CN104622853B - 一种海藻倍半萜类化合物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学和生物医药领域，具体地说是一种海藻倍半萜类化合物的应用，尤其是在制备抑菌剂方面的应用。该化合物结构式如(I)所示，从海洋红藻冈村凹顶藻(Laurencia okamurai)提取。实验结果显示本发明的化合物具有较强的抗菌活性，尤其是对于无乳链球菌和鳗弧菌有特异性的抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉及抑菌剂领域，具体地说是一种海藻倍半萜类化合物的应用。
背景技术
冈村凹顶藻(Laurencia okamurai)在分类地位上属于红藻门、红藻纲、仙菜目、松节藻科、凹顶藻属海藻，主要分布于中国、日本和朝鲜半岛等太平洋西部沿海地区，一般生长在潮间带的岩石上。倍半萜类化合物是冈村凹顶藻次级代谢产物中最为丰富的一类化合物，并且生物活性多样。
无乳链球菌(S.agalactiae)是乳腺炎的病原体，常存在于乳牛的皮肤、乳头及乳房内，通过挤乳人员的手或挤乳机械以及蝇类的机械携带而传播。这种链球菌引起乳房炎后不产生明显免疫力，目前尚无可靠的多价菌苗。鳗弧菌为有鞭毛的革兰氏阴性细菌，具有典型的弧菌属细菌特征。鳗弧菌引起的水产养殖动物疾病在世界范围内流行，可感染鲑鱼、虹鳟、鳗鲡、香鱼、鲈鱼、鳕鱼、大菱鲆、牙鲆、黄鱼等。鳗弧菌是条件致病菌，当水产养殖动物在不良的环境条件下，遭遇不利刺激或是受伤时，会诱发疾病的产生。这两种菌都是实验室和科研检测的常用菌种，研究他们的药物敏感性将具有非常重大的意义。目前主要采用抗生素治疗这两种病菌，但是抗生素容易使病菌产生耐药性，并且长期使用抗生素会对生态环境造成破坏。而海藻倍半萜类化合物作为抑菌剂具有低毒和纯天然等优点，其研究显示出了良好的生态效益、经济效益和社会效益，一旦应用将对畜牧业和水产养殖业产生巨大的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种天然的海藻倍半萜类化合物的应用，尤其是在制备抑菌剂方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种海藻倍半萜类化合物，其结构式如(I)所示，分子式为C15H20O，用于制备抗菌剂，尤其是用于抑制无乳链球菌和鳗弧菌的抗菌剂。
上述海藻倍半萜类化合物的制备方法包括如下步骤：
1)将海洋红藻冈村凹顶藻(Laurencia okamurai)阴干、粉碎，然后用有机溶剂A提取2～5次，合并提取液进行浓缩，再经乙酸乙酯萃取后浓缩，得到粗提物；优选的，有机溶剂A为二氯甲烷、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、乙醇或甲醇中一种或几种；
2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂B进行梯度洗脱，收集洗脱液；优选的，有机溶剂B为石油醚-乙酸乙酯混合物，，按100:0～0:100或50:1～1:1的梯度用石油醚-乙酸乙酯洗脱，收集15:1～25:1的洗脱部分；更优选的，收集20：1的洗脱部分。
3)将收集的洗脱组分进行凝胶柱和薄层层析分离纯化，即得如式(I)所示的海藻倍半萜类化合物；优选的，凝胶柱层析洗脱液为体积比5:5:1的石油醚-氯仿-甲醇混合溶剂，TLC检测，用香兰素-硫酸显色，收集红色斑点组分；薄层层析展开剂为体积比为15～10:1的石油醚-乙酸乙酯，收集Rf值为0.6～0.7的组分。
本发明具有以下优点：
本发明涉及的化合物属于小分子天然有机化合物，容易制备获得；具有显著的抑菌活性，可作为一种新型抑菌剂。
本发明通过将海洋红藻冈村凹顶藻(Laurencia okamurai)干燥并粉碎，然后用有机溶液提取和萃取，浓缩后得到粗提物；将粗提物进行纯化后，即得到所述海藻倍半萜类化合物。经抑菌活性实验，发现化合物对于无乳链球菌和鳗弧菌病菌具有抑制活性，可作为一种新型抑菌剂。
这种化合物对上述两种致病菌有特异性，与广谱抗生素相比，对于其他微生物影响小，不影响微生态。
虽然本发明中的化合物抗菌效果比抗生素效果稍弱，但是其作为纯天然小分子抑菌药物，具有低毒、环境友好、纯天然和不会产生耐药性的特点，这些是抗生素类抑菌药物所不具备的。在目前国内抗生素药物在畜牧业及水产业要求谨慎使用的形势下，该海藻倍半萜类化合物作为新型的抑菌药物具有广泛的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
实施例1 海藻倍半萜类化合物的制备方法(1)
(1)采集新鲜的冈村凹顶藻(Laurencia okamurai)经海水洗净，除去表面附着的沙砾及杂藻，阴凉处阴干，然后粉碎。用甲醇-二氯甲烷(体积比3:1)浸泡提取，合并提取液进行浓缩，得到粗提物；将粗提物经乙酸乙酯萃取三次并在温度40℃减压浓缩，得萃取后粗提物16.0g。
(2)将粗提物进行200-300目的硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以100:0，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1到0:100的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(TLC)检测(香兰素-硫酸显色)，根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得14个组分(1-14)。将组分3即以石油醚-乙酸乙酯20∶1梯度洗脱下的组分再进行凝胶柱和薄层层析分离。凝胶柱层析时洗脱液用体积比5:5:1的石油醚-氯仿-甲醇，TLC检测(香兰素-硫酸显色)，收集红色斑点的组分；薄层层析用体积比9:1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，收集Rf值为0.6-0.7的组分，得式(I)所示化合物(58.9毫克)，经TLC检测(香兰素-硫酸显色)，呈单个、均匀红色斑点，确定为纯化合物。经波谱分析，其结构鉴定为debromolaurinterol，结构式如(I)所示。
该化合物具有以下理化和波谱特性：
无色油状，分子式为C15H20O；核磁共振氢谱1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.40(d,J＝7.9Hz,H-5),6.70(br d,7.9Hz,H-4),6.67(br s,H-2),5.10(s,OH),2.27(s,H3-13),2.10(m,H-8b),1.95(d,J＝11.9Hz,H-9b),1.65(m,H-9a),1.43(s,H-14),1.33(s,H-12a),1.31(m,H-8a),1.15(m,H-10),0.58(m,J＝4.2Hz,H-15b),0.55(m,H-15a)。核磁共振碳谱13C NMR(151MHz,CDCl3)δ154.05(C-1),136.80(C-3),131.47(C-6),128.91(C-5),120.92(C-4),117.36(C-2),48.02(C-7),36.11(C-8),29.78(C-11),25.42(C-9),24.37(C-10),23.69(C-13),20.72(C-14),18.90(C-12),16.37(C-15).
实施例2 海藻倍半萜类化合物的制备方法(2)
(1)采集新鲜的冈村凹顶藻(Laurencia okamurai)经海水洗净，除去表面附着的沙砾及杂藻，阴凉处阴干，然后粉碎。
用95％乙醇浸泡提取，合并提取液进行浓缩，得到粗提物；将粗提物经乙酸乙酯萃取三次并在温度40℃减压浓缩，得萃取后粗提物11.8g。
(2)将粗提物进行200～300目的硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(TLC)检测(香兰素-硫酸显色)，根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得10个组分(1～10)。将组分2即以石油醚-乙酸乙酯20:1梯度洗脱下的组分再进行凝胶柱和薄层层析分离。
(3)凝胶柱层析时洗脱液用体积比5:5:1的石油醚-氯仿-甲醇，TLC检测(香兰素-硫酸显色)，收集红色斑点的组分；薄层层析用体积比9:1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，收集Rf值为0.6～0.7的组分，得式(I)所示化合物。
核磁共振氢谱和核磁共振碳谱同实施例1。
实施例3 抑菌活性实验
实验所用的菌培养基为NB营养肉汤培养基，用无菌棉签浸取菌悬液，均匀涂于M-H培养基上。所使用的七种菌分别为无乳链球菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、塔氏弧菌、海豚链球菌、鮰爱德华菌和HN016。
将实施例1所制备的化合物测试样品溶解于甲醇中，浓度为分别5.0、2.5、1.5、1和0.5毫克/毫升。取10微升样品溶液加到直径为5毫米的无菌滤纸片上(每片的含量50、25、15、10和5微克)，测试不同梯度下的抑菌效果；并用加有相同体积甲醇并晾干的滤纸片做阴性对照，用红霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素、复方新诺明和庆大霉素作为抗菌阳性对照，各三个平行。加有样品的平板培养基置于28℃静置培养10小时，观察实验结果，出现抑菌圈的测量其抑菌圈直径。
实验结果显示，只有无乳链球菌和鳗弧菌出现了抑菌圈，说明上述海藻倍半萜类化合物对无乳链球菌和鳗弧菌具有抑制活性，有特异性。海藻倍半萜类化合物抑菌效果如下表：
红霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素、复方新诺明和庆大霉素对上述六种菌都有抑制效果，药敏片上含量为50微克时的抑菌效果如下表：
用实施例2所制备的海藻倍半萜类化合物作为测试样品，结果相同。
虽然本发明中的化合物抗菌效果比抗生素效果稍弱，但是其作为纯天然小分子抑菌药物，具有低毒、环境友好、纯天然和不会产生耐药性的特点，这些是抗生素类抑菌药物所不具备的。在目前国内抗生素药物在畜牧业及水产业要求谨慎使用的形势下，该海藻倍半萜类化合物作为新型的抑菌药物具有广泛的应用前景。
Claims (5)
1.一种海藻倍半萜类化合物在制备抗菌剂方面的应用，其特征在于，所述海藻倍半萜类化合物的结构式如(I)所示：
所述抗菌剂为抑制无乳链球菌或鳗弧菌的抗菌剂。
2.权利要求1所述的应用，其特征在于，海藻倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1)将海洋红藻冈村凹顶藻阴干、粉碎，然后用有机溶剂A提取2～5次，合并提取液进行浓缩，再经乙酸乙酯萃取后浓缩，得到粗提物；
2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂B进行梯度洗脱，收集洗脱液；
3)将收集的洗脱组分进行凝胶柱和薄层层析分离纯化，即得如式(I)所示的海藻倍半萜类化合物；
所述的步骤1)有机溶剂A为二氯甲烷、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、乙醇或甲醇中一种或几种；步骤2)中的有机溶剂B为石油醚和乙酸乙酯的混合物。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤2)中，按100:0～0:100或50:1～1:1的梯度用石油醚-乙酸乙酯洗脱，收集15:1～25:1的洗脱部分。
4.权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中，收集20：1的洗脱部分。
5.权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤3)所述凝胶柱层析洗脱液为体积比5:5:1的石油醚-氯仿-甲醇混合溶剂，TLC检测，用香兰素-硫酸显色，收集红色斑点组分；
薄层层析展开剂为体积比为8～10:1的石油醚-乙酸乙酯，收集Rf值为0.6～0.7的组分。
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