CN104622871B

CN104622871B - 一种恶唑酮类化合物作为变异链球菌生物膜抑制剂的应用

Info

Publication number: CN104622871B
Application number: CN201510029929.1A
Authority: CN
Inventors: 李雨庆; 陈卢璐; 任智; 李明云; 李继遥; 邹静
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2015-01-21
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2035-01-21
Also published as: CN104622871A

Abstract

本发明公开了一种恶唑酮类化合物作为变异链球菌生物膜抑制剂的应用，属于抑菌药物的筛选技术领域。该化合物的化学名称为2‑(4‑氯苯基)‑4‑{[(6‑甲基‑2‑吡啶基)胺基]亚甲基}‑1,3‑恶唑‑5(4氢)‑酮，上述恶唑酮类化合物溶于DMSO形成的抑制剂能够抑制变异链球菌生物膜形成和成熟。该抑制剂具有分子量小，结构简单，特异性好，针对性强等优点，能够显著抑制龋病的主要致病菌——变异链球菌生物膜的形成和成熟，而对浮游状态下的变异链球菌的影响不明显。本抑制剂有防龋的潜力，可以作为新型防龋策略的候选靶向药物。

Description

一种恶唑酮类化合物作为变异链球菌生物膜抑制剂的应用

技术领域

本发明属于抑菌药物的筛选技术领域，具体涉及一种能够抑制变异链球菌生物膜形成和成熟的小分子化合物，即恶唑酮类化合物作为变异链球菌生物膜抑制剂的应用。

背景技术

龋病是人类最常见的牙齿疾病，引起牙齿颜色、形态、质地的进行性破坏，严重影响口腔的发音、咀嚼、语言等功能。无论是婴儿、青少年或成人，都具有患龋风险。龋病已经成为全球普遍存在的口腔健康及公共卫生问题(Jeon et al.,2011)。世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。

口腔链球菌，尤其是变异链球菌，是主要的龋病相关性细菌(Bowen et al.,2011)。牙菌斑生物膜是细菌在口腔中的主要存在形式，与龋病的发生有直接联系。流行病学研究发现，牙菌斑生物膜中变异链球菌的检出率与龋病的发生呈正相关。变异链球菌在牙面上定植并形成菌斑生物膜的能力与龋病的病因和发病过程关系密切(Takahashi et al.,2011)。葡萄糖基转移酶(glucosyltransferase，Gtfs)是变异链球菌重要的致龋因子。变异链球菌利用Gtfs代谢碳水化合物产生胞外多糖，在口腔细菌表面粘附及生物膜形成方面具有重要作用。因此，Gtfs被公认为是口腔链球菌，特别是变异链球菌，最重要的致龋毒力因子之一(Koo et al.,2010)。

控制龋病最有效的方法就是菌斑控制，包括抑制菌斑生物膜形成并定期清除牙面上的菌斑生物膜(Featherstone,2004)。然而，目前龋病的临床防治策略并不是采取药物干预龋病进展，而是单纯被动地针对龋病的结局——龋洞进行治疗。氟化物因具有逆转牙体脱矿、促进再矿化的作用而一直被用于龋病的防治。但是，氟化物防龋效果存在争议：首先，摄入过多氟化物可能造成氟中毒；其次，氟化物对于牙齿的作用部位具有选择性，对咬合面的点隙裂沟龋效果较差；同时，氟化物对牙菌斑的作用甚微，无法从病因学角度彻底控制龋病(Cheng et al.,2007)。

研究表明，变异链球菌gtfB、gtfC和gtfD基因(分别编码Gtf B、Gtf C和Gtf D蛋白质，简称Gtfs)失活后，其体外形成生物膜的细胞及胞外基质受到影响，从而使变异链球菌生物膜形成功能不全(Koo et al.,2010)。这一研究结果提示，如果通过外源性手段特异性抑制变异链球菌Gtfs，则可抑制口腔生物膜形成，进而对龋病防治提供新的思路和途径。

因此，从龋病病因学和发病机制的角度出发，寻找新的防龋策略并研发新的防龋药物是目前亟待解决的问题。同时，我们需要克服现有龋病防治策略的不足，寻找能够有效抑制和清除牙菌斑生物膜的新型靶向药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种恶唑酮类化合物作为变异链球菌生物膜抑制剂的应用，所述抑制剂能够抑制变异链球菌生物膜形成和成熟，而对浮游状态的变异链球菌生长无明显抑制作用。

本发明通过以下技术方案实现：申请人通过实验筛选出一种恶唑酮类化合物，该化合物具有如下所述的结构：

该恶唑酮类化合物是一种已知化合物，其中文名称为2-(4-氯苯基)-4-{[(6-甲基-2-吡啶基)胺基]亚甲基}-1,3-恶唑-5(4氢)-酮；其英文名称为2-(4-chlorophenyl)-4-{[(6-methyl-2-pyridinyl)amino]methylene}-1,3-oxazol-5(4H)-one。

其ZINC数据库ID为ZINC04099351；分子式为C₁₆H₁₂ClN₃O₂；分子量为：313.74；国际化合物标识是：

InChI＝1S/C16H12ClN3O2/c1-10-3-2-4-14(19-10)18-9-13-16(21)22-15(20-13)11-5-7-12(17)8-6-11/h2-9H,1H3,(H,18,19)；老鼠口服半数致死量(Rat Oral LD₅₀)为37.2mg/Kg。

该化合物可以从商业途径购买得到，本发明所使用的该化合物是从荷兰Specs公司(网址：http://www.specs.net)购买得到。

所述抑制剂由下述方法制备：

(1)将粉末状的2-(4-氯苯基)-4-{[(6-甲基-2-吡啶基)胺基]亚甲基}-1,3-恶唑-5(4氢)-酮11.9mg溶解到238μL的二甲基亚砜(DMSO)溶剂中，配制成原始浓度为50mg/mL的抑制剂母液；

(2)将上述配好的抑制剂母液用二甲基亚砜(DMSO)进行梯度稀释，并加入至牛心脑浸液(BHI)液体培养基中，使其抑制剂的最终浓度分别为：0.05μg/mL，0.5μg/mL，5μg/mL和50μg/mL，而溶剂DMSO的最终浓度均为1％v/v。

本发明涉及的变异链球菌菌株的公共获得来源为：中国医学细菌保藏管理中心，菌种编号为：32401(网址：http://www.cmccb.org.cn/)。

本发明测定了恶唑酮类化合物作为抑制剂对变异链球菌生物膜的抑制作用。本发明中将不同浓度(0.05μg/mL，0.5μg/mL，5μg/mL和50μg/mL)的抑制剂添加到用于培养变异链球菌生物膜的液体培养基中，使各组中二甲基亚砜(DMSO)终浓度均为1％v/v，再分别接种经过夜活化培养的变异链球菌于37℃兼性厌氧培养24小时后弃上清液，漂洗生物膜细胞，重悬并稀释细胞，于BHI固体培养基进行培养，通过读取细菌菌落形成单位(CFU)来判断抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制效果。对照1为不添加抑制剂，对照2为添加终浓度为1％v/v的二甲基亚砜(DMSO)，实验过程中的数据是与两个对照组比较来评价利用抑制剂得到的抑制效果。实验结果表明：所述抑制剂对于变异链球菌生物膜的形成有明显的抑制作用。

采用同样的方法，通过与对照组比较还测定了抑制剂对变异链球菌24小时生物膜进一步成熟的抑制效果。实验结果表明：所述抑制剂对于变异链球菌生物膜的成熟有明显的抑制作用。

最后，本发明将不同浓度的抑制剂添加到用于培养浮游状态变异链球菌的液体培养基中，接种变异链球菌后于37℃兼性厌氧培养16小时，通过读取各595nm波长下的OD值并与对照组比较来判断变异链球菌的浮游生长是否受到影响。对照1、2如上所述，对照3为添加250μg/mL氨苄西林的液体培养基。通过与3个对照组比较来评价抑制剂对变异链球菌的浮游生长的影响。实验结果表明：所述抑制剂对于浮游状态的变异链球菌生长无明显抑制作用。

本发明的优点如下：

1、本发明涉及的抑制剂溶质分子量小，结构相对简单，较易溶于多种溶剂。

2、本发明涉及的抑制剂特异性好，针对性强，能够显著抑制变异链球菌生物膜的形成和成熟，而对浮游状态下的变异链球菌的影响不明显。

3、本发明涉及的抑制剂有效地克服了现有防龋药物氟化物不能靶向牙菌斑生物膜的不足，能够有效抑制变异链球菌生物膜的形成和成熟，可以作为新型防龋策略的候选靶向药物。

附图说明

图1是抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制结果。从左到右分别为添加抑制剂(从左到右终浓度分别为：50，5，0.5，0.05μg/mL)的处理组，添加DMSO的对照组，和不添加DMSO的对照组。

图2是抑制剂对变异链球菌24小时生物膜进一步成熟的抑制结果。从上到下分别为添加及不添加DMSO的对照组，添加5μg/mL抑制剂的处理组，和添加50μg/mL抑制剂的处理组。

图3是抑制剂对浮游状态下变异链球菌生长的影响。

图4是酶谱法分析抑制剂对变异链球菌Gtfs蛋白质活性的影响。图左为未经抑制剂处理的变异链球菌(菌种编号为：32401)，即对照组。图右为加入50μg/mL抑制剂处理后的变异链球菌。

具体实施方式

实施例1：菌株的培养和液体抑制剂的配制

供试菌株的准备：

本实施例的供试菌株涉及变异链球菌(菌株编号：32401；从中国医学细菌保藏管理中心获得，网址：http://www.cmccb.org.cn/)。

培养基的组分及制备：

牛心脑浸液(为了叙述方便，以下简称为BHI)液体培养基的组分及其配制方法：将37g商购的BHI粉末(该BHI粉末购自美国Sigma公司，货号：53286)加入1000mL蒸馏水中，高温高压(121.3℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后待用。该液体培养基是针对变异链球菌浮游培养的典型液体培养基。

BHI蔗糖液体培养基的组分及其配制方法：分别将37g商购BHI粉末该BHI粉末购自美国Sigma公司，货号：53286)和10g蔗糖(Thermo Fisher Scientific，USA，货号：S3-500)加入1000mL蒸馏水中，高温高压(121.3℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后待用。该液体培养基是针对变异链球菌生物膜培养的典型液体培养基。

BHI固体培养基的组分及其配制方法：将52g商购BHI粉末(该BHI粉末购自美国Sigma公司，货号：70138)加入1000mL蒸馏水中，高温高压(121.3℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后待用。该固体培养基是针对变异链球菌菌落分离培养的典型固体培养基。

抑制剂的准备：

本实施例的抑制剂(2-(4-氯苯基)-4-{[(6-甲基-2-吡啶基)胺基]亚甲基}-1,3-恶唑-5(4氢)-酮)以溶液状态使用。采用二甲基亚砜(即DMSO，该DMSO购自美国Thermo公司，货号：BP231-4)溶解抑制剂粉剂以便于后续实验使用。具体配制方法：首先将向238μL的DMSO中加入11.9mg抑制剂粉剂，使之成为原始浓度为50mg/mL的抑制剂母液贮存备用。后续实验中，将上述配好的抑制剂母液进行梯度稀释。向20μL母液中加入180μL DMSO，使之成为浓度为5mg/mL的溶液；取20μL浓度为5mg/mL的溶液，加入180μL DMSO，使之成为浓度为0.5mg/mL的溶液。取20μL浓度为0.5mg/mL的溶液，加入180μL DMSO，使之成为浓度为0.05mg/mL的溶液。最终，配置上述4种浓度的贮存液各80μL，分别加入到80mL的液体培养基中，使抑制剂的最终浓度分别为：0.05μg/mL，0.5μg/mL，5μg/mL和50μg/mL，溶剂DMSO的最终浓度均为1％v/v。

接种及培养方法

将变异链球菌(菌种编号为：32401)菌液接种于BHI固体培养基上，37℃、兼性厌氧(5％CO₂)培养24小时。用接种环挑取一个单菌落接种于3mL BHI液体培养基，37℃、兼性厌氧(5％CO₂)培养。用紫外可见光分光光度计测定其在595nm波长的吸收值(OD₅₉₅)，将培养至对数生长期(OD₅₉₅≈0.6)的菌悬液按照1：100比例稀释于BHI液体培养基(用于培养浮游状态的变异链球菌)或BHI蔗糖液体培养基(用于培养变异链球菌生物膜)并分装到48孔板中继续培养。整个操作在生物安全柜的无菌条件下进行。

实施例2：抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制实验

按照实施例1的无菌操作程序，将实施例1的变异链球菌菌悬液(菌种编号为：32401)分别接种于含不同浓度抑制剂的BHI蔗糖液体培养基中，以确定抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制活性。具体方法是：按照1：100比例将实施例1中的变异链球菌菌悬液分别接种到含有终浓度为0.05μg/mL，0.5μg/mL，5μg/mL和50μg/mL抑制剂的BHI蔗糖液体培养基中，于37℃、兼性厌氧(5％CO₂)培养16小时。然后，小心吸出48孔板中的浮游细菌及上清液，用pH＝7.4，0.01M的磷酸盐缓冲液(该缓冲液购自美国Thermo公司，货号：P5368。一袋内容物溶于1000mL去离子水，摇匀)清洗并洗脱底部的生物膜细胞，经10⁶稀释后，涂布于BHI固体培养基。经37℃、兼性厌氧(5％CO₂)培养48小时后，读取BHI固体培养基上的菌落形成单位(CFU)数目，每组细菌浓度以lg^CFU/mL表示。对照1为不添加抑制剂，对照2为添加终浓度为1％v/v的二甲基亚砜(即DMSO，该DMSO购自美国Thermo公司，货号：BP231-4)。实验过程中的数据是与两个对照进行比较来评价抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制效果，实验结果如图1所示。从图1可以看出加入终浓度为50μg/mL的抑制剂，对变异链球菌生物膜形成的抑制效果最明显。加入终浓度为5μg/mL的抑制剂，抑制效果次之。加入终浓度为0.5μg/mL的抑制剂，抑制效果再次之。加入终浓度为0.05μg/mL的抑制剂后，与添加和不添加DMSO的对照组相比，抑制效果无统计学差异，说明溶剂DMSO对变异链球菌生物膜的形成并无影响，同时终浓度为0.05μg/mL的抑制剂对变异链球菌生物膜的形成抑制作用较小。因此选择终浓度为50μg/mL、5μg/mL作为本专利后续实施例的候选浓度。实验结果表明抑制剂能够有效抑制变异链球菌生物膜的形成，具有剂量-反应关系。同时抑制剂的溶剂DMSO对变异链球菌生物膜的形成并无影响。

实施例3：抑制剂对变异链球菌生物膜成熟的抑制实验

按照实施例1的无菌操作程序，首先将实施例1的变异链球菌菌悬液(菌种编号为：32401)接种于BHI蔗糖液体培养基中形成生物膜，然后分别加入不同浓度的抑制剂来确定抑制剂对变异链球菌生物膜成熟的抑制活性。具体方法是：按照1：100的稀释比例将实施例1中的变异链球菌菌悬液接种到含有BHI蔗糖液体培养基的48孔板中，于37℃、兼性厌氧(5％CO₂)培养24小时，形成生物膜。此时，分别向变异链球菌的生物膜培养物中添加最终浓度为5μg/mL和50μg/mL的抑制剂，于37℃、兼性厌氧(5％CO₂)继续培养48小时。然后，小心吸出48孔板中的浮游细菌及上清液，用pH＝7.4，0.01M的磷酸盐缓冲液(该缓冲液购自美国Thermo公司，货号：P5368。一袋内容物溶于1000mL去离子水，摇匀)清洗并洗脱底部的生物膜细胞，经10⁶稀释后，涂布于BHI固体培养基。经37℃、兼性厌氧(5％CO₂)培养48小时后，读取BHI固体培养基上的菌落形成单位(CFU)数目，每组细菌浓度以lg^CFU/mL表示。对照1为不添加抑制剂，对照2为添加终浓度为1％v/v的二甲基亚砜(即DMSO，该DMSO购自美国Thermo公司，货号：BP231-4)。实验过程中的数据是与两个对照进行比较来评价抑制剂对变异链球菌生物膜成熟的抑制效果，实验结果如图2所示。从图2可以明显看出添加及不添加DMSO的对照组经测定无统计学差异，说明溶剂DMSO对变异链球菌24小时生物膜进一步成熟并无影响。添加50μg/mL抑制剂的处理组，对变异链球菌24小时生物膜进一步成熟的抑制效果明显优于添加5μg/mL抑制剂的处理组。实验结果表明抑制剂能够有效抑制变异链球菌生物膜的成熟，具有剂量-反应关系。同时抑制剂的溶剂DMSO对变异链球菌生物膜的成熟并无影响。

实施例4：抑制剂对浮游状态下变异链球菌生长的影响

按照实施例1的无菌操作程序，将实施例1的变异链球菌菌悬液(菌种编号为：32401)分别接种于含不同浓度抑制剂的BHI液体培养基中来确定抑制剂对浮游生长状态变异链球菌的影响。具体方法是：按照1：100比例将实施例1中的变异链球菌菌悬液分别接种到添加有浓度梯度为5μg/mL和50μg/mL抑制剂的BHI液体培养基中，于37℃、兼性厌氧(5％CO2)培养16小时，期间每小时读取一次595nm波长下的OD值，并与对照组(含对照1、对照2和对照3)进行比较来判断变异链球菌的浮游生长是否受到影响。对照1为不添加抑制剂，对照2为添加终浓度为1％v/v的二甲基亚砜(即DMSO，该DMSO购自美国Thermo公司，货号：BP231-4)，对照3为添加250μg/mL氨苄西林(该氨苄西林购自美国Sigma公司，货号：A9393)。实验过程中的数据是与三个对照进行比较来评价抑制剂对浮游状态变异链球菌生长的影响，实验结果如图3所示。

从图3可以看出，添加抑制剂的处理组(浓度分别为50μg/mL，5μg/mL)与添加及不添加DMSO的对照组，各组间OD值均无统计学差异，说明溶剂DMSO对浮游状态下的变异链球菌生长抑制均不明显，同时不同浓度的抑制剂对浮游状态下的变异链球菌生长抑制均不明显；而添加250μg/mL氨苄西林的阳性对照组数值小于其余4组，差异有统计学意义，说明250μg/mL氨苄西林能够明显抑制浮游变异链球菌的生长。实验结果表明250μg/mL氨苄西林作为阳性对照能够明显抑制浮游变异链球菌的生长，而不同浓度的抑制剂对浮游状态下的变异链球菌生长抑制均不明显。同时抑制剂的溶剂1％v/vDMSO对浮游状态下的变异链球菌生长无影响。本实施例的实验结果与实施例2和实施例3的实验结果共同说明本抑制剂能够特异性的靶向生物膜状态生长的变异链球菌，有效抑制变异链球菌生物膜的形成和成熟。

实施例5：抑制剂对变异链球菌Gtfs蛋白质活性的影响

按照实施例1的无菌操作程序，变异链球菌菌种(菌种编号为：32401)接种于BHI琼脂平板培养基上，37℃、兼性厌氧(5％CO₂)孵育24小时。用接种环挑取一个单菌落接种于BHI液体培养基进行增菌培养18小时，之后1:100稀释接种于新鲜的养BHI液体培基。分别取8mL新鲜菌液两管，其中一管加入80μL50μg/mL抑制剂，另一管加入80μL二甲基亚砜(即DMSO，该DMSO购自美国Thermo公司，货号：BP231-4)作为阴性对照。

变异链球菌产生Gtfs并将其释放到胞外，所以可以通过浓缩细菌培养液来快速，简便的收集Gtfs。以37℃、兼性厌氧(5％CO₂)孵育约1小时，至OD₅₉₅≈0.8。低温离心(4℃，4000转/分钟)菌液两次，每次5分钟，分别收集两管上清液置于50kDa超滤管(该超滤管购自德国Merck Millipore公司，货号：UFC805096)，反复离心(4℃，4000转/分钟)浓缩直至体积约为40μL，此浓缩液即为粗提的Gtfs蛋白浓缩液。分别取20μL Gtfs蛋白浓缩液，加入20μL的上样缓冲液(即2SDS PAGE Sample Loading Buffer，上海生工生物工程有限公司，货号：SD8321)。加样于10孔8％的SDS-PAGE凝胶，每孔加样20μL，电压150V，70分钟，4℃电泳。电泳凝胶于2.5％的Triton X-100(Triton X-100，美国Amresco公司，货号为：9002-93-1)中震荡洗脱复性三次，每次10分钟。然后置于Gtfs酶谱孵育缓冲液中37℃过夜孵育。观察在暗背景下蛋白胶上的白色条带。

酶谱孵育缓冲液的配置方法为：取磷酸氢二钠8.9克(上海生工生物工程有限公司，货号：S0404)，磷酸二氢钠16.4克(上海生工生物工程有限公司，货号：S0571)，50克蔗糖(Thermo Fisher Scientific，USA，货号：S3-500)，2克葡聚糖T70(上海生工生物工程有限公司，货号：DB0375)加无菌水至1升。

经酶谱法分析的蛋白胶结果显示(图4)，变异链球菌菌株经50μg/mL抑制剂处理后，Gtf C(分子量较小)条带亮度有明显降低，提示处理后Gtf C酶活性减退或者被失活，而Gtf B，D条带亮度增加(分子量相近，位置重合)。说明抑制剂对变异链球菌的Gtf B，C，D有作用，猜测其对变异链球菌生物膜的抑制作用的机理可能与Gtf B，C，D有关。

以上所述仅为本发明的优选实施例实例，并不意味限制本发明的构思；对于本领域的技术人员来说，本发明存在多种更改和变化。凡在本发明的构思和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种恶唑酮类化合物作为变异链球菌生物膜抑制剂在制备预防和治疗龋病药物中的应用，该化合物为2-(4-氯苯基)-4-{[(6-甲基-2-吡啶基)胺基]亚甲基}-1,3-恶唑-5(4氢)-酮，分子式为C₁₆H₁₂ClN₃O₂；分子量为313.74，

其结构式如下所示：

该抑制剂由上述恶唑酮类化合物溶于二甲基亚砜(DMSO)组成。

2.一种根据权利要求1所述的抑制剂的制备方法：

(2)将上述配好的抑制剂母液用二甲基亚砜(DMSO)进行梯度稀释，并加入至牛心脑浸液(BHI)液体培养基中，使其抑制剂的最终浓度分别为：0.05μg/mL，0.5μg/mL，5μg/mL和50μg/mL，而溶剂二甲基亚砜(DMSO)的最终浓度均为1％v/v。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂对于变异链球菌生物膜的形成有抑制作用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂对于变异链球菌生物膜的成熟有抑制作用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂能够特异性地抑制变异链球菌生物膜，而对浮游状态的变异链球菌生长无明显抑制作用。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制剂能够作为清除牙菌斑生物膜的靶向药物。