CN104620093A - 用于快速可逆生物分子标记的组合物和方法 - Google Patents

用于快速可逆生物分子标记的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于实现在生理条件下快速可逆的低抗体亲抗原性、高亲和力和高特异性的生物分子相互作用的组合物和方法。所述方法包括使生物靶标(诸如分子、蛋白质、DNA、细胞等)与聚合物和抗聚合物配体连接以及使用生理上相容的聚合化合物来逆转它们结合的方法。所述方法还包括对用于正交标记的不同聚合物/抗聚合物系统进行组合的方法。所述组合物包含包括与聚合物缀合的颗粒(荧光、磁性、致密等)的标记或与抗聚合物抗体缀合的标记。所述组合物还包含与所述聚合物缀合的生物分子(蛋白质、抗体、DNA等)。这些方法和组合物展示出对现有技术的重大改进。它们特别可用于使用颗粒来分离和隔离生物靶标，对包括荧光成像在内的其它领域具有重要应用。

Description

用于快速可逆生物分子标记的组合物和方法
发明领域
本发明涉及用于将样品中的生物靶标与其标记快速分离的方法和组合物。
发明背景
生命科学和医学领域中的许多不同应用需要对生物靶标(诸如分子、DNA、蛋白质或细胞)进行特异性标记。标记提供使用标记的新的功能或物理特性(荧光、磁性、密度、酶活性、放射性等)对来自复杂生物样品内的靶标进行检测或操纵的灵敏方法。例如，荧光标记能够使生物靶标(在某些情况下以分子灵敏的程度)可视化。荧光技术正在革新从研究工作台到临床的许多生物学领域。同样地，磁性标记能够实现使用磁共振成像(MRI)或医学颗粒成像(MPI)技术(均为当前重要的临床诊断手段)对生物靶标进行成像。磁性标记的另一个重要应用是用于使用磁场从复杂样品中分离和纯化生物靶标(主要是DNA、蛋白质或细胞)。
磁性标记和分离已被广泛应用，并革新了细胞分离领域。细胞分离涉及在细胞物理或功能特性基础上从复杂生物样品(血液、组织、骨等)中分离特定细胞类型。荧光激活细胞分选(FACS)是一种在用荧光抗体标记后细胞受体表达的基础上分离所述细胞的流式细胞术形式。然而，FACS的缺点是分离费时且产量低。对于磁性分离，通常利用蛋白质或抗体的亲和结合特性(通常称为免疫标记的方法)使磁性微粒或纳米颗粒靶向细胞受体。缀合到抗体或蛋白质的磁性微粒或纳米颗粒用于选择性地靶向复杂的生物样品内的细胞。阳性选择是所需细胞类型被颗粒直接标记并通过磁性洗涤分离的常用方法。相反，对于阴性选择(或贫化/富集)，不需要的细胞类型被颗粒标记并通过施加磁场而去除，以未标记的形式分离所需细胞。阳性选择的优点是分离的细胞通常比阴性选择的纯度更高，但缺点是它们具有结合到其表面上的颗粒。阴性选择使得所需细胞保持未被标记，但缺点是纯度通常比阳性选择更低，并且需要混合多个抗体以标记不想要的细胞。阳性和阴性免疫磁性细胞分离策略是目前众多商用产品支持的完善技术。这些产品通常采用缀合到一级或二次抗体、缀合到链霉亲和素以与生物素化的抗体一起使用或缀合到葡聚糖以与四聚体抗体复合物(TAC)一起使用的磁性颗粒。
细胞分离领域目前要求更快还更复杂的策略以从相同样品中分离多种细胞类型、以分离不容易由其受体表达定义的细胞亚群，并且要求改进的策略用于分离非常罕见的细胞类型，在所有这些的同时保持细胞天然或接近天然状态。对于免疫磁性技术，分离多种细胞类型或不由单一受体表达定义的细胞类型的方法是采用阳性或阴性选择和正交标记技术的组合。大多数连续分离应用，特别是涉及多个阳性选择或阳性选择随后阴性选择的那些应用，要求在第一轮分离后从细胞表面有效去除磁性标记，而不损害细胞的活力或回收率(产率)。即使对于简单的阳性选择，非常需要以去除颗粒的方式来减轻颗粒对细胞的功能或活力的干扰。已知的是微粒或纳米颗粒可以通过不同的方法内化到细胞中，这取决于颗粒表面的物理和化学特性以及具体的细胞类型(Verma and Stellacci 2010)。除了细胞功能，细胞表面上的颗粒可干扰许多下游测定。例如，在流式细胞术分析过程中，当颗粒存在时细胞的粒度测量(侧向散射)向较大的值偏移，这使识别特定细胞群变得复杂。在细胞表面上具有颗粒的另一缺点是，氧化铁可以淬灭荧光信号，从而降低了在分离的细胞上进行免疫荧光测定的灵敏度。从临床前和临床观点来看，如果要将分离的细胞用于包括细胞治疗应用的人类研究中，那么重要的是细胞呈其天然或接近天然形式、不含杂质和颗粒、具有高功能性和活性。
温和地从细胞表面去除颗粒仍然是一个挑战，因为免疫细胞分离领域的技术人员知道，高亲和力抗体/抗原或蛋白质相互作用(KD～1-100nM)需要将颗粒和细胞连接一起。此类高亲和力相互作用能够在若干轮磁性洗涤下以高纯度和产率分离细胞，但通常仅在对细胞有破坏性的溶液条件下逆转。在过去的20年中，已经提出许多不同方法以从细胞中去除颗粒，但许多方法损伤细胞、降低活力、改变功能特性或者它们过于复杂和费时。
这些策略中的一些包括将细胞在培养基中过夜温育、改变pH、温度、盐、加入还原剂来裂解抗体，或使用机械剪切力来破坏来自细胞表面的颗粒。
美国专利号5,081,030描述了使用消化酶如木瓜蛋白酶从细胞去除颗粒的方法。同样，欧洲专利号EP0819250B1描述了使用糖苷酶来释放颗粒的方法。一旦抗体缀合的颗粒已经靶向细胞并且细胞被磁性纯化，则将酶加至细胞悬液中以消化参与颗粒细胞连接的蛋白质、抗体或多糖。此方法的缺点是，酶的成本高昂，它们在储存过程中容易分解，所述方法是费时的，而且某些酶通过消化细胞表面蛋白而改变细胞功能。
Werther等(Werther,Normark等2000)描述了链霉亲和素-生物素系统与裂解DNA接头的联合使用。为去除来自选定细胞的颗粒，将悬浮液用DNase酶温育。此构思是来自Dynal的磁性细胞分离的CELLection产品线的基础。所述方法的优点在于，所述酶对DNA接头具有特异性，但它具有先前提到的基于酶的系统的缺点。
美国专利号5,429,927描述了使用二次抗体来破坏抗体缀合的颗粒与其细胞表面的受体的相互作用以从细胞去除颗粒的方法。在一种形式中，所述二次抗体是直接与一次抗体结合从而诱导构象改变并释放所述颗粒的多克隆抗Fab。此方法是来自Dynal的DETACHaBEAD颗粒去除系统的基础，并且也已被Rasmussen等(Rasmussen,Smeland等1992)和Geretti等(Geretti,Van Els等1993)描述。此方法的缺点是，它对于最终使用者是费时的(～45-60分钟方法)，对于高效颗粒释放要求高浓度的二次抗体，并且根据一次抗体的克隆和种类需要独特的二次抗体。
美国专利号5,773,224描述了肝素/抗凝血酶III用于以列形式的阳性选择和细胞洗脱。所述方法使用与肝素缀合的固相柱，装载生物素化的抗凝血酶III，并随后通过抗生物素蛋白交联。使用所需细胞类型的一次抗体和生物素化的二次抗体来选择细胞。通过增加固相细胞相互作用的抗体亲抗原性(avidity)的抗生物素蛋白交联来提高抗凝血酶III对于肝素的中等亲和力。当在分离结束加入游离的可溶性肝素时，它竞争抗凝血酶III结合位点并从柱释放细胞。逆转是有效的，因为单个肝素/抗凝血酶III相互作用弱到足以被直接竞争破坏。所述方法的缺点是，需要交联剂来提高标记的性能，因为它使细胞分离过程变得复杂。另一个缺点是，此方法限于肝素/抗凝血酶III，因为肝素是血液中常见的抗凝血剂，所述方法不包括处理这些类型的样品。
美国专利号5,985,658描述了使用钙调蛋白和钙调蛋白结合肽之间的可逆相互作用从细胞中去除颗粒的方法。将细胞用所需细胞类型的一次抗体、随后用肽缀合的二次抗体和钙调蛋白缀合的颗粒标记。蛋白和肽通过钙离子桥结合。颗粒去除通过加入去除离子并逆转结合的EGTA螯合剂而触发。
美国专利号6,017,719描述了使用工程化的肽来置换来自细胞表面的抗体缀合的磁性颗粒的方法。肽结合至靶向抗体，并且通过竞争结合位点或引起抗体构象变化而从细胞表面置换它们。所述方法的主要缺点是必须合理设计并选择用于将颗粒靶向细胞的每个抗体的独特的肽。
生物素和链霉亲和素或抗生物素蛋白具有极高的亲和力(～fM)，并且通过生物素化的抗体和链霉亲和素或抗生物素蛋白缀合的颗粒方式已被广泛用于细胞分离。鉴于其高亲和力，所述相互作用通常仅在蛋白变性和细胞破坏的条件下是可逆的。美国专利申请2008/0255004描述了重组修饰的链霉亲和素和修饰的生物素(脱硫生物素)的用途，其与天然链霉亲和素/生物素相比共同具有显著降低的亲和力。通过加入置换较低亲和力脱硫生物素的天然生物素来逆转这种相互作用。为使细胞分离，使脱硫生物素与一次抗体缀合并且使磁性颗粒与突变形式的链霉亲和素缀合。此方法现在是来自Dynal的磁性细胞分离的FlowComp产品线的基础。此方法的一个限制是，与脱硫生物素缀合的抗体不能广泛用于许多细胞类型，并且需要由最终使用者来制备。
美国专利号7,776,562和WIPO专利申请WO2013/011011还描述了重组工程系统用于可逆磁性细胞分离(和/或荧光标记)的用途。此方法是基于抗原特异性MHC分子或表达融合肽诸如streptag的Fab片段的弱亲和力。Streptag结合streptactin，一种保留其对生物素特异性的链霉亲和素的突变形式。当streptactin缀合的磁性颗粒装载MHC分子或Fab片段时，在颗粒-细胞相互作用中有足够的抗体亲抗原性以能够特异性靶向和分离所需细胞类型。在分离结束时加入游离的可溶性生物素从streptag置换streptactin并释放颗粒。在细胞表面上弱结合的MHC分子或Fab片段也被去除，因为随着颗粒释放抗体亲抗原性丧失。此方法具有对于每个不同细胞类型都需要融合至streptag的重组抗体的主要缺点，并且如美国专利号5,773,224，需要另外的交联剂以增加结合伴侣的亲合性(抗体亲抗原性)。此构思现在是由IBA GmbH提供的Streptamer磁性细胞分离试剂的基础。
在免疫磁性细胞分离中用于可逆标记的这些方法的发展已经朝着对细胞更温和但增加了标记试剂(重组工程化的蛋白质/抗体、交联剂)和细胞分离方法(许多标记步骤、长持续时间)的复杂性的方法进行。因此，仍然存在对于改进的可逆标记技术的重要需求，其更快、使用更简单的试剂并且在不同细胞类型和种类之间广泛起作用。在细胞分离领域，改进的方法和组合物在临床前、临床和细胞治疗市场是需要的，并且用于要求呈接近天然形式的高功能和活力细胞(包括通过连续分离而分离的特定细胞亚群)的基础研究应用。在细胞分离领域以外，快速可逆标记对于许多应用(包括基于分子、DNA和蛋白质的纯化、生物样品的荧光成像)是需要的。
考虑到随着医学和生命科学应用，对于改进的可逆标记系统的理想要求包括：1)标记与其生物靶标(细胞受体的颗粒)的高亲和性结合，2)使用温和释放试剂(对细胞温和)快速和高效去除标记(颗粒)，3)对不同靶标(包括细胞类型和种类)和应用(包括荧光)的广泛适用性，4)与正交标记(用于连续或同时分离)兼容，5)可获得的、廉价的和稳定的试剂以及6)容易进行自动化(简单和快速过程)。
发明概述
本发明提供了用于实现在生理条件下快速可逆的低抗体亲抗原性、高亲和力和高特异性的生物分子相互作用的组合物和方法。所述方法包括使生物靶标(诸如分子、蛋白质、DNA、细胞等)与聚合物和抗聚合物配体连接以及使用生理上相容的聚合化合物来逆转它们结合的方法。所述方法还包括对用于正交标记的不同聚合物/抗聚合物系统进行组合的方法。所述组合物包含包括与聚合物缀合的颗粒(荧光、磁性、致密等)的标记或与抗聚合物抗体缀合的标记。所述组合物还包含与所述聚合物缀合的生物分子(蛋白质、抗体、DNA等)。这些方法和组合物展示出对现有技术的重大改进。它们特别可用于使用颗粒来分离和隔离生物靶标，对包括荧光成像在内的其它领域具有重要应用。
因此，本发明提供一种将样品中的生物靶标与标记分离的方法，其包括：
1)通过连接系统使所述生物靶标与所述标记结合，所述连接系统包含第一聚合物和与所述第一聚合物结合的配体；和
2)向所述样品中加入第二聚合物以将所述生物靶标与所述标记分离。
在一个实施方案中，本发明提供一种将样品中的生物靶标与标记分离的方法，其包括：
1)使用连接系统使所述生物靶标与所述标记结合，所述连接系统包含与连接至与第一聚合物结合的配体的生物靶标结合的配体和与所述第一聚合物缀合的标记；和
2)向所述样品中加入第二聚合物以将所述生物靶标与所述标记分离。
在另一个实施方案中，本发明提供一种将样品中的生物靶标与标记分离的方法，其包括：
1)使用连接系统使生物靶标与标记结合，所述连接系统包含与连接至第一聚合物的生物靶标结合的配体和与结合到所述第一聚合物的配体缀合的标记；和
2)向所述样品中加入第二聚合物以将所述生物靶标与所述标记分离。
本发明还提供一种将生物靶标和标记分离的组合物，其包含：
1)使所述生物靶标与所述标记结合的连接系统，其中所述连接系统包含第一聚合物和与所述第一聚合物结合的配体；和
2)可将所述生物靶标与所述标记分离的第二聚合物。
在一个实施方案中，本发明还提供一种用于将生物靶标和与第一聚合物缀合的标记分离的组合物，其包含：
1)用于使所述生物靶标与所述标记结合的连接系统，所述连接系统包含与所述生物靶标结合的配体，所述生物靶标连接至与缀合至所述标记的聚合物结合的配体；和
2)用于分离所述生物靶标与所述标记的第二聚合物。
在另一个实施方案中，本发明还提供一种用于将生物靶标和与结合到第一聚合物的配体连接的标记分离的组合物，其包含：
1)用于使所述生物靶标与所述标记结合的连接系统，所述连接系统包含与所述生物靶标结合的配体，所述生物靶标连接至与缀合至所述标记的配体结合的第一聚合物；和
2)用于分离所述生物靶标与所述标记的第二聚合物。
本发明的其它特征和优点通过下列详述将变得明显。然而应该理解，虽然详述和具体实施例示出本发明的优选实施方案，但它们仅通过说明的方式给出，因为通过此详述，本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得明显。
附图简述
图1是应用于可逆标记细胞靶标(或其它生物分子)的本发明的使用方法的示意图示。a)在此型式中，使诸如含有针对靶细胞受体的抗体和第一聚合物的双特异性四聚体抗体复合物(TAC)的连接配体与细胞和第一聚合物缀合的标记一起温育。b)在标记和纯化或检测后，通过加入游离的可溶性第二聚合物或衍生物来去除(释放)聚合物缀合的标记。可洗掉释放的标记，并且可通过正交技术使靶细胞经受进一步(连续)的标记或用于下游测定和应用中。不同类型的标记尤其包括荧光基团(flourophore)、磁性颗粒、酶或同位素。
图2是应用于可逆标记细胞靶标(或其它生物分子)的本发明的使用方法的示意图示。a)在此型式中，使针对靶细胞受体的第一聚合物缀合的抗体与细胞和缀合至抗聚合物抗体配体的标记一起温育。b)通过加入游离的可溶性第二聚合物或衍生物从靶细胞中去除标记。
图3显示使用聚(乙二醇)(PEG)和颗粒标记作为实例来制备第一聚合物缀合的标记、配体缀合的标记和第一聚合物缀合的配体的几种化学物质。a)具有表面巯基(SH)基团的标记可以在一个步骤中缀合至含有巯基反应性马来酰亚胺基团的PEG。具有表面胺(NH2)基团的标记可以在一个步骤中缀合至含有胺反应性NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)基团的PEG。可以使用与羧基反应而形成胺反应性中间体的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)使具有表面羧基(COOH)基团的标记一步缀合至含有NH2的PEG。b)标准缀合技术也可以应用于制备缀合至抗聚合物配体(诸如抗PEG抗体)的标记。这尤其包括抗体与标记表面的非共价吸收，或其使用EDC的共价连接(示出)。c)相似的缀合策略可应用于使配体(诸如DNA、肽、蛋白质或抗体)与聚合物官能化。示出的是含有NHS的PEG与蛋白质或抗体的含有胺的赖氨酸残基的缀合。除了PEG聚合物，这些缀合策略可以扩展至本发明的其它聚合物。
图4示出在PEG作为第一聚合物、抗PEG抗体作为配体并且Pluronic F68作为第二聚合物的BIAcore 3000表面等离子共振仪上进行的可逆标记测定的结果。a)使用EDC缀合化学将羧化的CM5传感器芯片用胺化的10kDA PEG官能化。使用所示浓度以恒定流速将抗PEG抗体(克隆CH2074)注射到表面上保持120秒(缔合)。接着，将hepes缓冲盐水(HBS)缓冲液注射到表面上保持180秒(解离)。观察到抗PEG对PEG化表面的特异性和浓度依赖性结合，而未观察到抗CD8抗体对照的结合。b)示出在注射PEG衍生物Pluronic F68的1％(w/v)溶液后快速释放抗PEG抗体。使用甘氨酸-HCL缓冲液使表面再生。此数据的显著特征是在加入Pluronic F68后快速(<1秒)并高效(>95％)去除表面结合的抗PEG。使用双分子结合模型并考虑质量传递限制因素估计来自缔合和解离步骤的抗PEG抗体的亲和力(KD)在1.8-7.8nM的范围内。
图5示出在使用缀合至PEG的颗粒状聚苯乙烯标记作为第一聚合物、抗PEG抗体作为配体和Pluronic F68作为第二聚合物的流式细胞仪上进行的可逆标记测定法的结果。a)使20kDa PEG缀合至6.0um聚苯乙烯(PS)颗粒并且在初始标记和下游逆转(释放)中评估其与抗PEG抗体(克隆3F12-1)相互作用的特异性。b)当PEG化的PS颗粒与抗PEG一起温育时，检测到超过背景(灰色填充)的信号(实线)。加入1％(w/v)的Pluronic F68后，信号被减少到接近背景(虚线)，这表明PEG/抗PEG相互作用的有效可逆性。当Pluronic F68在PS颗粒之前加至抗PEG抗体中时，没有检测到相互作用(虚线)，这证实具有抑制作用。c)作为对照，PS颗粒与抗PEG(实线)一起温育，但第二聚合物是5kDA葡聚糖。没有信号减少(虚线)，这表明Pluronic F68对释放的特异性。当抗葡聚糖(克隆DX1)取代抗PEG(虚线)与PS颗粒一起温育时未检测到信号，这表明PEG/抗PEG相互作用的特异性。在所有样品中，使用大鼠抗小鼠PE作为报道分子来检测抗体。
图6示出在使用缀合至PEG的颗粒状磁性标记作为第一聚合物、荧光抗PEG抗体作为配体和各种PEG衍生物作为第二聚合物的流式细胞仪上进行的可逆标记测定法的结果。a)使30kDa PEG缀合的磁性微粒与荧光抗PEG抗体一起温育，同时用不同浓度和大小的PEG来探测相互作用。为了测试第二聚合物对配体的抑制效果，在与PEG化的颗粒混合(抑制)之前使抗PEG抗体与可溶性PEG一起预温育。为了测试第一聚合物/配体相互作用的可逆性，在加入可溶性PEG或Pluronic F68(释放)之前使抗体与PEG化的颗粒一起温育。这些数据表明，在超过1mM的浓度时，PEG 1kDa、PEG 5kDa和Pluronic F68均能有效地完全抑制或逆转相互作用(0％百分比信号)。观察到存在浓度依赖性效应并且对于抑制，IC50值对于PEG 1kDa、PEG 5kDa和Pluronic F68分别为0.0485mM、0.0077mM和0.0017mM。对于释放情况，IC50值对于PEG 1kDa、PEG 5kDa和Pluronic F68分别为0.0625mM、0.0136mM和0.0035mM。b)相同数据如a)，不同之处在于聚合物的浓度转化为质量百分率(w/v)。总的来说，这些结果表明，在摩尔基础上，可逆标记的效率随着第二聚合物分子量的增加而提高。
图7示出使用抗PEG/CD19TAC、20kDa PEG缀合的微粒和磁性洗涤，随后颗粒释放并加入可溶性Pluronic F68(一种PEG衍生物)来从PBMC中阳性选择人CD19细胞。CD19+细胞在起始样品中的百分率是10.0％。a)颗粒释放之前，所选的CD19细胞的流式细胞术表现出高纯度，但由于细胞表面上的颗粒而具有高的侧向散射(左)。显微分析证实了细胞表面上～1um颗粒的存在(右)。b)在使用1％(w/v)Pluronic F68进行颗粒释放并去除以及磁性洗涤后，侧向散射位移消失(左)并且显微分析表明颗粒完全去除。在颗粒释放后由于消除与颗粒非特异结合的细胞而使所选细胞的纯度略有增加。纯度的增加是颗粒释放对抗PEG/PEG相互作用的特异性的结果。显微镜图像为20um的正方形。
图8示出使用适当的TAC和PEG缀合的磁性颗粒从PBMC中阳性选择人类CD56和CD8细胞的流式细胞术数据。对于两种细胞标记物，用PEG衍生物Pluronic F68释放颗粒，突出此方法对于不同的细胞类型的普遍适用性。a)在CD56实验中，PBMC的起始样品是18.4％CD56+。使用抗PEG/CD56TAC和20kDa PEG缀合的微粒，所选的CD56细胞纯度为93.8％。一旦使用Pluronic F68去除颗粒，则纯度提高到96.8％，总的细胞回收率为18.6％。在释放步骤后回收最初由微粒选择的细胞的93％以上，这展示了所述方法的高效性。b)在CD8选择实验中，起始细胞的10.2％是CD8+。使用抗PEG/CD8TAC和10kDa PEG缀合的纳米颗粒，所选细胞的纯度为87.4％。颗粒释放后的纯度提高至91.1％，同时保持77.0％的高回收率。这些结果强调了在颗粒释放后如何提高所选细胞的纯度。产生这种情况的原因是，在温育步骤后一些吞噬细胞类型非特异性结合至颗粒(流式细胞图上的星号)。在分离释放仅通过特异性第一聚合物/配体相互作用结合的细胞后加入可溶性第二聚合物，一旦游离颗粒和非特异性捕获的细胞被磁性去除提供所需细胞的进一步富集。
图9是在颗粒系统中抗体亲抗原性效应的示意图。a)示出与靶细胞表面上的受体相互作用的官能化的颗粒标记的情况。所述颗粒具有包含高密度官能团的表面涂层并且第一聚合物已以高密度缀合至所述表面。当细胞受体已经被高密度的配体(TAC，例如)标记时，在标记和靶细胞之间存在大量的潜在结合位点(连接)。抗体亲抗原性的增强效果使这种相互作用难以通过与游离的第二聚合物竞争来逆转。b)示出低的抗体亲抗原性的情况，其中所述标记具有低密度的第一聚合物并且靶细胞具有低密度的配体-标记的受体。根据本发明的方法和组合物，这种相互作用是可逆的。
图10示出通过不同方法、配体(抗体)和标记(颗粒)纯化的细胞的显微比较。a)使用直接方法来标记并纯化细胞，其中在磁性洗涤后使抗CD19抗体缀合的磁性微粒(MP)与PBMC一起温育。该图像显示用高密度(>50)颗粒(暗点)标记的细胞。b)使用间接方法标记和纯化细胞，所述方法包括与生物素化的抗CD19抗体随后与链霉亲和素缀合的磁性MP一起温育并磁性洗涤。与a)中的方法相比，在细胞表面上存在较少的颗粒(<25)。c)使用本发明的间接方法标记和纯化细胞。使细胞与识别CD19和PEG的双特异性四聚体抗体复合物(TAC)一起温育，然后再与PEG缀合的磁性颗粒一起温育并且磁性洗涤。如在b)中，细胞表面存在较少颗粒(<25)。主要观察到，相比于直接标记，间接方法导致细胞表面上较低数量的标记。显微镜图像为20um的正方形。
图11证实标记浓度、细胞分离性能和标记释放效率之间的关系。人CD19+细胞是使用抗PEG/CD19TAC和不同浓度的30kDa PEG缀合的微粒从PBMC中阳性选择的。基于颗粒释放步骤之前与之后的回收细胞的比率来计算释放效率。a)在磁性洗涤之后，但在颗粒释放之前，在除了其中细胞回收率显著下降的最低浓度(0.05mg/mL)的整个浓度范围所选细胞的纯度(三角形)和回收率(圆形)是相似的。有趣的是，加入Pluronic F68后，在80倍的浓度差异(0.05-4mg/mL颗粒)下颗粒释放效率(菱形)是恒定的。b)通过起始样品和已标记细胞的流式细胞术在低浓度和高浓度的颗粒下获得散射分布。用颗粒标记的细胞比开始具有较高的侧向散射，但对于低和高浓度相似。假设侧向散射位移与细胞表面上的颗粒数量相关，并考虑到恒定的颗粒释放，这些结果表明，标记浓度不显著影响结合到靶细胞的标记数量或其所得的抗体亲抗原性。
图12证实释放效率如何取决于配体标记的细胞受体的密度和标记-细胞相互作用的相应抗体亲抗原性。a)人CD45+细胞是使用不同浓度的抗PEG/CD45TAC和30kDa PEG缀合的磁性微粒从PBMC中阳性选择的。在磁标记和分离后，但在颗粒释放前，所选细胞的纯度和回收率在0.015至1.5ug/mL的TAC浓度下是恒定的。尽管细胞回收率恒定，但在加入PEG衍生物的Pluronic F68后存在显著的颗粒释放效率趋势。TAC在1ug/mL以上，从颗粒释放～25％的细胞，而TAC浓度为～0.02ug/mL时释放>75％的细胞。b)在分离后，但在颗粒释放前，通过流式细胞术从来自a)的样品中获得散射分布。侧向散射随TAC浓度显著增加(箭头)。假设侧向散射位移与细胞表面上的颗粒数量相关并考虑到释放效率，这些结果表明，配体浓度如何影响结合的标记总数和标记-细胞相互作用的抗体亲抗原性。c)与a)相似的结果，表明使用抗PEG/CD8TAC和10kDa PEG缀合的磁性纳米颗粒阳性选择人CD8+细胞，颗粒释放效率依赖于TAC浓度。
图13证实释放效率与缀合至标记PEG的情况下的第一聚合物的大小(分子量，MW)之间的关系。MW在2kDa至30kDa范围内的PEG缀合至0.2um、0.5um和1.0um磁性颗粒。人CD19+细胞是使用抗PEG/CD19TAC和各种PEG缀合的颗粒从PBMC中阳性选择的。对于所有样品，颗粒释放之前选定细胞的纯度和回收率是相似的。a)示出在缀合的PEG的大小上颗粒释放的依赖性的结果。对于0.2um颗粒，当PEG的大小从2kDa增加至30kDa时释放效率是相对恒定的。另一方面，对于0.5um和1.0um的微粒(MP)，存在强依赖性。当PEG大小为2kDa时，释放效率<10％。释放效率随PEG MW的增加(最多～80％为20kDa和30kDa PEG)而增加。b)在分离后，但在颗粒释放前，通过来自a)的0.5um颗粒样品的流式细胞术获得散射分布。假设侧向散射位移与细胞表面上的颗粒数量相关，并考虑到颗粒释放效率，这些结果表明，缀合的PEG的大小不显著改变结合的颗粒的总数。
图14证实释放效率与缀合至标记PEG的情况下的第一聚合物的大小(分子量，MW)之间的关系。MW在2kDa至30kDa范围内的PEG缀合至0.2um和1.0um磁性颗粒。人CD56+细胞是使用抗PEG/CD56TAC和各种PEG缀合的颗粒从PBMC中阳性选择的。对于所有样品，颗粒释放之前选定细胞的纯度和回收率是相似的。a)示出在缀合的PEG的大小上颗粒释放的依赖性的结果。当观察总的CD56+群体时，对于0.2um纳米颗粒释放效率是相对恒定的并且随PEG的MW增加至30kDa而增加至～50-100％。b)CD56通过在CD56的表达方面相差一个数量级的明亮群体和暗淡群体来表征。对于1.0um颗粒，在这些亚群内释放效率存在显著差异。特别是，颗粒不能有效地以低MW的PEG从明亮群体释放。c)流式细胞术示出b)中描述的效应。在颗粒释放之前，当2kDA或30kDa的PEG缀合至颗粒表面时CD56细胞的染色分布是相同的。颗粒被Pluronic F68释放后，染色分布在30kDa PEG的情况下保持相同，但当2kDA的PEG缀合至颗粒表面时明亮群体缺失。d)对于0.2um纳米颗粒数据与b)相似。与1.0um微粒相比，在明亮的和总的CD56+群体之间并且在缀合的PEG的MW的宽范围内，释放效率是相似的。观察到在靶细胞的明亮和暗淡亚群内标记释放的不同与抗体亲抗原性的构思一致，因为高表达群体将具有更多的配体标记的受体并因此在标记-细胞相互作用中有更高的抗体亲抗原性。通过使用高MW的第一聚合物，对于所有的细胞群体可以实现高释放效率。
图15证实对于PEG和磁性颗粒的情况，释放效率对缀合至标记的第一聚合物的浓度(密度)的依赖性。MW为30kDa的PEG以不同密度缀合至磁性颗粒通过将反应性PEG与颗粒的比例从大量过量(6mg PEG/mg颗粒)改变至亚化学计量的量(47ug PEG/mg颗粒)。人CD19+细胞是用抗PEG/CD19TAC和不同颗粒从PBMC中阳性选择的。纯度(三角形)和回收率(圆形)是相对恒定的，因为颗粒表面上的PEG浓度向下滴定超过>100倍的范围。与此相反，所述颗粒释放效率(菱形)在较低的密度显著降低。BCA蛋白定量测定被用作支持测定，以确认颗粒表面上的PEG密度的差异。在用2％胎牛血清(FBS)温育后，在颗粒上所吸收的蛋白量随PEG(正方形)浓度的降低而增加。PEG化的表面通常与降低的蛋白吸收(防污)有关，因此这样的结果证实，所述PEG密度得到了有效的调控。
图16示出PEG化的颗粒的性质的示意图。当PEG通过官能团和缀合化学结合到颗粒表面时，其构象依赖于尺寸和表面密度。a)示出高表面密度下的较大MW的PEG(例如30kDa)，这将被归类为刷结构(brush regime)。RF是PEG分子的弗洛里(Flory)半径，D是相邻的PEG之间的距离并且L是延伸的长度。b)当表面密度降低时，PEG分子采用蘑菇构象，因此D>RF并且结果是，与刷结构相比L降低。c)当PEG的高表面密度维持但其大小降低(例如从30kDa至2kDa)时，结果L也降低。据推测由于在标记-细胞相互作用中的空间位阻，L在PEG化的颗粒从靶细胞的释放效率中起作用。
图17示出对于PEG的情况，释放效率对第二聚合物的浓度和MW的依赖性。人CD19细胞是使用抗PEG/CD19TAC和30kDa PEG缀合的微粒然后用不同浓度的第二聚合物进行颗粒释放从PBMC中阳性选择的。a)550Da，Pluronic F68(8.35kDa)和30kDa和在很宽的浓度范围进行滴定并且评估相应的释放效率。a)在摩尔基础上，第二聚合物的大小越大，最大释放(>60％)所需的浓度越低。550Da PEG在～2.3mM达到最大释放，Pluronic F68在～0.3mM并且30kDA在～0.08mM达到最大释放。b)示出来自a)的数据，以及在质量百分比(w/v)基础上的浓度。这些结果表明，无论第二聚合物的MW大小，需要相似的质量(从～0.125-0.25％w/v)以实现最大的释放效率。
图18示出对于PEG及其衍生物的情况，标记释放对第二聚合物的不同大小和结构的一般性。人CD19细胞是使用抗PEG/CD19TAC和30kDa PEG缀合的磁性微粒然后进行颗粒释放从PBMC中阳性选择的。a)当第二聚合物的浓度固定为1％(w/v)时，测试的所有MW(从550Da至30kDA的范围)的PEG具有高的释放效率(>75％)，包括PEG衍生物Pluronic F68(箭头)。b)示出PEG和几种含有PEG的衍生物包括Pluronic F68和吐温20的化学结构。这些结果强调标记释放对于不同MW和结构的第二聚合物的一般性。在Pluronic F68的情况下，1％w/v表示～1.2mM的浓度，这是在细胞培养应用中用作添加剂时典型的和无毒的浓度。
图19示出当靶细胞的浓度在宽范围内变化时标记释放的效力。人CD19和CD3细胞是使用合适的抗PEG TAC和30kDa PEG缀合的磁性微粒从PBMC中阳性选择的。最初，将TAC浓度固定为1.5ug/mL并且将细胞浓度固定为1×108个细胞/mL用于磁性标记和纯化步骤。对于颗粒释放，固定的1％(w/v)浓度的Pluronic F68施用于靶细胞的不同稀释液。数据表明，当靶细胞浓度在～1x105-5x107个细胞/mL范围内，释放效率没有显著差异。
图20示出标记和释放对于抗-聚合物抗体配体的不同克隆的一般性。人CD19细胞是使用不同的抗PEG克隆和10kDa PEG缀合的磁性纳米颗粒然后进行颗粒释放从PBMC中阳性选择的。通过用抗CD19克隆1D3(STEMCELL Technologies)和抗PEG克隆CH2074(Silverlake Research)、10B4-2、3F12-1、10E3-1-4、9B5-6-27-7、1D9-6(Life Diagnostics)和E11(Academia Sinica)制备双特异性TAC来评估七个不同的抗PEG抗体克隆。在标记和磁性纯化后，细胞的a)纯度和b)回收率对于所有克隆是相似的，表明它们适合用于特异性标记靶细胞。c)使用第二聚合物Pluronic F68并通过磁性洗涤去除来释放颗粒。对于抗PEG抗体配体的所有不同克隆，释放效率是相似的(通常>70％)。
图21突出了使用磁性颗粒作为标记、PEG作为第一聚合物、抗PEG抗体作为配体和Pluronic F68作为第二聚合物如何可以实现重复的可逆标记。人类细胞预富集CD4+细胞，然后使用抗PEG/CD25TAC和10kDa PEG缀合的磁性纳米颗粒然后用Pluronic F68进行颗粒释放从PBMC中阳性选择CD25+细胞。在初始阳性选择和颗粒释放后(左)，回收纯度为～93％的～1.0x105个细胞。通过两轮离心来洗涤分离的细胞，由于另外的处理(中间)损失一些细胞。当PEG缀合的纳米颗粒被重新加至分离的细胞并且进行第二磁性分离和颗粒释放步骤(右)时，纯度稍有增加，同时基本上所有的靶细胞被重新捕获和释放。这些发现强调了在细胞表面上的配体如何可以被利用用于第二轮的标记和释放。
图22示出使用量子点作为标记、PEG作为第一聚合物、抗PEG抗体作为配体和Pluronic F68作为第二聚合物的细胞的可逆荧光标记。使用NHS介导的缀合化学将荧光量子点纳米颗粒缀合至10kDaPEG。用含有针对CD3或CD45的抗体的抗PEG TAC温育，随后用PEG缀合的量子点温育人PBMC。使用流式细胞仪和荧光显微镜洗涤并分析标记的细胞。a)在CD3的情况下，细胞仪和显微镜表明，～40％的细胞群体被量子点标记，也就是CD3细胞的预期发生。b)在CD45的情况下，>99％的细胞被量子点标记，这与PBMC中的CD45的表达一致。c)标记是可逆的，因为向标记的CD45细胞中加入Pluronic F68去除该信号。总的来说，这些结果强调了本发明的可逆标记方法和组合物在除了细胞分离(包括细胞受体的荧光成像)以外的应用中的用途。
图23证实第一聚合物-缀合的配体和配体-缀合的标记用于CD45+细胞的可逆荧光标记的用途。a)通过用CD45抗体(克隆MEM-28)温育并用大鼠抗小鼠PE(RAM-PE)染色来标记人PBMC。正如CD45的表达谱预期的那样，～100％的淋巴细胞表现出CD45+信号(左)。作为对照，当用荧光抗PEG/HL647标记检测相同细胞时，没有信号(右)。b)当用30kDa PEG使CD45抗体PEG化并用抗PEG/HL647标记检测(左)时，有强烈的阳性信号(>96％的细胞)。此结果及其与RAM-PE信号的相关性证实PEG化的抗体配体与抗PEG/HL647标记之间的特异性相互作用。当1％w/v的Pluronic F68加至细胞中10分钟(右)时，信号从96％减少至3％，显示使标记可逆(箭头)和释放特异性结合的抗PEG/HL647标记的效力。通过流式细胞仪进行获取并通过选通上使用标准方案的活淋巴细胞群体分析的测量结果。
图24证实第一聚合物-缀合的配体和配体-缀合的标记用于CD3+细胞的可逆荧光标记的用途。a)通过用CD3抗体(克隆UCHT1)温育并用具有87.8％淋巴细胞的RAM-PE染色来标记人PBMC，示出CD3+信号(左)。作为对照，当用荧光抗PEG/HL647标记检测相同细胞时，没有信号(右)。b)当用30kDa PEG使CD3抗体PEG化并通过抗PEG/HL647标记检测(左)时，83.4％的细胞具有阳性信号。此结果及其与RAM-PE信号的相关性证实PEG化的抗体配体与抗PEG/HL647标记之间的特异性相互作用。当1％w/v的Pluronic F68加至细胞中10分钟(右)时，信号从83.4％减少至16.3％(箭头)，显示特异性结合的抗PEG/HL647标记的释放。
图25证实第一聚合物-缀合的配体和配体-缀合的标记用于CD3+细胞的纯化和可逆标记的用途。来自人PBMC，CD3+细胞的起始群体是34.1％，并有大约41.8％的单核细胞(左)。将PEG化的CD3抗体(克隆UCHT1)与细胞一起温育，随后加入缀合至抗PEG抗体(克隆3F12-1)的磁性微粒。在磁性洗涤后，以70.1％纯度和9.7％回收率获得CD3+细胞(中)，表明标记靶细胞的特异性，但存在单核细胞至所述颗粒的一些非特异性结合(16.8％)。将第二聚合物Pluronic F68加至纯化的细胞中以释放颗粒并且磁性去除过量的标记。所得的CD3+细胞具有93.0％纯度和7.0％回收率，相应的颗粒释放效率为～71％(右)。增加的纯度和降低的单核细胞污染是通过第二聚合物的第一聚合物/配体相互作用的特异性逆转和通过磁性洗涤去除非特异性结合的细胞的结果。
图26示出在使用缀合至PEG、葡聚糖和多组氨酸(pHIS)第一聚合物的颗粒状磁性标记、荧光配体和不同的第二聚合物的流式细胞仪上进行的可逆标记测定的结果。a)使40kDa葡聚糖缀合的磁性微粒与荧光抗葡聚糖抗体(克隆DX1)一起温育。为了测试第二聚合物对配体的抑制效果，在与葡聚糖缀合的颗粒混合(抑制)之前使抗葡聚糖抗体与可溶性葡聚糖一起预温育。为了测试第一聚合物/配体相互作用的可逆性，在加入可溶性葡聚糖(释放)之前使抗体与葡聚糖颗粒一起温育。这些数据表明，在超过～10mM的浓度时，葡聚糖1kDa、5kDa和40kDa均能有效地完全抑制或逆转相互作用(0％百分比信号)。观察到存在浓度依赖性效应并且对于抑制，IC50值对于葡聚糖1kDa、5kDa和40kDa分别为0.3734mM、0.0.0394mM和0.0011mM。对于释放情况，IC50值对于葡聚糖1kDa、5kDa和40kDa分别为0.3819mM、0.0397mM和0.0015mM。b)以与a)相似的方式，用pHIS缀合的颗粒、抗pHIS抗体(克隆J099B12)和可溶性pHIS来探测抑制和释放。示出与40kDa葡聚糖缀合的颗粒、抗葡聚糖抗体和可溶性1kDa葡聚糖和30kDa PEG缀合的颗粒、抗PEG抗体(克隆9B5-6-25-7)和可溶性1kDa PEG有关的这些结果。对于PEG和葡聚糖的情况，pHIS相互作用可以被完全抑制和逆转，IC50值分别为0.0019mM和0.2367mM。与PEG和葡聚糖对比，释放比抑制的pHIS的IC50值显著更大。总的来说，这些结果示出不同类型的第一聚合物、配体和相应的第二聚合物如何可以应用于本发明的可逆标记方法。
图27示出使用缀合至葡聚糖的磁性颗粒标记作为第一聚合物、抗葡聚糖配体和可溶性葡聚糖作为第二聚合物的细胞标记和纯化的结果。人CD19细胞是使用抗葡聚糖/CD19TAC和40kDa葡聚糖缀合的微粒然后以1-4％w/v加入可溶性40kDa葡聚糖进行颗粒释放从PBMC中阳性选择的。a)为验证标记-细胞相互作用的抗体亲抗原性的影响，滴定TAC以控制标记的受体的密度。在浓度从1.5降低至0.06ug/mL中，颗粒释放效率从18％增加至60％。在此范围内纯度相对恒定，但低于0.75ug/mL，在颗粒释放之前细胞的回收率降低。对于1.5ug/mL的浓度，绝对纯度和回收率为95％和63％。b)对固定浓度的TAC(0.75ug/mL)检查与不同量的葡聚糖缀合的磁性颗粒的细胞分离性能。当葡聚糖密度从饱和降低至亚化学计量条件时，颗粒释放效率大幅提高。当葡聚糖从375ug/mg颗粒(饱和)变化至23ug/mg颗粒(降低的密度)时，颗粒释放效率从33％提高到65％，而纯度和回收率是恒定的。在葡聚糖的甚至更低的密度，细胞回收率存在显著下降。在饱和葡聚糖浓度下，绝对纯度和回收率为94％和101％。总的来说，这些结果示出在标记-细胞相互作用中的抗体亲抗原性在可逆标记的效率中如何起作用。
图28示出使用缀合至pHIS的磁性颗粒标记作为第一聚合物、抗pHIS配体和可溶性pHIS作为第二聚合物的细胞标记和纯化的结果。人CD3细胞是使用抗pHIS/CD3TAC和pHIS缀合的微粒然后以1％w/v加入可溶性pHIS进行颗粒释放从PBMC中阳性选择的。来自人PBMC，CD3+细胞的起始群体是31.1％，并有大约45.3％的单核细胞(左)。在用TAC、pHIS缀合的微粒标记细胞和随后的磁性洗涤后，获得的CD3+细胞为91.0％纯度和27.9％回收率，单核细胞污染为5.1％(中)，表示靶细胞标记的特异性。将第二聚合物pHIS加至纯化的细胞中以释放颗粒并且磁性去除过量的标记。所得的CD3+细胞具有95.1％纯度和20.0％回收率，相应的颗粒释放效率为～72％(右)。增加的纯度和降低的单核细胞污染是通过第二聚合物的第一聚合物/配体相互作用的特异性逆转和通过磁性洗涤去除非特异性结合的细胞的结果。
图29示出两种不同的聚合物系统可以组合用于正交磁性标记和两种不同的细胞类型的细胞分离而不需要阻滞和/或离心步骤。在同一时间将抗葡聚糖/CD19TAC和抗PEG/CD3TAC与先前冷冻的PBMC一起温育。加入葡聚糖缀合的磁性纳米颗粒以捕获CD19细胞并通过磁性洗涤分离(第一阳性级分)。向剩余的细胞(阴性级分)中加入PEG缀合的磁性纳米颗粒以捕获CD3细胞并通过磁性洗涤分离(第二阳性级分)流式细胞术直方图表明，获得高纯度的两种细胞类型(对于CD19为96.0％并且对于CD3为98.0％)，这说明两个聚合物系统之间不存在交叉或干扰。这些正交标记系统的另一优点是从使CD19和CD19抗体标记步骤合并来获得时间节省，从而使这个实验方法在约45分钟内完成。原则上，更多标记策略可以合并以分离来自相同样品的多种不同的细胞类型，诸如第三聚合物/抗聚合物系统或生物素化的抗体和链霉亲和素缀合的磁性颗粒(未示出)。
图30示出如何使用与高效标记逆转(颗粒去除)结合的两种聚合物系统使正交磁性标记促进细胞亚群的分离。在此实验中，通过连续阳性选择策略从PBMC中分离人类记忆B细胞(CD19+/CD27+)。将抗PEG/CD19和抗葡聚糖/CD27TAC与PEG和葡聚糖-缀合的磁性纳米颗粒合并一起并通过流式细胞术分析。最初，细胞与CD19和CD27TAC共温育。a)然后加入PEG缀合的纳米颗粒并通过磁性分离将细胞阳性选择为95.4％纯度。通过加入1％的Pluronic F68和另外的磁性分离来去除PEG缀合的颗粒。b)在第二个步骤中，通过加入葡聚糖缀合的纳米颗粒和磁性分离来阳性选择纯度为93.4％的CD19+/CD27+细胞。使用正交和可逆聚合物系统(PEG和葡聚糖)使整个方案在少于60分钟内进行。
图31示出使用连续阴性(CD4)和阳性(CD25)选择然后颗粒释放来从PBMC中选择无颗粒的CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)。a)方案和分离策略的概述。为了减少过程长度，将含有葡聚糖TAC和针对不需要的细胞的抗体(STEMCELL Technologies)的CD4富集的阴性选择混合物与抗PEG/CD25TAC(步骤1)一起温育。将葡聚糖微粒加至细胞中以消耗所有不想要的细胞，留下>90％CD4+细胞的细胞群体(数据未示出)。下一步(步骤2)，将PEG缀合的纳米颗粒加至细胞中以捕获CD4+细胞的CD25+亚群并通过磁性洗涤分离。使用PluronicF68或PEG10kDa从选定的CD4+CD25+细胞中释放PEG缀合的纳米颗粒(步骤3)。b)该图显示使用Pluronic F68或10kDa PEG在颗粒释放前(左)和后(右)选定的细胞的纯度和数目。Tregs的纯度(在流式细胞术期间通过CD4+CD25+FOXP3+表达评估)为～85％并回收～1.0X105个细胞。在颗粒释放后由于逆转的特殊性质纯度有所提升。使用用于分离Tregs的新策略导致快速的～60分钟过程，并以无颗粒的形式产生细胞，它是对于许多下游应用是非常可取的。
图32描述了用于从PBMC中分离无颗粒的CD4+CD127低CD25+Treg细胞的连续阴性/阳性/阴性细胞分离策略。过程的第一部分(步骤1-3)是CD4+细胞的富集，随后阳性选择CD25+细胞。这是如图31的过程和结果所述通过葡聚糖和PEG聚合物系统以及颗粒释放的组合来实现。最终选择(步骤4)是使用葡聚糖系统来消耗CD127。这种阴性选择是通过将CD4+CD25+细胞与抗葡聚糖/CD127TAC和葡聚糖缀合的微粒一起温育来实现。在最终磁性洗涤后，在小于80分钟过程内以无颗粒的形式回收CD4+CD25+Treg细胞的CD127低亚群。虽然本实施例描述Treg亚群的分离，相同的连续分离策略可以应用到广泛的稀有细胞亚群(例如，Th1和Th17细胞及其各自的亚群)中。这种方法的另一个扩展是引入生物素化的抗体和链霉亲和素缀合的磁性颗粒(未示出)作为正交标记策略，或者通过使用另外的聚合物/抗聚合物系统。
图33描述了用于从PBMC中分离无颗粒的CD4+CD25+Treg细胞的阳性/阴性细胞分离策略。在第一个步骤中，CD25+细胞是使用抗PEG/CD25TAC和PEG缀合的纳米颗粒进行阳性选择的。在第二个步骤中，通过与Pluronic F68竞争从细胞中去除颗粒。在第三个步骤中，使用含有葡聚糖TAC和针对不需要的细胞的抗体以及葡聚糖缀合的微粒的CD4阴性选择混合物来进行CD4富集以产生期望的CD4+CD25+Treg细胞。这个构思是在图31的结果和过程中所述的策略的逆转，它使用初始CD4富集然后CD25+选择。这种逆转方法的一个潜在优点在于，更少的抗体是富集步骤所必需的，因为在初始阳性选择期间所述细胞已经被部分纯化。这种方法的另一优点是，它是非常适合用于从复杂样品(诸如全血、骨髓或组织)中分离稀有细胞类型和/或子集，其中污染细胞类型难以通过常规方法获得高纯度和产率的细胞。
图34描述了用于从PBMC中分离无颗粒的CD4+CD127低CD25+Treg细胞的连续阳性/阴性/阴性细胞分离策略。这是通过与图33相似的过程使葡聚糖和PEG系统以及颗粒释放的组合来实现。过程的第一部分(步骤1)是使用PEG系统的CD25+细胞的阳性选择。在磁性洗涤前加入含有葡聚糖TAC和针对非CD4细胞的抗体的CD4阴性选择混合物。接着，(步骤2)PEG缀合的纳米颗粒被释放并且将抗葡聚糖/CD127TAC加至细胞中。加入葡聚糖-缀合的微粒以标记CD127高和非CD4细胞，然后磁性去除。残留在阴性级分中的细胞是无颗粒的CD4+CD127低CD25+Tregs。如果需要，效应(CD4+CD25-)T细胞也可以从同一样品中获得。在这种情况下，(步骤3)，将葡聚糖-缀合的微粒加至步骤1的CD25-细胞中。非CD4细胞被磁性去除以留下阴性级分中的无颗粒的CD4+CD25-T细胞。总体而言，可逆和正交标记系统的组合使得在50分钟或更少的时间内分离CD4+CD127低CD25+Tregs及其效应细胞，这在分离稀有细胞或细胞亚群的表现中是重大改进。
表1示出市售可获得的抗聚合物抗体配体连同其同种型、克隆、物种和供应商的列表。
表2示出市售可获得的磁性颗粒连同其大小、表面涂层和功能的列表。
表3示出相对于设计用于细胞分离应用的6种商业技术的本发明的颗粒去除方法的大致时机。
表4比较了当颗粒上的第一聚合物和溶液中的第二聚合物的大小发生变化时的颗粒释放效率。使用具有缀合至2kDa、10kDa和30kDa PEG的微粒的PEG/抗PEG系统来分离CD19细胞。对于缀合至不同大小的PEG的颗粒，已纯化的细胞的纯度和回收率是相似的。当使用1％(w/v)的550Da、30kDa PEG或Pluronic F68以释放颗粒时，释放效率也与每个类型的颗粒相似。然而，对于缀合至2kDa PEG的颗粒，释放效率较差(<10％)，而对于缀合至10或30kDa PEG的颗粒，释放效率高(>60％)。
表5是对于使用PEG/抗PEG系统分离并经历使用游离PEG或Pluronic F68的竞争性颗粒去除的CD19、CD56和CD3细胞的细胞分离性能数据的总结。在指示处使用10kDa PEG缀合的纳米颗粒(NP)或20-30kDa PEG缀合的微粒(MP)。该数据示出在颗粒释放前和后细胞的纯度(％P)和回收率(％R)的比较。使用目标细胞类型的荧光抗体和流式细胞术来评估％P。释放效率(％Rel)是颗粒释放和磁性去除前和后的细胞回收率的比率。
表6是对于使用PEG/抗PEG系统分离并经历通过游离PluronicF68的竞争性颗粒去除的CD19细胞的活力数据的总结。如指示使用10kDa PEG缀合的纳米颗粒(NP)或20kDa PEG缀合的微粒(MP)。使用碘化丙啶(PI)染色和流式细胞术来评估活力。在所有的情况下，CD19细胞的纯度大于96％。该数据示出在去除颗粒前和后细胞活力的比较。颗粒去除步骤不会对所选细胞的活力产生影响。
表7是从在包括PEG/抗PEG、葡聚糖/抗葡聚糖和pHIS/抗pHIS的不同的第一聚合物/配系统统连同多种第二聚合物上的可逆标记测定中获得的结果的总结。抑制是指其中在与第一聚合物缀合的标记温育之前第二聚合物与配体预温育的情况。释放是指其中配体和第一聚合物缀合的标记温育，随后加入第二聚合物的情况。为了获得剂量反应曲线，在宽范围内滴定第二聚合物的浓度，并且将数据拟合成S形曲线以估计IC50值。通过在摩尔(mM)和质量(％w/v)基础上考虑第二聚合物的浓度来报道结果。
表8是使用葡聚糖/抗葡聚糖或pHIS/抗pHIS系统分离的细胞的细胞分离性能数据的总结。在葡聚糖的情况下，使用40kDa葡聚糖缀合的微粒(MP)和抗葡聚糖/CD19TAC来分离CD19细胞。在分离后，通过加入可溶性1％(w/v)40kDa葡聚糖来释放颗粒。在pHIS的情况下，使用0.84kDA pHIS缀合的MP和抗pHIS/CD3TAC来分离CD3细胞。在分离后，通过加入可溶性1％(w/v)0.84kDa pHIS肽来释放颗粒。这些结果表明本发明的方法和组合物是如何普及到不同类型的聚合物。
发明详述
方法
本发明提供一种将样品中的生物靶标与标记分离的方法，其包括：
1)通过连接系统使所述生物靶标与所述标记结合，所述连接系统包含第一聚合物和与所述第一聚合物结合的配体；和
2)向所述样品中加入第二聚合物以将所述生物靶标与所述标记分离。
在一个实施方案中，本发明提供一种将样品中的生物靶标与标记分离的方法，其包括：
1)使用连接系统使所述生物靶标与所述标记结合，所述连接系统包含与连接至与第一聚合物结合的配体的生物靶标结合的配体和与所述第一聚合物缀合的标记；和
2)向所述样品中加入第二聚合物以将所述生物靶标与所述标记分离。
在另一个实施方案中，本发明提供一种将样品中的生物靶标与标记分离的方法，其包括：
1)使用连接系统使生物靶标与标记结合，所述连接系统包含与连接至第一聚合物的生物靶标结合的配体和与结合到所述第一聚合物的配体缀合的标记；和
2)向所述样品中加入第二聚合物以将所述生物靶标与所述标记分离。
标记可以包括可用于结合、检测或从样品内分离生物靶标的任何实体，包括但不限于固体载体、荧光蛋白和染料、抗体、酶、功能蛋白、肽或生长因子和放射性标签或元素标签。标记优选地为固体载体包括但不限于具有不同组成(氧化铁、镍、乳胶、聚苯乙烯、琼脂糖等)或功能(磁性、致密、荧光等)的颗粒(包括纳米颗粒、微粒、微球或珠)、表面(移液管尖端、塑料管、细胞培养皿等)和柱。
在一个实施方案中，标记是磁性纳米颗粒或微粒。磁性颗粒可以从各种不同的商业来源(表2)来获得，或可使用本领域先进方法来合成。颗粒优选以溶液形式，诸如铁磁流体、胶体溶液和颗粒悬浮液。颗粒优选氧化铁，但也可以是在磁场内被永久或暂时磁化的任何组合物。颗粒优选超顺磁性，但也可以是铁磁性。颗粒的优选大小为20纳米(nm)至2微米(um)，但也可以大至5微米。颗粒优选被涂覆或包含在基质内，它提供功能性化学基团(COOH、NH2、SH等)用于表面改性和配体(聚合物、蛋白质、抗体等)的缀合。
第一聚合物和第二聚合物可以是相同或相似的，并且可以是用于本文所述方法的任何聚合物。本发明所述的聚合物可以通过已知技术制备或合成或商购获得。聚合物优选两亲性或亲水性并且是均聚物(含有相同的重复亚基)。聚合物包括但不限于聚(乙二醇)(PEG)、PEG衍生物、聚(羧基甜菜碱)、葡聚糖、淀粉、肝素、几丁质、纤维素、环状糖的其它聚合物、具有高防污性质的合成聚合物、肽或核酸。PEG衍生物包括但不限于非离子表面活性剂诸如吐温20或80、TritonX-100和Pluronic F68(CAS#9003-11-6，也称为泊咯沙姆(Poloxamer)188、Lutrol F68、Kolliphor P188或化学上称为聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇))。
第一聚合物和第二聚合物对于配体优选具有相同或相似的亲和力。在一个实施方案中，第一聚合物和第二聚合物是相同的聚合物，或是由相同或相似的单体组成。
第一聚合物可以是任何大小，但优选具有高于0.5kDa且更优选高于5kDa的分子量。第一聚合物可以是任何大小，但优选具有高于0.5kDa且更优选高于5kDa的分子量。
在一个实施方案中，第一聚合物和第二聚合物独立地选自由PEG、Pluronic F68和吐温20组成的组中。
在另一个实施方案中，第一聚合物是PEG并且第二聚合物可以是具有含有乙二醇重复单元的结构的任何聚合物，包括但不限于550Da PEG、1kDa PEG、2kDa PEG、5kDa PEG、10kDa PEG、20kDa PEG、30kDa PEG、40kDa PEG、Pluronic F68和吐温20。聚合物可以是直链的或支链的。优选地，第二聚合物是Pluronic F68。
在另一个实施方案中，第一聚合物和第二聚合物是葡聚糖。
在另一个实施方案中，第一聚合物和第二聚合物是肽。所述肽包括具有重复氨基酸的蛋白质融合标签，诸如多组氨酸(pHIS标签)。
将所述第二聚合物加至样品中一段时间，足以从标记释放生物靶标。时间段优选小于10分钟，优选小于5分钟，更优选小于1分钟，且最优选小于30秒。
将所述第二聚合物以足以从标记释放生物靶标的浓度加至样品中。浓度优选至少0.1％w/v，更优选至少0.25％w/v且最优选至少1.0％w/v。
结合至该生物靶标或第一聚合物的配体可以是能够结合到靶标或聚合物的任何分子，包括分子、肽、蛋白质或抗体。配体优选为抗体或其片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv或单结构域片段。所述抗体或其片段可以使用本领域已知的标准技术来制备。
结合至生物靶标的配体优选具有高亲和力。作为实例，高亲和力抗体被认为具有平衡解离常数(Kd)，其小于1x10-7M(100nM)。
针对选定抗原的多克隆抗体可以通过本领域普通技术人员从各种温血动物(诸如马、牛、各种家禽、兔、小鼠或大鼠)中容易地产生。
优选地，单克隆抗体用于本发明的方法和组合物。对选定的抗原具有特异性的单克隆抗体可以使用常规技术容易地产生(参见美国专利号RE 32,011、4,902,614、4,543,439和4,411,993，其通过引用并入本文；还参见Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension inBiological Analyses,Plenum Press,Kennett,McKearn和Bechtol(编)，1980，和Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow和Lane(编)，ColdSpring Harbor Laboratory Press,1988,其也通过引用并入本文)。
也可以利用其它技术来构建单克隆抗体(参见William D.Huse等,"Generation of a Large Combinational Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda,"Science 246:1275-1281,1989年12月；还参见L.Sastry等,"Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies:Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library,"Proc Natl.Acad.Sci USA 86:5728-5732,1989年8月；还参见Michelle Alting-Mees等,"Monoclonal Antibody ExpressionLibraries:A Rapid Alternative to Hybridomas,"Strategies in Molecular Biology 3:1-9,1990年1月；这些参考文献描述了从Stratacyte,La Jolla,Calif.可获得的商业系统，这个系统能够通过重组技术生产抗体)。
同样地，利用重组DNA技术可以构建结合伴侣。在一个实施方案中，使用用于可变区的核苷酸引物扩增编码来自产生目标单克隆抗体的杂交瘤的可变区的基因。这些引物可以由本领域普通技术人员合成，或者可以从市售来源购买。可利用所述引物扩增重链或轻链可变区，然后可以将其分别插入载体诸如ImmunoZAPTM.H或ImmunoZAPTM.L(Stratacyte)中。这些载体可随后被引入到大肠杆菌中表达。利用这些技术，可以产生含有VH和VL结构域融合物的大量单链蛋白质(参见Bird等,Science 242:423-426,1988)。此外，可以利用这种技术将“鼠”抗体改变成“人”抗体，而不改变抗体的结合特异性。
针对生物靶标表面上的选定抗原或针对聚合物的抗体也可以从商业来源获得。针对各种聚合物的高亲和力抗体配体是商购可获得的(表1)。例如，识别葡聚糖重复单元的鼠单克隆IgG1抗体(克隆DX1)从STEMCELL Technologies获得。抗PEG抗体的最新发展源于评估药物或治疗剂的PEG化/缀合的定量方法的需要。结果，识别PEG的重复单元的单克隆抗PEG抗体可以从多个供应商获得，包括Silverlake Research,Life Diagnostics及其它(图20中的性能数据)。聚合物和抗聚合物抗体的简易性和广泛适用性使得它们对于依赖昂贵且费力的重组蛋白或抗体方法来产生所需的结合伴侣的标记技术(用于细胞分离和荧光应用)具有吸引力。
术语“连接”包括两个配体或配体和聚合物的共价和非共价结合。
在一个实施方案中，使用双特异性抗体复合物，诸如四聚体抗体复合物(TAC)使结合到生物靶标的抗体连接至结合第一聚合物的抗体。在TAC中，使用结合至两种抗体的Fc区的第三抗体来连接两种抗体。特别是，通过使能够结合至生物靶标的第一单克隆抗体与结合至第一聚合物的第二单克隆抗体混合可以制备TAC。第一和第二单克隆抗体来自第一动物物种。使第一和第二抗体与针对所述第一动物物种的抗体的Fc片段的第二动物物种的大约等摩尔量的单克隆抗体反应。使第一和第二抗体也可以与针对所述第一动物物种的抗体的Fc片段的第二动物物种的大约等摩尔量的单克隆抗体的F(ab’)2片段反应。(参见Lansdorp的美国专利号4,868,109，其通过引用并入本文用于描述四聚体抗体复合物和制备该复合物的方法)。
优选地，该四聚体抗体复合物(TAC)的浓度小于5μg/mL，更优选小于1.5μg/mL。
术语“缀合”包括标记和聚合物或标记和结合到聚合物的抗体之间的共价和非共价结合。
通过确立的生物缀合技术(图3)可以制备第一聚合物缀合的标记。例如，在单步反应中使用表面羧基(COOH)基团、交联剂EDC和胺衍生的聚合物可使商购可获得的磁性颗粒(表2)缀合至聚合物。同样，用一步反应使具有胺(NH2)或巯基(SH)基团的颗粒与NHS或马来酰亚胺衍生的聚合物缀合。或者，使用EDC、NHS或马来酰亚胺化学，或其它公知的蛋白修饰技术可将聚合物直接缀合至抗体。也可以使用涉及共价或非共价方法的标准生物缀合技术使抗聚合物抗体与颗粒连接。
生物靶标可以是希望从样品中分离的任何靶标，包括但不限于细胞、细胞器、病毒、朊病毒、DNA、RNA、抗体、蛋白质、肽和小分子。
在优选的实施方案中，生物靶标是细胞，其包括任何类型或谱系的细胞，诸如干细胞、祖细胞、胎儿细胞和成熟细胞。
因此，在另一个方面，本发明提供一种从样品中分离靶细胞的方法，其包括：
(a)用与连接至结合至第一聚合物的抗体的靶细胞结合的抗体温育样品，
(b)用缀合至第一聚合物的标记温育来自(a)的样品，
(c)从样品中分离与标记结合的靶细胞，
(d)加入第二聚合物以释放与标记结合的靶细胞，和
(e)分离细胞与标记。
在上述方法的一个实施方案中，含有针对所需细胞靶标的抗体和针对聚合物缀合的标记的抗体的双特异性抗体复合物用于将细胞和颗粒连接在一起(图1)。双特异性抗体复合物可以是四聚体抗体复合物(TAC)。在温育异源细胞样品与TAC后，在第二个步骤中进一步温育第一聚合物缀合的标记，将细胞和标记连接在一起。然后根据标记的性质(荧光、磁性、致密等)来纯化细胞。当标记是聚合物-缀合的磁性颗粒时，所述靶细胞可以通过磁性洗涤纯化。为在生理条件下去除颗粒，将游离的可溶性第二聚合物加至样品(具有过量的聚合物缀合的标记浓度)中，并培养一短时间(数秒至数分钟)。然后使用磁性洗涤将被释放的标记从样品中去除并且纯化的、无标记的细胞来备用。
因此，在另一个方面，本发明提供一种从样品中分离靶细胞的方法，其包括：
(a)用与连接至第一聚合物的靶细胞结合的抗体温育样品，
(b)用缀合至结合第一聚合物的抗体的标记温育来自(a)的样品，
(c)从样品中分离与标记结合的靶细胞，
(d)加入第二聚合物以释放与标记结合的靶细胞，和
(e)分离细胞与标记。
在上述方法的一个实施方案中，使针对所需细胞靶标的聚合物-缀合的抗体与异源细胞样品一起温育(图2)。在第二个步骤中，使样品与抗-聚合物抗体缀合的标记一起温育，将细胞和标记连接在一起。根据标记的性质来纯化细胞，然后通过加入游离的可溶性第二聚合物来去除标记。
上述方法可以用于阳性和阴性选择技术。在阳性选择技术中，配体或抗体结合至希望从样品中分离的细胞中。在阴性选择技术中，配体或抗体结合至希望从样品中去除的细胞从而留下样品中的所需细胞。
本发明的聚合物/抗-聚合物系统是独特的，因为所述试剂是廉价的、化学上确定的和对生物样品无毒性。如前所述，优选的聚合物包括聚(乙二醇)(PEG)、PEG衍生物、聚(羧基甜菜碱)、葡聚糖、淀粉、肝素、几丁质、纤维素、环状糖的其它聚合物、具有高防污性质的合成聚合物、肽或核酸。
合成的聚(乙二醇)(PEG)含有乙二醇的重复单元并且通常是线性的惰性聚合物，但也可以呈多臂或星形构型的支链。它在结构和分子量方面是高度单分散的。PEG是亲水性的并且众所周知其广为关注的溶解特性。例如，PEG在水中具有非常高的溶解度、高排阻体积和相应的旋转大半径。由于其弹性和柔韧性，PEG还具有高度的构象熵。PEG具有与更疏水性并具有较高界面能的聚合物相反的低聚合物-水界面能(Krishnan,Weinman等，2008)。PEG的高水溶性归因于其与水良好的结构拟合，其与PEG形成定向键使得在分子周围存在大的水化外壳(Allen,Dos Santos等，2002)。PEG衍生物也很常见，并且包括非离子表面活性剂诸如Pluronic F68、吐温20/80、Triton X-100和许多其它衍生物(图18)。
分子量范围小于550Da至大于40kDa的高纯度PEG可商购获得，并具有化学修饰以促进容易缀合至生物分子、颗粒或表面。蛋白质、抗体、治疗剂、颗粒和表面的PEG化普遍存在于生物医学中。PEG缀合证实对蛋白质、细胞和其它生物物质的超强防污(减少非特异性结合)。低界面能使得它对于生物分子在热动力学上不利于非特异性附着于表面。在制药工业中，PEG用于提高溶解性并增加不同药物或治疗性化合物的循环次数，结果是免疫系统、肝和脾细胞的非特异性摄取减少。FDA批准PEG和Pluronic F68用于某些生物医学应用。此外，PEG和几种衍生物在FDA GRAS名单中(通常认为是安全的)，它支持了其对于生物医学应用的低毒性。现在存在PEG化化合物(包括在生物医学中有广泛应用的可商购获得的药物、蛋白质和细胞因子)的大文库。因此存在如下优点：本发明的方法和组合物可以用于这些不同化合物对细胞或其它靶标的特异性标记和释放。
本发明的令人惊奇的结果是，高亲和力相互作用在生理条件下是可逆的。通常，因为弱结合，可以用大量过量的竞争剂来逆转适度亲和力(KD>0.5uM)的抗体或蛋白质相互作用。与此相反，因为靶抗原和抗体或配体之间的紧密结合，高亲和力相互作用(KD<100nM)通常难以快速逆转并且在温和条件下。抗PEG抗体与PEG的相互作用是高亲和力的并且抗PEG的许多不同克隆具有低于100nM的亲和力(表1)。当对抗PEG和PEG缀合的表面的相互作用进行动力学检测时，缔合和解离率预测亲和力小于10nM(图4)。意想不到的发现是，加入可溶性PEG或PEG衍生物(诸如Pluronic F68)足以在几秒钟内定量逆转所述相互作用。测试不同PEG的抑制和释放性能的另外的可逆结合测定进一步证明快速和有效的可逆性(图5和图6)。有趣的是注意到，抑制和释放的IC50值是相似的(表7)。
这种高亲和力且可逆的相互作用可以成功用于诸如以下根据本发明的方法和组合物的免疫磁性细胞分离的应用或其它应用中。例如，聚合物-缀合的磁性颗粒可与识别聚合物和所需细胞类型的配体(例如TAC)结合使用(图1、图7和图8)或者抗-聚合物缀合的磁性颗粒可与聚合物缀合的配体结合使用(图2和图25)。细胞可被磁性标记和纯化并且随后可通过加入游离的可溶性聚合物来释放颗粒。当使用PEG/抗PEG系统进行时，在加入游离的聚合物竞争剂的数秒至数分钟内，结合逆转的速度和效率可以通常>70-100％效率(如通过细胞回收测量)(表5)。从选定的细胞去除颗粒并使用磁铁洗涤的整个方法可以在3分钟内完成，这比现有技术的的方法更快(表3)。颗粒去除后，由于所述方法的轻柔和温和性质，细胞保持高活性(表6)。
描述PEG/抗PEG的方法和组合物是一般意义上的，它们可以延伸到其它聚合物用于快速可逆标记。
葡聚糖是天然的中性多糖并且类似PEG，它是惰性的、生物相容的并具有良好的防污特性。通常认为葡聚糖不太灵活并且由于其重复葡萄糖单元的结构而比PEG含水少。不像线性PEG，葡聚糖通常为支化聚合物。在可逆的结合测定中，我们的数据表明使用可溶性葡聚糖，葡聚糖和抗葡聚糖抗体的相互作用是可逆的，并且类似PEG/抗PEG，释放与抑制的IC50值是相似的(图26和表7)。该数据进一步表明从摩尔浓度的角度来看，当需要低浓度时有利的是使用高MW葡聚糖(>40kDa)以实现有效释放，这也与来自PEG/抗PEG系统的结果是一致的。当40kDa葡聚糖缀合的颗粒和含有抗葡聚糖抗体的TAC组合用于细胞标记和纯化时，可以获得高纯度和回收率的靶细胞并且颗粒释放效率类似于PEG/抗PEG系统(表5和表8)。
多组氨酸(pHIS)肽是重复组氨酸氨基酸的聚合物。pHIS通常含有6-10个重复单元，并且在重组表达的蛋白质和抗体中是常见的融合标记。pHIS与二价金属阳离子形成强键，并因此与镍负载的珠或柱组合，经常应用于蛋白质和抗体纯化。因为有许多可商购获得的抗PHIS抗体(表1)，所以pHIS可以根据本发明的方法和组合物用于快速可逆标记。在可逆结合测定中，我们的数据表明使用可溶性pHIS作为释放剂，pHIS和抗pHIS的相互作用是可逆的(图26和表7)。与PEG/抗PEG和葡聚糖/抗葡聚糖系统相反，可溶性pHIS肽的抑制和释放之间的IC50值存在显著差异。这种差异可能是由于pHIS与葡聚糖和PEG相比的不同结构特性并且通过采用更高MW的pHIS作为释放剂可能会被提高。无论如何，当0.84kDa pHIS缀合的颗粒和含有抗PHIS抗体的TAC组合用于细胞标记和纯化时，获得高纯度和适度回收率的靶细胞。向标记的细胞中加入可溶性0.84kDa pHIS肽导致～69％的颗粒释放效率(表8)，显示出在第三聚合物系统中可逆标记的可行性。
快速可逆标记的新颖性归因于几个因素。使用用于标记和颗粒释放的聚合物是有利的，因为每个聚合物分子是多价的，具有与重复单元的数目几乎同样多的配体结合位点。例如，分子量为10kDa的PEG具有约227个乙二醇的重复单元。考虑聚合物缀合的标记与抗-聚合物抗体的高亲和力相互作用。一旦结合，该对由于它们的高亲和力结合而稳定。随后，通过加入过量的游离聚合物来快速逆转相互作用。由于聚合物竞争剂的多价(多个结合位点)，有效浓度比绝对浓度要高得多，并驱动相互作用的快速和有效逆转。例如，1％(w/v)的10kDaPEG具有～227mM的有效乙二醇单体浓度和仅1mM的绝对浓度。由于本发明中使用的抗PEG抗体的典型浓度为约1.5ug/mL(10nM)，第二聚合物和抗聚合物配体之间的浓度差异大于百万倍(106)过量。通常在生理条件下浓度难以达到如此大的差异，因此使用多价聚合物和抗-聚合物配体是有利的。
因此，采用具有高分子量(MW)或等效的大量重复单元的第二聚合物是有用的。来自使用PEG/抗PEG系统的可逆结合测定(图6和表7)和细胞分离实验(图17)的数据表明，随着第二聚合物的MW从550Da增加至30kDa，高效可逆标记所需的浓度(摩尔计)降低。例如，在细胞分离实验中，需要～2mM的PEG 550用于有效释放，而仅需要～0.2mM的PEG 30kDa以获得相同的性能。当第二聚合物的浓度标准化为％(w/v)质量基础时，滴定曲线是重叠的，这表明它是在重要的释放过程中存在的聚合物亚基的总数(表7)。因此，优点是可以采用高MW的第二聚合物(诸如Pluronic F68(8.35kDa)或PEG 30kDa)的相对低的摩尔浓度(～1mM)用于快速和有效的颗粒释放。
可能有除了第二聚合物的浓度和多价之外的其它因素来助于此类快速且高效的可逆标记。我们推测，PEG和葡聚糖的独特的溶液特性和抗原-抗体(聚合物-配体)相互作用的性质发挥作用。抗原-抗体结合涉及许多相互作用，包括长程力诸如离子、氢和帮助克服水合能量的疏水键以及短程范德华力(Reverberi和Reverberi 2007)。PEG和葡聚糖是高度灵活的并具有大的水化外壳的事实可能对可逆性的机制是重要的。
与颗粒状系统和细胞(或生物分子)以及多个结合位点共同起作用的现象是抗体亲抗原性现象(图9)。抗体亲抗原性是多个结合相互作用的结合强度，而亲和力是单个相互作用的强度。纳米颗粒或微粒具有大的表面积并且当缀合至聚合物或抗体时，它们具有相应的大量结合位点(其化合价高)。细胞是相似的，因为它们具有大的表面积和高密度的潜在结合位点(受体)。因而，颗粒-细胞相互作用往往涉及多个键，其共同增强复合物的稳定性和强度。这种增强是解离速率增加的结果，当相互作用的量较高时增强可以是剧烈的。在免疫磁性细胞分离中，已经利用抗体亲抗原性通过诸如在美国专利号5,773,224和美国专利号7,776,562中所述的那些弱亲和力配体和交联剂来创造稳定但可逆的结合。当标记和靶标的相互作用具有高亲和力时，诸如在本发明中所述的聚合物/抗-聚合物系统，过多的抗体亲抗原性可能对可逆性是有害的。通过使用本文描述的方法和组合物，所得的相互作用是高亲合力、低抗体亲抗原性并容易可逆。
通常对于细胞分离，直接和间接标记技术用于将颗粒靶向至细胞。直接技术涉及使用结合至细胞表面受体的初级抗体缀合的颗粒。间接技术的实例包括使用生物素化的抗体和链霉亲和素缀合的颗粒或本发明的方法和组合物。根据实验参数，间接技术通常导致比直接技术更少数量的结合颗粒(图10)，并因此通常容易从通过间接技术标记的细胞释放颗粒。
在细胞分离应用中存在影响聚合物/抗聚合物系统的抗体亲抗原性的几个实验参数。细胞分离领域的技术人员都知道，需要抗体和颗粒的滴定来优化分离的细胞的纯度和回收率并且相同的原则可应用于优化颗粒释放。作为实例，考虑将PEG缀合的磁性颗粒、抗PEG/抗细胞TAC和Pluronic F68的组合作为释放剂。其中最大限度地减少颗粒-细胞相互作用的抗体亲抗原性的最有效方案是具有与细胞表面受体相比的大量过量颗粒和限制性(非饱和)浓度的TAC。在限制性TAC浓度下，颗粒在宽范围的滴定不影响细胞分离性能或抗体亲抗原性，并因此颗粒释放效率是恒定的(图11)。当TAC浓度向上滴定时，更高密度的细胞表面受体被标记并且结合的颗粒的数量和颗粒-细胞的抗体亲抗原性均增加。结果是颗粒释放效率急剧降低(图12)。对于大多数细胞类型，～1x108个细胞/mL的细胞、～0.15-1.5ug/mL(1-10nM)的抗体浓度和0.05-0.5mg/mL的颗粒浓度适合于高纯度、回收率和颗粒释放。一些优化在解释受体密度、抗体亲和力和颗粒特性的差异中是必需的。
缀合至标记和配体的聚合物的大小和密度也可以影响抗体亲抗原性和释放效率。当PEG以低密度缀合至表面(例如颗粒)时，其呈现称为蘑菇结构(mushroom regime)的伸展构象。当PEG以高密度缀合时，该构象更紧凑并且刷结构占主导(图16)。也可通过其分子量(MW)来调节颗粒表面的PEG密度。PEG分子半径随MW而增加(Jokerst,Lobovkina等，2011)。当颗粒表面的官能团之间的距离小于PEG分子的半径时，密度受空间位阻(排阻体积效应)的限制(Nagasaki 2011)。结果是增加MW降低了PEG密度(图16)。对于PEG缀合的颗粒，我们的数据显示，当PEG的MW增加时颗粒释放效率增加(平稳段在20-30kDa)，与降低的颗粒-细胞抗体亲抗原性一致(图13和图14)。当PEG的MW固定在30kDa并且密度向下滴定时，意想不到的发现是颗粒释放效率下降。这可能是增加的细胞非特异性结合的结果(图15)，或者在此结构中存在太多空间位阻用于释放聚合物以渗透到颗粒-细胞相互作用(表4)。相反，对于葡聚糖缀合的颗粒，我们的数据表明向下滴定颗粒表面的葡聚糖密度提高了颗粒释放效率(图27)，这与减少颗粒-细胞的抗体亲抗原性一致。尽管当缀合至颗粒时在PEG和葡聚糖聚合物之间观察到差异，总体我们的数据支持了如何优选以低抗体亲抗原性连接至细胞的高亲和力配体用于有效的颗粒释放的构思。
用PEG/抗PEG系统观察到的有趣和有用的现象是可逆的重复标记。在从纯化的细胞释放颗粒之后，可以通过离心洗涤细胞以去除过量的游离的可溶性聚合物。当聚合物-缀合的颗粒被加回时，所述细胞可通过磁性洗涤进行纯化，并第二次释放新的颗粒(图21)。这表明，在洗去用于颗粒释放的过量聚合物之后在抗PEG抗体上的结合位点(在细胞表面上)保持活性，可能是因为游离聚合物从抗PEG抗体上以非常低的浓度解离。这种效果可以进一步开发用于细胞磁性分离之后的特定荧光标记，或用于研究选定的细胞通过靶向PEG化药物、蛋白质或细胞因子对细胞表面上的抗PEG TAC复合物的功能性反应。
本发明的聚合物/抗-聚合物系统的优点是它广泛适用于不同的生物靶标。例如，可以基于其独特的受体表达，通过与针对所需受体的抗体和抗-聚合物抗体形成TAC，然后用聚合物缀合的磁性颗粒温育来分离不同细胞。无论被分离的细胞类型如何，可以使用相同的聚合物竞争剂从细胞释放相同的聚合物-缀合的颗粒(表5)。超过现有技术的优点是相同的颗粒和释放剂可广泛用于不同细胞类型的选择。
减少的聚合物缀合的标记的非特异性结合是本发明的重要方面。在许多生物应用中，标记的低非特异性结合对实现高灵敏度和性能是至关重要的。特别是对于纳米颗粒和微粒，抑制其非特异性结合仍然是技术挑战。非特异性结合通常依赖于颗粒的几种物理和化学性质，包括表面积、组成和电荷。在细胞分离应用中，非特异性结合减少了细胞纯度和/或回收率。在细胞的阳性选择期间，颗粒非特异性附着至不需要的细胞并降低细胞纯度。当纯化稀有细胞诸如CD34+细胞时，这种效果变得显著。在阴性选择中，当颗粒捕获所需的细胞时，非特异性结合导致细胞回收率降低。在聚合物/抗-聚合物系统中，当颗粒缀合至具有低抗污特性的聚合物(诸如PEG或葡聚糖)时，通过表面电荷的钝化和聚合物的屏蔽效应来减少其非特异性结合。减少的非特异性结合意指可以使用更宽范围的实验条件(包括颗粒浓度)，同时保持高纯度和回收率来分离细胞。因此，聚合物-缀合的颗粒的低非特异性结合特性提供了超过用于几个商业化细胞分离平台的抗体缀合的颗粒的重要优点。
本发明的新颖性是相同聚合物可用于标记钝化、用于特异性靶向并用于特异性释放。PEG，例如，已被广泛应用于钝化颗粒、标记、蛋白质或药物，以改善它们的生物相容性、增加溶解度并减少非特异性结合，但还没有被用作结合剂来连接标记和细胞。使用PEG缀合的标记用于特异性靶向是有利的，因为没有必要用靶向蛋白质或抗体来使标记进一步官能化。大部分可商购获得的细胞分离产品使用直接缀合至针对所需细胞类型的初级抗体的磁性颗粒。这些抗体缀合的微粒有效用于细胞分离，但标记是不可逆的并且每种细胞类型需要独特的颗粒。与此相反，使用聚合物/抗聚合物系统(诸如PEG/抗PEG)能够使相同颗粒与配体(抗体)结合使用用于许多不同细胞类型的分离。
聚合物/抗聚合物系统的另一个优点是可逆标记是特异性的。例如，使用磁性细胞分离，聚合物缀合的颗粒的去除对于经由聚合物/抗聚合物连接而连接至细胞的那些是特异性的(图5、图8和图25)。这与通过非特异性方法(诸如通过电荷或疏水相互作用或非特异性受体介导的内吞作用)结合至细胞的颗粒相反。尽管PEG缀合的颗粒与抗体缀合的颗粒相比通常已经降低了非特异性结合，但非特异性结合不可能完全避免。当颗粒通过游离的聚合物竞争以特异性方式从细胞去除时，这种影响可以导致细胞分离期间的纯度提高。由于非特异性结合至不需要的细胞的颗粒未被释放，这些不想要的细胞在最终磁性洗涤期间被消除以去除颗粒。应用物理的、还原的或酶促方法以无差别的方式去除颗粒是对现有方法的改进。本发明的特异性颗粒去除之后纯度的提高特别适于对非常罕见的细胞类型的分离，并且当采用连续分离时是有利的。
本文所述的方法和组合物的新颖性在于多个可逆的聚合物系统可以组合用于正交标记。在细胞分离中，正交标记与可去除颗粒的组合使用促进多种细胞类型通过多次连续选择从相同样品或细胞亚群的分离(图29和图30)。本发明的新的分离策略的实例涉及调节性T细胞(Tregs)，但也存在许多不同的兼容细胞类型和细胞亚群。在Tregs的情况下，它们的特征在于其CD4+CD25+的表达。可以几种不同的方式将PEG和葡聚糖聚合物系统组合以分离Treg细胞，所述方式包括CD4阴性选择然后CD25阳性选择(图31)或初始CD25阳性选择然后CD4阴性选择(图33)。使用第三正交标记系统或用聚合物/抗聚合物系统的另一轮标记可以进一步分离CD127低Treg细胞的亚群(图32和图34)。可逆的聚合标记系统使得使用比现有技术显著更简单且更简短的方法进行这些复杂细胞类型的分离具有可能性，同时在细胞纯度、回收率和活力方面提供更高的性能。总体而言，本发明的组合物和方法为以快速、高性能和无颗粒形式分离细胞和细胞亚群提供了广泛的技术。
本发明的聚合物/抗聚合物系统也可用于可逆荧光标记和与生物分子靶向、检测或纯化相关的许多其它应用。例如，PEG缀合的荧光量子点纳米颗粒可与TAC和游离的可溶性PEG结合使用，以可逆地标记活细胞中的细胞表面受体(图22)或类似地，PEG化的抗体可与荧光标记的抗PEG抗体结合使用以可逆地标记活细胞中的细胞表面受体(图23和图24)。
总之，现有技术告诉我们，对于细胞分离应用，需要高亲和力的结合剂来连接细胞和颗粒，而这些很难通过使用相同的试剂直接竞争来扭转。分离细胞的一部分挑战是难以将它们维持在活力的天然状态。这与分子和蛋白质分离相反，其中分离条件远远不那么严格。这就是为什么用于细胞分离的早期释放方法依赖于长温育时间、pH或温度变化、加入盐和还原剂或去除颗粒的剪切力。这些方法是不方便的并且有时对细胞有害，因此然后引入基于颗粒-细胞连接的酶促裂解的特异性释放方法(例如，美国专利号5,081,030)。最近，重组蛋白质技术的进展使得使蛋白质和抗体工程化具有可能，以生成低亲和力的结合剂，该结合剂与抗体亲抗原性增强的交联剂结合，允许有效细胞标记、分离和随后通过与相同或更高亲合力试剂竞争以去除颗粒(例如，美国专利号7,776,562和美国专利应用2008/0255004)。
在本公开的方法和组合物的新的和意外的发现是，通过使用温和的生理条件与相同或相似亲和力的释放剂竞争，高亲和力的结合剂是迅速可逆的。这些新的方法和组合物具有优于现有技术的许多优点。高亲和力结合剂的使用优于低亲和力结合剂，因为不需要另外的交联剂。结果是需要较低浓度的标记试剂的更简单的方法，并因此细胞被保持在更具活力的状态。当高亲和力结合剂是聚合物和抗-聚合物配体时，优点是使用相同或相似的聚合物用于结合剂和释放剂，因为所述试剂是简单的、稳定的和廉价的。使用聚合物作为释放剂有助于高亲和力配体的释放，因为多价释放剂产生显著高于绝对浓度的有效浓度。这种效应使得在生理条件下从细胞非常迅速和有效地去除颗粒。主要优点还在于，这些方法和组合物被普及到不同类型的聚合物，并因此有可能用于正交标记、分离和多种细胞类型或亚群的颗粒释放。当本发明的聚合物具有防污性质时，相当的优点是它们缀合至标记和配体减少非特异性结合，从而提高了细胞分离性能。
组合物
本公开还包括用于实施本文所述方法的组合物或试剂盒。
因此，本发明提供用于分离生物靶标和标记的组合物，其包含：
1)使所述生物靶标与所述标记结合的连接系统，其中所述连接系统包含第一聚合物和与所述第一聚合物结合的配体；和
2)可将所述生物靶标与所述标记分离的第二聚合物。
在一个实施方案中，本发明还提供一种用于将生物靶标和与第一聚合物缀合的标记分离的组合物，其包含：
1)用于使生物靶标与标记结合的连接系统，所述连接系统包含与所述生物靶标结合的配体，所述生物靶标连接至与连接至所述标记的聚合物结合的配体；和
2)用于分离所述生物靶标与所述标记的第二聚合物。
在另一个实施方案中，本发明还提供一种用于将生物靶标和与结合到第一聚合物的配体连接的标记分离的组合物，其包含：
1)用于使生物靶标与标记结合的连接系统，所述连接系统包含与所述生物靶标结合的配体，所述生物靶标连接至与结合至所述标记的配体结合的第一聚合物，和
2)用于分离所述生物靶标与所述标记的第二聚合物。
所述组合物(例如标记、配体、聚合物和靶标)的组分可以选自用于所述方法的如上所述的组分。
上述组合物连同其用于本文所述方法的说明书可制备成商业试剂盒。所述试剂盒可以根据生物靶标的性质进行定制。用于细胞分离方法，所述试剂盒可包括用于消除不想要的细胞和/或富集想要的细胞的抗体组合。可将结合至细胞的抗体连接至抗-聚合物抗体，优选在如上所述的四聚体抗体复合物(TAC)中。细胞分离试剂盒还包含合适的标记，诸如连接至聚合物或针对聚合物的抗体的磁性颗粒或珠以及用于从颗粒释放细胞靶标的第二聚合物。
因此，在一个实施方案中，本发明包括一种细胞分离试剂盒，其包括：
a)结合至从连接至结合第一聚合物的抗体的样品分离的细胞的抗体，优选TAC；
b)连接至第一聚合物的标记，优选PEG化的磁性颗粒；和
c)第二聚合物，优选PEG或Pluronic F68
在一个实施方案中，所述试剂盒包括：
a)含有抗体的TAC，所述抗体与连接至结合PEG的抗体的人CD25+细胞结合；
b)PEG缀合的磁性颗粒；和
c)由Pluronic F68组成的释放剂。
在具体的实施方案中，上述试剂盒还包括：
d)葡聚糖缀合的磁性颗粒；
e)含有与连接至结合葡聚糖的抗体的人CD127+细胞结合的抗体的TAC；和
f)含有靶向连接至结合葡聚糖的抗体的所有人类非CD4+细胞的抗体的TAC的混合物(混合物)。
所述试剂盒可包括其使用说明书，诸如实施例18或实施例19中提供的说明书。
因此，在一个实施方案中，本发明包括一种细胞分离试剂盒，其包括：
a)结合至从连接至第一聚合物的样品分离的细胞的抗体；
b)连接至结合至第一聚合物的抗体的标记，优选连接至抗PEG的磁性颗粒；和
c)第二聚合物，优选PEG或Pluronic F68
以下非限制性实施例对本发明进行阐述：
实施例1
聚合物缀合的标记的制备。根据图3A中的反应制备聚合物缀合的颗粒。简言之，用NH2(250nm直径)或SH表面官能化(1um直径)获得磁性颗粒(表2中的供应商)。用蒸馏水洗涤100mg颗粒，并重悬于4mL pH 7.2的50mM HEPES缓冲液中。为将PEG连接至250nmNH2官能化的纳米颗粒上，加入200mg的10kDA PEG NHS(RappPolymere)，并将反应温育1小时。为将PEG连接至1um SH官能化的微粒上，加入200mg的10kDA PEG-马来酰亚胺(Rapp Polymere)，并将反应温育1小时。通过用大量H20洗涤从颗粒去除过量的未反应的PEG。以对于纳米颗粒为1mg/mL和对于微粒为10mg/mL的浓度将PEG缀合的磁性颗粒储存在H20中。
按照图3A中NHS介导的反应将具有NH2表面官能化的荧光量子点纳米颗粒(Molecular Probe)缀合至聚合物。简言之，用50mM硼酸盐缓冲液pH 7.5洗涤2nmol颗粒，并以8uM的浓度重悬。为将PEG连接至量子点纳米颗粒上，以1mM终浓度向反应中加入10kDA PEGNHS(Rapp Polymere)，并温育1小时。通过用大量硼酸盐缓冲液洗涤从颗粒去除过量的未反应的PEG。将PEG缀合的量子点以8uM的浓度储存在硼酸盐缓冲液中。
根据图3B中的反应制备抗-聚合物抗体缀合的标记。用蒸馏水洗涤具有颗粒的COOH(1um直径)(表2中的供应商)表面官能化的100mg磁性微粒，并重悬于4mL pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。接着，加入100mg的EDC(Pierce)，并将反应温育20分钟。温育后，将颗粒用PBS缓冲液洗涤，并重悬于4mL。接着，向反应中加入10mg抗PEG抗体(克隆3F12-1,Life Diagnostics)或10mg抗葡聚糖抗体(克隆DX1,STEMCELL Technologies)，并将样品温育60分钟。为淬灭反应，以50mM的终浓度向反应中加入赖氨酸(Sigma)。通过用大量PBS洗涤从过量反应物中纯化抗体缀合的颗粒。将所得的抗-聚合物抗体缀合的颗粒以10mg/mL的浓度储存在PBS缓冲液中。
聚合物缀合的生物分子的制备。根据图3C中NHS介导的反应将聚合物-缀合的生物分子(包括抗体、蛋白质、肽、DNA等)缀合至聚合物。例如，以1mg/mL在PBS缓冲液中的浓度制备蛋白质。接着，加入5-15倍过量的10kDa PEG NHS(Rapp Polymere)以引发反应。温育1小时后，通过在膜过滤器上洗涤生物分子以截留合适分子量来去除过量的未反应的PEG。
实施例2
抗-聚合物/抗细胞四聚体抗体复合物(TAC)配体的制备。通过Lansdorp在美国专利号4,868,109中所述的方法来制备含有针对聚合物的抗体和细胞表面抗原的四聚体抗体复合物(TAC)。例如，下面的方法用于制备针对PEG的TAC和CD3细胞表面抗原。通过依次混合15ug抗-PEG抗体(克隆CH2074,Silverlake Research)、15ug抗CD3(克隆UCHT-1,STEMCELL Technologies)和20.3ug P9F(ab’)片段(STEMCELL Technologies)来制备TAC，在37℃温育30分钟，然后在PBS中稀释至1mL。将所得的TAC储存在4℃长达2年时间。可以使用抗PEG的不同克隆或者抗PEG可以取代不同的抗-聚合物配体，包括但不限于抗葡聚糖、抗多组氨酸(pHIS)和表1中概括的那些(图20、图27和图28中的性能数据)。为靶向不同的细胞表面抗原，抗CD3抗体可以用针对所需细胞表面受体(包括但不限于CD32、CD27、CD25、CD56、CD19、CD8等)的抗体取代。
实施例3
使用聚合物/抗-聚合物系统以及本发明的方法和组合物用于将抗体可逆固定在表面的工序。使用BIAcore 3000仪器(GE Healthcare)进行通过表面等离子共振(SPR)的动力学分析。此方法描述了PEG/抗PEG系统的用途，但也可以扩展到其它聚合物和配体诸如葡聚糖/抗葡聚糖。首先，通过注射等摩尔量的100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(Sigma)和400mM N-乙基-N’-(3-二乙基-氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)(Sigma)以形成琥珀酰亚胺酯来激活羧基官能化的CM5传感器芯片(GE Healthcare)。接着，在PBS中稀释胺修饰的10kDa PEG(RappPolymere)并注射到活化的表面以共价结合于酯，导致大约100RU的PEG被固定。
为探测固定的PEG的特异性结合特性，将抗PEG(克隆CH2074,Silverlake Research)和不相关的小鼠抗CD8IgG1同种型对照稀释于pH 7.2的hepes缓冲盐水(HBS)中至500nM，并同时在空白参考表面和PEG表面上以5μL/分钟的流速注射2分钟，然后是2.5分钟的解离期，在此期间HBS流过该表面。在每个缔合和解离循环后，将表面用30秒脉冲pH1.7的甘氨酸-HCl缓冲液再生。通过减去结合于参考表面和校正本体折射率效应来处理所得传感图。为检测PEG表面和抗PEG之间相互作用的可逆性，在50nM抗PEG注射5分钟和2.5分钟解离期后注射1％Pluronic F68。使用双分子结合模型并考虑质量传递限制因素估计来自缔合和解离步骤的聚合物/抗聚合物相互作用的亲和力(KD)。典型结果在图4中描述。
实施例4
描述使用PEG化的聚苯乙烯颗粒和抗PEG配体的可逆标记测定的工序(结果示于图5)。使用实施例1中的方法将6.0um NH2官能化的聚苯乙烯颗粒(Bang’s Labs)缀合至20kDa PEG(Rapp Polymere)。接着，将0.15ug抗PEG抗体(克隆3F12-1,Life Diagnostics)加至在补充有2％胎牛血清(FBS)的0.1mL PBS缓冲液中的0.1mg PEG缀合的聚苯乙烯颗粒中。在室温下15分钟的温育期后，通过离心在PBS-FBS中洗涤颗粒。为测试相互作用的可逆性而制备样品，其中加入1％(w/v)Pluronic F685分钟，接着在PBS-FBS中洗涤。作为对照来测试结合和释放的特异性而制备另外的样品，其中第二聚合物为取代了Pluronic F68的1％w/v的5kDA葡聚糖(Pharmacosmos)，或者抗PEG取代抗葡聚糖(克隆DX1,STEMCELL Technologies)。为了检测颗粒表面上结合的抗体的量，在室温下加入0.4ug大鼠抗小鼠PE(克隆M1-14D12,eBioscience)20分钟，并通过离心去除过量的。通过流式细胞术(BD Accuri C6)来测量样品并且从PE(FL-2)道数的强度直方图的几何平均值来估计特异性结合和释放的程度。
实施例5
用于第一聚合物-缀合的磁性颗粒、抗聚合物配体和各种大小的第二聚合物进行的可逆标记测定的方法以及用于定量第二聚合物抑制和释放效力的工序。根据实施例4和几种变化方法来进行此方法。根据实施例1将0.5um磁性颗粒缀合至30kDa PEG(Laysan Bio)、40kDa葡聚糖(Life Technologies)或pHIS肽(AnaSpec)。根据供应商的说明书用AlexaFluor 488(Life Technologies)来标记抗-聚合物配体抗PEG(克隆9B5-6-25-7,Life Diagnostics)、抗葡聚糖(克隆DX1,STEMCELL Technologies)和抗pHIS(克隆J099B12,Biolegend)。以相同的抗体与颗粒质量比来完成所有抑制和释放测量。所使用的缓冲液是PBS中的2％胎牛血清(FBS)。在圆底、未处理的聚苯乙烯96孔板(Costar 3788)和EasySepTM板磁铁(STEMCELL Technologies)上处理样品。
以0.05mg颗粒和0.25ug抗体的比率使第一聚合物缀合的颗粒与抗聚合物配体一起混合在100uL的总体积中。产生从10％(w/v)开始的稀释系列的11个浓度的第二聚合物。在抑制实验中，将第二聚合物加至配体中5分钟，并将所得的复合物加至聚合物-缀合的颗粒中20分钟。在释放实验中，将聚合物-缀合的颗粒和配体温育20分钟，并随后再加入第二聚合物5分钟。在温育期后，用缓冲液对样品进行磁性洗涤，并重悬于200uL缓冲液中。
通过流式细胞术(BD Accuri C6)来测量不同样品并且从FL-1道数的强度直方图的几何平均值来估计特异性结合和释放的程度。使用不含第二聚合物的对照样品作为100％将滴定数据标准化。在x轴上进行对数转换。使用非线性回归将每个滴定曲线拟合到S形剂量-响应曲线以确定IC50值。
实施例6
按照图1中所描绘的方法使用聚合物/抗-聚合物系统和磁性颗粒来纯化人类细胞的工序。所述方法描述了PEG缀合的颗粒和含有抗PEG抗体和针对所期望的细胞表面抗原的抗体的TAC的用途(典型的结果示于图7、图8、图10和表5)。当适当的第一聚合物和抗-聚合物配体被取代时，将相同的方法应用于葡聚糖/抗葡聚糖(典型的结果示于图27和表8)或pHIS/抗pHIS系统(典型的结果示于图28和表8)。可能需要使用其它细胞类型或来源来滴定TAC和颗粒的量以获得最佳结果。此方法描述CD19+细胞的分离，但可以使用TAC中的不同抗体来分离不同的细胞类型。方法时长为～40分钟。
1.根据实施例2中的方法使用先前制备的含有抗CD19(STEMCELL Technologies)和抗PEG(Silverlake Research)的TAC。
2.用移液管吸取0.2-1mL在EasySepTM缓冲液(STEMCELLTechnologies)中浓度为1x108个细胞/mL的单核细胞悬液放入5mL试管中。将TAC以100uL/mL(1.5ug/mL抗体)的浓度加至细胞中，并在室温下温育10分钟。
3.接着，将PEG缀合的纳米颗粒(1mg/mL)或微粒(10mg/mL)以50-150uL/mL的浓度加至混合物中，并在室温下温育10分钟。对于待分离的每种细胞类型，应滴定颗粒浓度以获得最佳结果。
4.使用EasySepTM缓冲液将样品体积增加至2.5mL。将试管放入EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies)中5分钟。5分钟后，倒出上清液，而试管仍然在磁铁中。在磁力下磁性标记的细胞仍结合到管的一侧。从磁铁取出试管。
5.重复步骤4，总共4×5分钟的磁性洗涤。
6.细胞是阳性选择的，并在其表面含有颗粒。可使用所述细胞并施加原样应用于下游实验或测定中，或者可以使用本发明的方法和组合物从表面去除该颗粒。
实施例7
根据图1和图2所描绘的方法使用聚合物/抗-聚合物系统从选定的细胞去除或释放磁性颗粒的工序。所述方法描述了PEG/抗PEG的用途(典型的结果示于图7、图8、表5)。当适当的第一聚合物和抗-聚合物配体被取代并且释放聚合物是可溶性葡聚糖或pHIS时，将相同的方法应用于葡聚糖/抗葡聚糖和pHIS/抗pHIS系统(典型的结果示于图27、图28和表8)。方法时长通常为3分钟，这比其它方法更快(表3)。
1.将在其表面上含有颗粒的阳性选择的细胞(例如如实施例6中所获得的)重悬于含有合适的第二聚合物(1％Pluronic F68、PEG、葡聚糖或pHIS)的EasySepTM缓冲液中，并用移液管吸取至少5次以确保细胞充分混合。
2.在30秒至10分钟(通常为1分钟)的温育期后，将颗粒从细胞表面快速释放。为了清除游离的颗粒和非特异性结合的细胞，将管放回EasySepTM磁铁2-5分钟(通常为2分钟)。
3.小心吸取含有其表面上不含颗粒的阳性选择的细胞的上清液。含有非特异性结合的颗粒和游离的颗粒的细胞被磁力保持在管的侧面。不含颗粒的细胞准备用于分析、进一步标记、连续分离步骤或下游测定。
实施例8
另外的直接或间接标记和细胞分离的工序(典型的结果示于图10)。
1.通过抗体缀合的标记直接标记：根据标准方法将抗CD19抗体(STEMCELL Technologies)缀合至磁性微粒。然后在室温下将抗CD19颗粒用PBMC以0.5mg/mL的浓度温育10分钟，然后将样品磁性洗涤4次。
2.通过生物素/链霉亲和素的间接标记：在室温下将生物素化的抗CD19抗体(克隆HIB19,Biolegend)用PBMC以1.5ug/mL的浓度温育10分钟。接着，以0.5mg/mL的浓度加入链霉亲和素缀合的磁性颗粒(STEMCELL Technologies)并再温育10分钟。然后将样品磁性洗涤4次。
实施例9
根据图9的示意图使用PEG/抗PEG系统用于在细胞分离后调节颗粒-细胞抗体亲抗原性并使颗粒释放最大化的工序。相似的方法可以应用于优化其它第一聚合物、配体和第二聚合物的组合。首先，使用实施例2的方法制备含有抗PEG抗体和针对期望的细胞类型(CD45、CD8等)的抗体的TAC。根据实施例1制备缀合至不同大小和/或密度的PEG的颗粒。接着，使用不同的纳米颗粒或微粒，根据实施例6中的工序进行细胞分离。在此工序中，使TAC在细胞混合物中的浓度在0.01-5ug/mL发生变化，并且使颗粒浓度在很宽的范围内发生变化。在实施例6中所述的颗粒温育和磁性分离步骤后，使用Pluronic F68或不同大小的PEG使用实施例7所述的方法从细胞释放颗粒。通过评估通过计数的所选细胞的回收率(产率)、通过用荧光抗体染色和流式细胞术的其纯度以及使用以下计算的标记释放效率来确定用于细胞分离性能的最佳条件：
其中阳性1是在分离后但在颗粒释放前回收的所需细胞的数量，阴性2是在颗粒释放后在阴性级分中回收的所需细胞的数量并且阳性2是在颗粒释放后留在阳性级分中的细胞数量。图11、图12、图13、图14、图15、图17、图18和表4证明实了所述方法用于PEG/抗PEG系统的结果，突出了释放效率如何取决于相互作用的抗体亲抗原性。图27证实了所述方法适用于葡聚糖/抗葡聚糖系统时的结果。
实施例10
使用PEG/抗PEG系统用于重复的、可逆标记和细胞纯化的工序。首先，使用实施例2的方法制备含有抗PEG抗体和针对期望的细胞类型(CD25、CD8等)的抗体的TAC。接着，使用PEG缀合的纳米颗粒或微粒，根据实施例6中的工序进行细胞分离。接着，使用实施例7所述的方法从细胞释放颗粒。使用过量缓冲液洗涤分离的无颗粒的细胞并进行两轮离心。对于第二轮磁性分离和颗粒释放，在颗粒加入步骤开始重复实施例6中所述的方法，然后进行实施例7中的方法。可以根据应用使用磁性或荧光标记连同磁性纯化或荧光检测(根据实施例11的方法)的不同组合。典型的结果示于图21。
实施例11
使用PEG/抗PEG系统和PEG缀合的荧光量子点纳米颗粒说明CD3或CD45细胞的可逆荧光标记的工序(典型的结果示于图22)。所选择的细胞表面受体可以通过使用适当的TAC被标记。此工序可以适于交替聚合物和配体，例如，通过使用抗葡聚糖TAC、用于检测的荧光标记的葡聚糖和游离的可溶性葡聚糖来去除标记。方法时长为～30分钟。
1.根据实施例2中的方法制备含有抗CD3(STEMCELL Technologies)或抗CD45(STEMCELL Technologies)和抗PEG(Silverlake Research)的四聚体抗体复合物。
2.用移液管吸取0.2-1mL在EasySepTM缓冲液(STEMCELLTechnologies)或PBS缓冲液中浓度为1x108个细胞/mL的单核细胞悬液放入5mL试管中。向细胞中以100uL/mL的浓度加入所需TAC(CD3或CD45)，并在室温下温育10分钟。温育后，用新鲜缓冲液将试管充填到顶并离心细胞以洗去未结合的TAC。将细胞沉淀重悬于少量(～100uL)的PBS缓冲液中。
3.接着，将PEG缀合的量子点纳米颗粒以5-50nM的浓度加至细胞混合物中，并在室温下温育10分钟。在温育后，用新鲜缓冲液将试管充填到顶并离心细胞以洗去未结合的量子点。将细胞沉淀重悬于少量(～100uL)的PBS缓冲液中。
4.细胞准备用于荧光检测、定量或成像。
5.为从细胞表面去除荧光纳米颗粒，加入第二聚合物(PluronicF68)至1％的终浓度。温育30秒至10分钟，然后通过离心沉淀细胞以洗去释放的颗粒。推荐通过离心洗涤两轮以洗去溶液中的游离颗粒。
实施例12
根据图2的方法使用PEG化的抗体和荧光标记的抗PEG来说明CD3或CD45细胞的可逆荧光标记的工序(典型的结果示于图23和图24)。
1.根据实施例1中的方法制备所选的PEG化的抗体诸如抗CD3(STEMCELL Technologies)或抗CD45(STEMCELL Technologies)。
2.根据实施例1中的方法制备缀合至抗PEG抗体配体的荧光标记(合适的克隆和供应商于表1中)。
3.用移液管吸取0.2-1mL在EasySepTM缓冲液(STEMCELLTechnologies)或PBS缓冲液中浓度为0.5-1x108个细胞/mL的单核细胞悬液放入5mL试管中。向细胞中以0.5-5ug/mL的浓度加入所需PEG化的抗体(CD3或CD45)，并在室温下温育15分钟。温育后，直接进行下一步骤或用新鲜缓冲液将试管充填到顶并离心细胞以洗去未结合的抗体。以初始细胞体积使细胞沉淀重悬。
4.接着，将荧光标记的抗PEG抗体以0.5-5ug/mL的浓度加至细胞混合物中，并在室温下温育10分钟。温育后，通过离心清洗并以初始细胞体积使细胞沉淀重悬。
5.细胞准备用于荧光检测、定量或成像。
6.为从细胞表面去除荧光标记，加入第二聚合物(Pluronic F68或PEG)至1％的终浓度。温育5秒至10分钟，然后通过离心洗涤细胞以去除释放的标记。
实施例13
根据图2的方法使用PEG化的抗体和抗PEG缀合的磁性颗粒用于CD3细胞的细胞分离和可逆标记的工序(典型的结果示于图25)。
1.根据实施例1中的方法制备所选的PEG化的抗体诸如抗CD3(STEMCELL Technologies)。
2.根据实施例1中的方法制备缀合至抗PEG抗体配体的磁性颗粒(合适的克隆和供应商于表1中)。
3.用移液管吸取0.2-1mL在EasySepTM缓冲液(STEMCELLTechnologies)或PBS缓冲液中浓度为1x108个细胞/mL的单核细胞悬液放入5mL试管中。向细胞中以0.5-5ug/mL的浓度加入PEG化的抗体，并在室温下温育15分钟。
4.接着，将抗PEG缀合的颗粒(10mg/mL储备溶液)以100uL/mL的浓度加至细胞混合物中，并在室温下温育10-20分钟。对于待分离的每种细胞类型，应滴定颗粒浓度和温育时间以获得最佳结果。
5.使用EasySepTM缓冲液将样品体积增加至2.5mL。将试管放入EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies)中5分钟。5分钟后，倒出上清液，而试管仍然在磁铁中。在磁力下磁性标记的细胞仍结合到管的一侧。从磁铁取出试管。
6.重复步骤5，总共4×5分钟磁性洗涤。
7.细胞是阳性选择的，并在其表面含有颗粒。
8.使用实施例7中的过程从细胞表面释放磁性颗粒标记。
实施例14
使用PEG和葡聚糖聚合物和配体的组合描述从相同样品中选择两种不同的细胞类型(CD3和CD19)的工序(典型的结果示于图29)。方法时长为～60分钟。
1.根据实施例2中的方法制备含有抗CD3(STEMCELLTechnologies)和抗PEG(Silverlake Research)的四聚体抗体复合物。同样地，制备含有抗CD19(STEMCELL Technologies)和抗葡聚糖(STEMCELL Technologies)的TAC。
2.用移液管吸取0.2-1mL在EasySepTM缓冲液(STEMCELLTechnologies)中浓度为1x108个细胞/mL的单核细胞悬液放入5mL试管中。向细胞中以100uL/mL的浓度加入每种含有TAC的CD3和CD19，并在室温下温育10分钟。由于PEG、葡聚糖和它们的配体是正交的，CD3+和CD19+细胞可以在同一步骤中同时被标记。
3.接着，向混合物中以50uL/mL的浓度加入葡聚糖缀合的纳米颗粒(STEMCELL Technologies)，并在室温下温育10分钟。
4.使用EasySepTM缓冲液将样品体积增加至2mL。将试管放入EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies)中5分钟。使用EasySepTM缓冲液和实施例6中的洗涤方法进行总共4×5分钟的磁性洗涤，同时保留第一次磁性洗涤的上清液。选定的CD19+细胞准备使用。
5.接着，向步骤4中保留的上清液(阴性级分)中加入PEG缀合的纳米颗粒至终浓度为50uL/mL，并在室温下温育10分钟。
6.使用EasySepTM缓冲液将样品体积增加至2mL。将试管放入EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies)中5分钟。使用EasySepTM缓冲液和实施例6中的洗涤方法进行总共3×5分钟的磁性洗涤。选定的CD3+细胞准备使用。
实施例15
使用PEG和葡聚糖聚合物和配体的组合连同两次阳性选择策略描述选择记忆B细胞亚群(CD19+CD27+)的工序(典型的结果示于图30)。方法时长为～60分钟。
1.根据实施例2中的方法制备含有抗CD19(STEMCELLTechnologies)和抗PEG(Silverlake Research)的四聚体抗体复合物。同样地，制备含有抗CD27(STEMCELL Technologies)和抗葡聚糖(STEMCELL Technologies)的TAC。
2.用移液管吸取0.2-1mL在EasySepTM缓冲液(STEMCELLTechnologies)中浓度为1x108个细胞/mL的单核细胞悬液放入5mL试管中。向细胞中以100uL/mL的浓度加入每种含有TAC的CD27和CD19，并在室温下温育10分钟。
3.接着，加入PEG缀合的纳米颗粒至终浓度为50uL/mL，并在室温下温育10分钟。
4.使用EasySepTM缓冲液将样品体积增加至2mL。将试管放入EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies)中5分钟。使用EasySepTM缓冲液和实施例6中的洗涤方法进行总共4×5分钟的磁性洗涤。
5.根据实施例7中的方法从选定的CD19+细胞中释放PEG缀合的颗粒。
6.将无颗粒的CD19+细胞重悬于新的试管中并加入葡聚糖缀合的纳米颗粒(STEMCELL Technologies)至终浓度为50uL/mL，并在室温下温育10分钟。
7.使用EasySepTM缓冲液将样品体积增加至2mL。将试管放入EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies)中5分钟。使用EasySepTM缓冲液和实施例6中的洗涤方法进行总共3×5分钟的磁性洗涤。
8.选定的CD19+/CD27+细胞准备使用。
实施例16
使用PEG和葡聚糖聚合物和配体连同双重阴性/阳性选择策略描述选择调节性T细胞(Treg)(CD4+CD25+的工序(方法和典型的结果示于图31)。方法时长为～60分钟。
1.根据实施例2中的方案制备含有抗CD25(STEMCELLTechnologies)和抗PEG(Silverlake Research)的四聚体抗体复合物。获得含有葡聚糖TAC和针对非CD4细胞的抗体(STEMCELLTechnologies)的CD4富集混合物。
2.用移液管吸取0.2-1mL在EasySepTM缓冲液(STEMCELLTechnologies)中浓度为1x108个细胞/mL的单核细胞悬液放入5mL试管中。向细胞中以100uL/mL的浓度加入每种CD25TAC和CD4富集混合物，并在室温下温育15分钟。
3.接着，加入葡聚糖缀合的微粒(STEMCELL Technologies)至终浓度为150uL/mL，并在室温下温育10分钟。
4.使用EasySepTM缓冲液将样品体积增加至2mL。将试管放入EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies)中5分钟。小心吸取含有CD4+富集的细胞的上清液，并将其转移到新的试管中。
5.接着，加入PEG缀合的纳米颗粒至终浓度为50uL/mL，并在室温下温育10分钟。
6.如果需要，使用EasySepTM缓冲液将样品体积增加至2mL。将试管放入EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies)中5分钟。使用EasySepTM缓冲液和实施例6中的洗涤方法进行总共3×5分钟的磁性洗涤。
7.使用实施例7中的方法从选定的CD4+CD25+细胞中释放PEG缀合的颗粒。
8.选定的CD4+/CD25+Treg细胞准备使用。
实施例17
使用PEG和葡聚糖聚合物和配体连同三重阴性/阳性/阴性选择策略描述选择调节性T细胞(Tregs)(CD4+CD127低CD25+)的亚群的工序(方法示于图32)。方法时长为～80分钟。
1.根据实施例2中的方法制备含有抗CD127(STEMCELLTechnologies)和抗葡聚糖(STEMCELL Technologies)的四聚体抗体复合物。
2.根据实施例16中的方法选择CD4+/CD25+Treg细胞并将它们以1x108个细胞/mL的浓度重悬浮于EasySepTM缓冲液(STEMCELLTechnologies)中放入5mL试管中。
3.向细胞中以100uL/mL的浓度加入CD127TAC，并在室温下温育15分钟。
4.接着，加入葡聚糖缀合的微粒(STEMCELL Technologies)至终浓度为150uL/mL，并在室温下温育10分钟。
5.使用EasySepTM缓冲液将样品体积增加至2mL。将试管放入EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies)中5分钟。小心吸取含有CD4+CD127低CD25+富集的细胞的上清液，并将其转移到新的试管中。细胞不含有颗粒并准备使用。
实施例18
使用PEG和葡聚糖聚合物和配体的组合连同双重阳性/阴性选择策略描述选择调节性T细胞(Tregs)(CD4+CD25+)的工序(方法示于图33)。方法时长为～60分钟。
1.根据实施例2中的方案制备含有抗CD25(STEMCELLTechnologies)和抗PEG(Silverlake Research)的四聚体抗体复合物。
2.用移液管吸取0.2-1mL在EasySepTM缓冲液(STEMCELLTechnologies)中浓度为1x108个细胞/mL的单核细胞悬液放入5mL试管中。向细胞中以100uL/mL的浓度加入CD25TAC，并在室温下温育15分钟。
3.接着，加入PEG缀合的纳米颗粒至终浓度为50uL/mL，并在室温下温育10分钟。
4.使用EasySepTM缓冲液将样品体积增加至2mL。将试管放入EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies)中5分钟。使用EasySepTM缓冲液和实施例6中的洗涤方法进行总共4×5分钟的磁性洗涤。
5.根据实施例7中的方案从选定的CD25+细胞中释放PEG缀合的颗粒。
6.将无颗粒的CD25+细胞重悬于新的试管中并加入CD4富集混合物(STEMCELL Technologies)至终浓度为100uL/mL，并在室温下温育10分钟。
7.接着，加入葡聚糖缀合的微粒(STEMCELL Technologies)至终浓度为100uL/mL，并在室温下温育5分钟。
8.使用EasySepTM缓冲液将样品体积增加至2.5mL。将试管放入EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies)中5分钟。小心吸取含有CD4+CD25+富集的细胞的上清液，并将其转移到新的试管中。细胞不含有颗粒并准备使用。
实施例19
使用PEG和葡聚糖聚合物和配体连同阳性/阴性/阴性选择策略描述选择调节性T细胞(Tregs)(CD4+CD127低CD25+)和应答者(CD4+CD25-)的工序(方法示于图34)。方法时长为～50分钟。
1.根据实施例2中的方案制备含有抗CD25(STEMCELLTechnologies)和抗PEG(Silverlake Research)的四聚体抗体复合物。
2.根据实施例2中的方法制备含有抗CD127(STEMCELLTechnologies)和抗葡聚糖(STEMCELL Technologies)的四聚体抗体复合物。
3.用移液管吸取0.2-1mL在EasySepTM缓冲液(STEMCELLTechnologies)中浓度为1x108个细胞/mL的单核细胞悬液放入5mL试管中。向细胞中以100uL/mL的浓度加入CD25TAC，并在室温下温育5分钟。
4.接着，加入PEG缀合的纳米颗粒至终浓度为150uL/mL以及CD4富集混合物(STEMCELL Technologies)至终浓度为100uL/mL，并在室温下温育5分钟。
5.使用EasySepTM缓冲液将样品体积增加至2.5mL。将试管放入EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies)中10分钟。使用EasySepTM缓冲液和实施例6中的洗涤方法进行总共1×10分钟和3×5分钟的磁性洗涤。可选的：在第一个10分钟磁性温育后，将上清液倒到新的试管中，并保留用于分离应答细胞(第10步)。
6.根据实施例7中的方案从选定的CD25+细胞中释放PEG缀合的颗粒。
7.向细胞中以100uL/mL的浓度加入CD127TAC，并在室温下温育5分钟。
8.接着，加入葡聚糖缀合的微粒(STEMCELL Technologies)至终浓度为100uL/mL，并在室温下温育5分钟。
9.使用EasySepTM缓冲液将样品体积增加至2.5mL。将试管放入EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies)中5分钟。小心吸取含有CD4+CD127低CD25+富集的细胞的上清液，并将其转移到新的试管中。细胞不含有颗粒并准备使用。
10.可选的：使用步骤5保留的上清液，加入葡聚糖缀合的微粒(STEMCELL Technologies)至终浓度为100uL/mL，并在室温下温育5分钟。将试管放入EasySepTM磁铁(STEMCELL Technologies)中5分钟。小心吸取含有CD4+CD25-T细胞的上清液，并将其转移到新的试管中。细胞不含有颗粒并准备使用。
尽管已参考目前被认为是优选的实施例对本发明进行了描述，但是应当理解，本发明不限于所公开的实施例。与此相反，本发明旨在涵盖各种修改和包括在所附权利要求的精神和范围内的等效布置。
所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独出版物、专利或专利申请具体地和单独地被指示为以引用的方式整体并入。
说明书中提到的参考文献的全部引用
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表1 α-聚合物抗体配体供应商
表2 磁性颗粒供应商
表3 可逆标记的时机
表4 第一聚合物和第二聚合物大小和释放
表5 通过PEG的细胞分离性能
表6 颗粒释放后细胞的活力
表7 不同聚合物的可逆性数据
表8 通过葡聚糖/Phis的细胞分离性能

Claims (57)

1.一种将样品中的生物靶标与标记分离的方法，其包括：
1)通过连接系统使所述生物靶标与所述标记结合，所述连接系统包含第一聚合物和与所述第一聚合物结合的配体；和
2)向所述样品中加入第二聚合物以将所述生物靶标与所述标记分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物对于所述配体具有相似的亲和力。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述连接系统包含与连接至与第一聚合物结合的配体的所述生物靶标结合的配体和与所述第一聚合物缀合的标记。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述连接系统包含与连接至第一聚合物的所述生物靶标结合的配体和与结合到所述第一聚合物的配体缀合的标记。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物基本上由均聚物区域组成。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物是亲水性的或两亲性的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物由相同或相似的单体组成。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物独立地选自PEG、PEG衍生物、聚(羧基甜菜碱)、葡聚糖、淀粉、肝素、几丁质、纤维素、肽和核酸。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物是PEG、Pluronic F68和吐温20。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第二聚合物选自由PEG、Pluronic F68和吐温20组成的组。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述第二聚合物是Pluronic F68。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述第二聚合物的浓度为至少0.10％w/v，优选至少0.25％w/v，最优选至少1.0％w/v。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物是葡聚糖。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物是多组氨酸(pHIS)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述标记选自固体载体、荧光蛋白和染料、抗体、酶、功能蛋白、肽或生长因子和放射性标签或元素标签。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述标记是选自颗粒、表面和柱的固体载体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述标记是选自纳米颗粒、微粒、微球或珠的颗粒。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述颗粒是磁性颗粒、致密颗粒或荧光颗粒。
19.根据权利要求3所述的方法，其中与所述生物靶标结合的所述配体是抗体，并且结合所述第一聚合物的所述配体是抗体，其中所述抗体连接在一起作为双特异性抗体。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述双特异性抗体是四聚体抗体复合物(TAC)。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述TAC的浓度小于5μg/ml，优选小于1.5μg/ml。
22.根据权利要求4所述的方法，其中与所述生物靶标结合的所述配体是抗体。
23.根据权利要求4或22所述的方法，其中与所述第一聚合物结合的所述配体是抗体。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述生物靶标选自细胞、细胞器、病毒、朊病毒、DNA、RNA、抗体、蛋白质、肽和小分子。
25.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述生物靶标是细胞。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物具有的分子量高于0.5kDa，优选高于5kDa。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述第二聚合物具有的分子量大于0.5kDa，优选大于5kDa，更优选大于8kDa。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述第二聚合物施用小于10分钟，优选小于5分钟，更优选小于1分钟，最优选小于30秒。
29.一种用于分离生物靶标和标记的组合物，其包含：
1)使所述生物靶标与所述标记结合的连接系统，其中所述连接系统包含第一聚合物和与所述第一聚合物结合的配体；和
2)可将所述生物靶标与所述标记分离的第二聚合物。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物对于所述配体具有相似的亲和力。
31.根据权利要求29或30所述的组合物，其中所述连接系统包含与连接至与第一聚合物结合的配体的所述生物靶标结合的配体和与所述第一聚合物缀合的标记。
32.根据权利要求29或30所述的组合物，其中所述连接系统包含与连接至第一聚合物的所述生物靶标结合的配体和与结合到所述第一聚合物的配体缀合的标记。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物基本上由均聚物区域组成。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物是亲水性的或两亲性的。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物由相同或相似的单体组成。
36.根据权利要求29至35中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物独立地选自PEG、PEG衍生物、聚(羧基甜菜碱)、葡聚糖、淀粉、肝素、几丁质、纤维素、肽和核酸。
37.根据权利要求29至35中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物是PEG、Pluronic F68和吐温20。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述第二聚合物选自由PEG、Pluronic F68和吐温20组成的组。
39.根据权利要求37所述的组合物，其中所述第二聚合物是Pluronic F68。
40.根据权利要求36至39中任一项所述的组合物，其中所述第二聚合物的浓度为至少0.10％w/v，优选至少0.25％w/v，最优选至少1.0％w/v。
41.根据权利要求36所述的组合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物是葡聚糖。
42.根据权利要求36所述的组合物，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物是多组氨酸(pHIS)。
43.根据权利要求29至42中任一项所述的组合物，其中所述标记选自固体载体、荧光蛋白和染料、抗体、酶、功能蛋白、肽或生长因子和放射性标签或元素标签。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述标记是选自颗粒、表面和柱的固体载体。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述标记是选自纳米颗粒、微粒、微球或珠的颗粒。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述颗粒是磁性颗粒、致密颗粒或荧光颗粒。
47.根据权利要求31所述的组合物，其中与所述生物靶标结合的所述配体是抗体，并且结合所述第一聚合物的所述配体是抗体，其中所述抗体连接在一起作为双特异性抗体。
48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述双特异性抗体是四聚体抗体复合物(TAC)。
49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述TAC的浓度小于5μg/ml，优选小于1.5μg/ml。
50.根据权利要求32所述的组合物，其中与所述生物靶标结合的所述配体是抗体。
51.根据权利要求32或50所述的组合物，其中与所述第一聚合物结合的所述配体是抗体。
52.根据权利要求29至51中任一项所述的组合物，其中所述生物靶标选自细胞、细胞器、病毒、朊病毒、DNA、RNA、抗体、蛋白质、肽和小分子。
53.根据权利要求29至51中任一项所述的组合物，其中所述生物靶标是细胞。
54.根据权利要求29至53中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物具有的分子量高于0.5kDa，优选高于5kDa。
55.根据权利要求29至54中任一项所述的组合物，其中所述第二聚合物具有的分子量大于0.5kDa，优选大于5kDa，更优选大于8kDa。
56.一种细胞分离试剂盒，其包括：
a)含有抗体的TAC，所述抗体与连接至结合PEG的抗体的人CD25+细胞结合；
b)PEG缀合的磁性颗粒；和
c)由Pluronic F68组成的释放剂。
57.根据权利要求56所述的试剂盒，其还包括：
d)葡聚糖缀合的磁性颗粒；
e)含有抗体的TAC，所述抗体与连接至结合葡聚糖的抗体的人CD127+细胞结合；和
f)含有抗体的TAC混合物，所述抗体靶向连接至结合葡聚糖的抗体的所有人类非CD4+细胞。
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