乙醇溶液，然后在97℃的恒温下回流提取3.6h得到树头菜粗多糖，将树头菜粗多糖加水溶解，用Sevag法重复进行纯化去除蛋白、核酸，直至树头菜粗多糖在紫外检测中于260 nm和280 nm处无特征吸收峰为止，然后用丙酮、乙酸乙酯依次洗涤沉淀3次，最后在50℃条件下烘干得到纯度达99.2%的树头菜多糖产品。
所述的树头菜干粉与乙醇溶液的混合比例为1g：34.5ml。
所述的树头菜粗多糖与所述的水的混合比例为1g：25ml。
该树头菜多糖具有在制备抗氧化剂方面的用途。
所述的树头菜多糖清除羟基自由基的IC50值为0.735mg/mL。
所述的树头菜多糖清除超氧阴离子自由基的IC50值为0.802mg/mL。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种树头菜多糖提取纯化方法及其用途，利用响应面法优化树头菜多糖的提取率，得到的最佳提取条件为提取温度97 ℃、提取时间3.6 h、液料比34.5:1(mL:g)。树头菜粗多糖提取率为3.828%，最终树头菜多糖产品纯度达99.2%；体外抗氧化试验结果表明，树头菜多糖的抗氧化能力在一定质量浓度范围内呈量效关系，树头菜多糖的还原能力、对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力均表现出较好的效果，清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的IC50分别为0.735mg/mL和0.802mg/mL，其抗氧化能力高于VC和TBHQ，是一种很好的天然抗氧化剂。
附图说明
图1为提取温度与树头菜粗多糖提取率的关系图；
图2为液料比与树头菜粗多糖提取率的关系图；
图3为提取时间与树头菜粗多糖提取率的关系图；
图4为颗粒尺寸与树头菜粗多糖提取率的关系图；
图5为树头菜多糖、VC和TBHQ三者的还原力比较图；
图6为树头菜多糖、VC和TBHQ三者对羟基自由基的清除率比较图；
图7为树头菜多糖、VC和TBHQ三者对超氧阴离子自由基的清除率比较图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、试验方法
1、多糖含量测定
以葡萄糖为标样，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。标准曲线回归方程（该方程为紫外可见分光光度法得到的方程）为A=0.0474+4.8901x，(x为葡萄糖质量浓度，范围为20～120mg/L，A为吸光度)，R=0.9990，根据方程可计算多糖含量。树头菜粗多糖提取率/%=(提取液中多糖含量/原料干质量)×100。
2、以VC和TBHQ为对照，还原力、羟基自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率的测定方法如下：
（1）还原力的测定：去不同质量浓度的纯化样品溶液1.0ml于10mL比色管中，加入pH6.6的磷酸缓冲溶液（200mmol/L）2.5ml，1%铁氰化钾1.0mL，混匀后在50℃水浴中保温20min，迅速冷却，加入10%三氯乙酸1.0mL，用蒸馏水稀释至刻度。以3000r/min离心10min，取上清液2.5mL，加入0.1%FeCl31.0mL，用蒸馏水稀释至5mL，10min后于700nm处测定吸光度，用蒸馏水做参比，以VC和TBHQ为对照，吸光度大小表示还原能力强弱。
（2）羟基自由基清除率测定：在10mL比色管中依次加入9mmol/L FeSO41.0mL，10mmol/L水杨酸-乙醇溶液1.0mL，不同质量浓度样品溶液1.0mL，9mmol/LH2O21.0mL，于37℃水浴中反映30min，取出用蒸馏水稀释至刻度。在510nm处测定吸光度，用蒸馏水做参比，以VC和TBHQ为对照。清除率计算公式：
清除率/% = A0-(Ax-Ax0)/A0*100，式中：A0为空白对照液的吸光度；Ax为样品溶液的吸光度；Ax0为不加H2O2的样品溶液吸光度。
（3）超氧阴离子自由基清除率的测定：在10mL比色管中加入pH8.2的Tris-HCl缓冲液（50mmol/L）4.0mL，不同质量浓度的样品溶液1.0mL，于25℃水浴中放置10min，加入25mmol/L邻苯三酚0.1mL，混匀于25℃水浴中放置5min，立即加入10mol/LHCl 2滴终止反应，于325nm处测吸光度。以Tris-HCl缓冲液作参比，VC和TBHQ为对照。按下面公式计算清除率：清除率/% = A0-(Ax-Ax0)/A0*100，式中：A0为空白对照液的吸光度；Ax为样品溶液的吸光度；Ax0为不加邻苯三酚的样品溶液吸光度。
二、具体实施例
具体实施例一
1、材料、试剂与设备
树头菜嫩茎叶采自连云港市云龙涧风景区；乙醇、无水乙醚、丙酮、硫酸、苯酚、葡萄糖、抗坏血酸(VC)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、邻苯三酚、水杨酸、三羟基氨基甲烷(Tris)、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁均为分析纯 上海国药集团。UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）； RE-5285A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)； TDL-4型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。
2、树头菜多糖提取纯化方法，具体步骤如下：
取树头菜在室温条件下进行微波脱水，微波功率为650W，脱水时间为10min（此功率时间在节能的前提下还能最大程度下提高脱水速率），然后用刀式粉碎机粉碎直至粒度为40目得到树头菜干粉，将树头菜干粉置于回流装置中，加入体积浓度为95%的乙醇溶液，然后在97℃的恒温下回流提取3.6h得到树头菜粗多糖，将树头菜粗多糖加水溶解，用Sevag法重复进行纯化去除蛋白、核酸，直至树头菜粗多糖在紫外检测中于260 nm和280 nm处无特征吸收峰为止，最后在50℃条件下烘干得到纯度达99.2%的树头菜多糖产品。上述树头菜干粉与乙醇溶液的混合比例为1g：34.5ml，树头菜粗多糖与水的混合比例为1g：25ml。
具体实施例二
最佳提取条件确定
1、单因素试验
选择提取温度(60～100℃)、提取时间(2～4h)、液料比(10～30:1mL/g)、颗粒尺寸(20～80目)进行单因素试验。
1.1 提取温度对树头菜粗多糖提取率的影响
在提取时间3h、液料比25:1、提取1次的条件下，考察不同提取温度对多糖提取率的影响，结果如图1所示。随提取温度的上升，树头菜粗多糖提取率迅速增加，温度达到80℃后，多糖提取率增加缓慢，因此提取温度选90℃为宜。
1.2 液料比对树头菜粗多糖提取率的影响
在提取时间3.5h，提取温度90℃，提取1次的条件下，考察不同液料比对多糖提取率的影响，结果如图2所示。在液料比达到25:1后，树头菜粗多糖提取率已经渐趋平稳，故控制液料比30:1为宜。
1.3 提取时间对多糖提取率的影响
在提取温度90℃，液料比25:1、提取1次的条件下，考察不同提取时间对树头菜粗多糖提取率的影响，结果如图3所示。树头菜粗多糖提取率随提取时间的增加而增大，3.5h达到最大值，因此，提取时间选3.5h为宜。
1.4原料颗粒大小对多糖提取率的影响
在提取温度90℃，提取时间3.5h，液料比25:1、提取1次的条件下，考察原料颗粒尺寸对多糖提取率的影响，结果如图4所示。由图可见，树头菜干粉颗粒尺寸达40目时树头菜粗多糖提取率达最大值，当颗粒尺寸继续减小时多糖提取率反而下降，故选择树头菜干粉颗粒40目为宜。
2、响应面优化试验
以单因素试验为基础，选择提取温度、提取时间、液料比为自变量，树头菜粗多糖提取率为响应值进行响应面优化试验，数据处理采用Design Expert8.05统计软件分析。因素水平设计见表1，
表1 响应面优化试验因素水平表
响应面试验优化树头菜粗多糖提取参数的结果见表2，将所得的试验数据用Design-Expert软件处理，得到树头菜粗多糖提取率对提取时间A、提取温度B和液料比C的二次多项回归方程：树头菜粗多糖提取率/% = 3.4243＋0.1538A＋0.3404B＋0.5991C－0.0415AB＋0.0740AC＋0.0643BC－0.3701A 2－0.2613B 2－0.3618C 2
表2 树头菜粗多糖提取响应面试验设计方案及结果
表3 回归模型的方差分析
注：P＜0.05，差异显著；P＜0.01，差异极显著。
表3表明回归模型达到了极显著水平(P＜0.0001)。模型的相关系数R 2 = 0.9907，修正相关系数R 2 Adj = 0.9788，表明模型拟合程度较好，可用此模型对树头菜粗多糖的提取进行分析和预测。方程一次项和二次项对树头菜粗多糖提取率的影响均达极显著水平，交互项AB、AC、BC的影响不显著。三个因素对树头菜粗多糖提取率的影响顺序为C＞B＞A，即液料比＞提取温度＞提取时间。
通过软件Design-Expert求解回归方程，得到树头菜多糖的最佳提取工艺条件为提取时间3.63h、提取温度97.43℃，液料比34.41:1(mL:g)，树头菜粗多糖提取率可达3.846%。考虑实际操作，将实验条件修正为提取时间3.6h、提取温度97℃、液料比34.5:1(mL:g)。在此条件下进行3组平行实验，测定实际提取率为3.828%。说明回归方程模型用于优化筛选树头菜粗多糖提取工艺是可行的。
具体实施例三
树头菜多糖的抗氧化活性测定
将提取的树头菜粗多糖加水溶解，用Sevag法重复进行纯化，去除蛋白、核酸等杂质，至紫外检测在260 nm和280 nm处无特征吸收峰为止。然后用丙酮、乙酸乙酯依次洗涤沉淀3次，低温烘干得纯度达99.2%的树头菜多糖产品，用于抗氧化活性测定。以维生素C(VC)和TBHQ为对照，对树头菜多糖纯化样品进行还原力、羟基自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率测定。
1. 树头菜多糖的还原能力
由试验结果图5可知，在实验质量浓度范围内，树头菜多糖的还原能力与质量浓度呈线性关系。对Fe3+的还原作用能力大小顺序为VC＞树头菜多糖＞TBHQ。
2.羟基自由基清除能力
由试验结果图6可知，在所选质量浓度范围内，随着树头菜多糖质量浓度的增加，对羟基自由基的清除率增大。在样品质量浓度小于0.6mg/mL时，对羟基自由基的清除能力大小顺序为TBHQ＞树头菜多糖＞VC，样品质量浓度大于0.6mg/mL，对羟基自由基的清除能力大小顺序为树头菜多糖＞VC＞TBHQ。根据线性回归方程可以得到树头菜多糖清除羟基自由基的IC50为0.735mg/mL，VC的IC50为0.776mg /mL，TBHQ的IC50为0.815mg/mL，说明树头菜多糖清除羟基自由基的能力高于VC和TBHQ。
3.超氧阴离子自由基清除能力
由试验结果图7可知，在所选质量浓度范围内，随着树头菜多糖质量浓度的增大，对超氧阴离子自由基的清除作用增强。树头菜多糖的IC50为0.802mg/mL，VC的IC50为0.831mg/mL，TBHQ的IC50为0.927mg/mL。表明树头菜多糖对超氧阴离子自由基的清除能力比VC和TBHQ高。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种树头菜多糖提取纯化方法，其特征在于具体步骤如下：取树头菜在室温条件下进行微波脱水，微波功率为650W，脱水时间为10min，然后用刀式粉碎机粉碎直至粒度为40目得到树头菜干粉，将树头菜干粉置于回流装置中，加入体积浓度为95％的乙醇溶液，然后在97℃的恒温下回流提取3.6h得到树头菜粗多糖，将树头菜粗多糖加水溶解，用Sevag法重复进行纯化直至树头菜粗多糖在紫外检测中于260nm和280nm处无特征吸收峰为止，然后用丙酮、乙酸乙酯依次洗涤沉淀3次，最后在50℃条件下，烘干得到纯度达99.2％的树头菜多糖产品。
2.根据权利要求1所述的一种树头菜多糖提取纯化方法，其特征在于：所述的树头菜干粉与所述的乙醇溶液的混合比例为1g：34.5ml。
3.根据权利要求1所述的一种树头菜多糖提取纯化方法，其特征在于：所述的树头菜粗多糖与所述的水的混合比例为1g：25ml。
4.一种权利要求1所述的方法得到的树头菜多糖产品的用途，其特征在于：该树头菜多糖具有在制备抗氧化剂方面的用途。
5.根据权利要求4所述的一种树头菜多糖产品的用途，其特征在于：所述的树头菜多糖清除羟基自由基的IC50值为0.735mg/mL。
6.根据权利要求4所述的一种树头菜多糖产品的用途，其特征在于：所述的树头菜多糖清除超氧阴离子自由基的IC50值为0.802mg/mL。
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