CN104611352A - 一种二化螟Bt蛋白受体ALP4基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了二化螟Bt蛋白受体ALP4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还公开了所述基因在二化螟对Bt杀虫蛋白抗性检测中的应用以及一种检测二化螟对Bt杀虫蛋白抗性的方法。与传统的二化螟对Bt杀虫蛋白抗性监测方法相比，本发明所提供的方法无需将田间试虫饲养至适宜虫龄后再进行生物测定以确定抗性水平，而是直接从田间采样测试，不需饲养试虫，从而减少了中间过程，节省了劳动力和资源，同时具有检测速度快，检测结果准确可靠，检测灵敏度和精度高等特点。

Description

一种二化螟Bt蛋白受体ALP4基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种新的二化螟Bt蛋白受体ALP4基因及其应用，本发明还涉及一种检测二化螟对Bt杀虫蛋白抗性的方法。

背景技术

二化螟属鳞翅目，螟蛾科，是水稻上危害最为严重的常发性害虫，国内各稻区均有分布，以长江流域及以南稻区发生较重，近年来数量呈明显上升的态势，给农业生产造成严重威胁。

苏云金芽孢杆菌Bacillus thurihgiehsis，简称Bt，属于芽孢杆菌科Bacillaceae芽孢杆菌属Bacillus，是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界中。自上世纪30年代以来，Bt即作为生物杀虫剂被广泛用于田间害虫防治，Cry1Ac、Cry2Aa均为Bt中的杀虫蛋白。

ALP(alkaline phosphatase,碱性磷酸酶)在鞘翅目、双翅目与鳞翅目昆虫中被鉴定为Bt蛋白受体。昆虫体内存在着两类碱性磷酸酶：膜结合碱性磷酸酶和可溶性碱性憐酸酶。ALP有13个重要的功能保守位点，包括3个底物结合位点、10个Zn2+和Mg2+结合位点，其中疏水膜锚定区位于C端。昆虫mALP为金属离子依赖性酶，含有N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，通过GPI锚定到中肠BBMV上与Bt蛋白特异性结合，参与蛋白对昆虫的毒杀作用。另外，ALP表达量下降与昆虫对Bt的抗性密切相关，抗性品系中ALP活性约为敏感品系的30％。

随着转Bt基因作物种植规模的逐步扩大，昆虫对Bt产生抗性的风险也日益增加。目前国内外的许多研究已证明，鳞翅目、鞘翅目和双翅目的多种昆虫经过室内汰选后可以对不同的Bt蛋白产生抗性。Bt杀虫蛋白对害虫的作用机理是研究防止抗性形成的基础，因此为了制定和实施合理的抗性治理策略，实现转Bt作物的可持续利用，研究昆虫对Bt产生抗性的机理就显得尤为重要。

二化螟对Bt杀虫蛋白的抗性检测仍局限于生物测定方法。然而，传统的生物测定方法有一些缺点：(1)灵敏度低：生物测定很难检测早期抗性或低频率抗性；(2)周期长：二化螟的Bt生物测定结果一般需要2天(48小时)以上；(3)对试虫数量要求很大：测定一个标准曲线完成一次生测至少需要约200头试虫，且对昆虫饲养的要求也很高；(4)操作麻烦且标准性不强：方法比较繁琐，操作起来比较复杂，从虫源、饲养到测定难以做到真正的标准化，尤其要求试虫的大小一致，不仅导致生测的工作量加大，而且诸多人为因素也会影响生测结果；(5)传统的方法从软件绘出的标准曲线求出的LC₅₀和LC₉₀值的重复性和精确性较低；(6)传统的生物测定方法测得的昆虫抗性水平往往具有滞后性。因此，建立一种准确、简便、快速、可靠的二化螟Bt抗性检测手段尤为迫切。

发明内容

本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种二化螟Bt蛋白受体ALP4基因，并进一步提供所述基因在检测二化螟对Bt杀虫蛋白抗性中的应用。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的二化螟Bt蛋白受体ALP4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步，本发明将ALP4基因通过构建原核表达载体获得了重组ALP4蛋白，并研究了重组ALP4蛋白与Bt杀虫蛋白的结合能力，结果发现该重组蛋白能与Bt杀虫蛋白特异性结合，从而验证了ALP4基因的功能。

在此基础上，提供了一种检测二化螟对Bt杀虫蛋白抗性的方法，它包括以下步骤：

1)二化螟总基因组DNA的提取；

2)设计特异性引物，按常规方法进行PCR扩增、纯化、测序；

3)将测序结果与所述的二化螟Bt蛋白受体ALP4基因序列进行对比，检查回收得到的DNA是否出现突变位点；

所述特异性引物为：

上游引物序列为ATGAGGTTGCGTTTATTTTTGTTAGTTG；

下游引物序列为TTCGCAGACAGTTTTGCCATCACC。

本发明的有益效果是：

1)与传统的二化螟对Bt杀虫蛋白抗性检测方法相比，本发明所提供的方法无需将田间试虫饲养至适宜虫龄后再进行测定以确定抗性水平，而是直接从田间采样测试，不需饲养试虫，从而减少了中间过程，缩短了检测周期，节省了劳动力和资源。

2)本发明具有检测速度快，检测结果准确可靠，检测灵敏度和精度高，检测所需的试虫数量少，能实现真正的标准化操作，为二化螟对Bt杀虫蛋白抗性的实时监测提供了一种新方法，进一步为二化螟虫害的有效治理提供了重要参考。

附图说明

图1是ALP4基因3'-RACE片段、5'-RACE片段和ORF(开放阅读框)片段扩增产物电泳图。图中：M1为DL2000DNAmarker；M2为DL1000DNAmarker；第1道为3'-RACE cDNA片段；第2道为5'-RACE cDNA片段；第3道为ORF片段。

图2是重组质粒pET-28a(+)-ALP4的酶切鉴定。图中：1是ALP4基因双酶切；M是DL5000Marker；2是pET-28a双酶切。

图3是重组菌株pET-28a(+)-ALP4表达产物的SDS-PAGE分析，以及重组蛋白ALP4的蛋白纯化与结合分析。图中M：26616(Fermentas)；1：CK(重组载体未诱导)；2：表达(重组载体IPTG诱导)；3：重组蛋白纯化；4：重组蛋白ALP4与Cry1Ac结合。(说明：图中ECL发光显影呈现黑色条带表示重组蛋白ALP4可与Bt蛋白结合。)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1  基因的克隆

1.按照SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit要求，设计克隆二化螟Bt蛋白受体ALP4基因全长cDNA的PCR引物：

GSP1＝5'-GCAGACAGTTTTGCCATCACCGAAGC-3'；

GSP2＝5'-TCACCACCCGAGTATTTGATGGGGCTGTT-3'。

2.二化螟中肠总RNA的提取：

二化螟敏感品系在人工饲料上室内饲养多代，未接触任何Bt制剂或蛋白。

①用于RNA提取的玻璃器皿经过去RNA酶处理(180℃，烘烤4h)；

②准备12-15头二化螟4龄幼虫，在冰上解剖取其中肠，在预冷的0.7％NaCl中漂洗干净，用滤纸将缓冲液吸干，放入玻璃匀浆器；

③加入1ml Trizol，在冰上充分匀浆后转入1.5ml离心管，室温孵育5min；

④加入200μl氯仿，剧烈震荡15sec，室温放置3min，4℃，12000rpm离心20min；

⑤小心将上清转移到另一干净离心管中，加入500μl异丙醇，上下颠倒混匀，4℃孵育15min；

⑥4℃，12000rpm离心10min，弃上清，加入800μl 70％乙醇清洗沉淀；

⑦4℃，7500rpm离心5min，用移液枪将乙醇彻底去除，干燥沉淀；

⑧加入适量去RNA酶的水，溶解沉淀；

⑨用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测RNA的纯度和浓度。

3.cDNA第一链合成

①混匀以下试剂，并瞬时离心，将反应管室温放置：

②分别向这些管中加入对应的以下试剂：

混匀试剂，瞬时离心，72℃孵育3min，然后42℃冷却2min，最后14,000rpm离心10sec。

③向5’RACE反应管中各加入1μl SMARTer IIA oligo，混匀后瞬时离心。

④室温下，按顺序混匀以下试剂：

⑤分别向5'-RACE、3'-RACE的RNA反应管中加入步骤④中的5.25μl混合物，每管体积均为10μl，使用枪轻柔地混匀试剂，瞬时离心。

⑥42℃孵育90min，70℃加热10min终止反应。

⑦用150μl EDTA缓冲液稀释第一链反应产物，-20℃保存。

4.cDNA 5'末端快速扩增—5'-RACE

根据SMARTer^TM RACE cDNA扩增试剂盒中5'-full race试剂盒说明书进行，具体方法如下：

①准备预混液用于PCR反应，每次的反应总体积是50μl，混合以下试剂：

②PCR反应体系：

PCR反应程序：

94℃预变性3min；94℃变性30s，72℃复性延伸2min，5个循环：94℃变性30s，70℃复性30s，72℃延伸2min，5个循环；94℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸10min。

扩增完成后，取PCR产物用6×核酸上样缓冲液点样，1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120V，电泳20分钟观察结果。扩增结果如图1第2道所示得到1069bp的DNA片段。

将DNA片段纯化后连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞中，筛选阳性克隆子送南京金斯瑞公司进行测序分析。

5.cDNA 3'末端快速扩增—3'-RACE

①准备预混液用于PCR反应，每次的反应总体积是50μl，混合以下试剂：

②PCR反应体系：

PCR反应程序：

94℃预变性3min；94℃变性30s，72℃复性延伸2min，5个循环：94℃变性30s，70℃复性30s，72℃延伸2min，5个循环；94℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸10min。

扩增完成后，取PCR产物用6×核酸上样缓冲液点样，1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120V，电泳20分钟观察结果。扩增结果如图1第1道所示得到532bp的DNA片段。

将DNA片段纯化后连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞中，筛选阳性克隆子送南京金斯瑞公司进行测序分析。将测序得到的核苷酸序列和步骤4所得核苷酸序列用DNAMAN软件拼接，得到二化螟Bt蛋白受体ALP4基因全长核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

6.ALP4基因开放阅读框序列的验证

根据第5步得到的二化螟ALP4基因全长核苷酸序列，设计克隆二化螟Bt蛋白受体ALP4基因编码区开放阅读框的PCR引物：

上游引物序列为5'-ATGAGGTTGCGTTTATTTTTGTTAGTTG-3'；

下游引物序列为5'-TTCGCAGACAGTTTTGCCATCACC-3'。

用ORF区上游引物和下游引物按常规方法进行PCR扩增。

扩增完成后，取PCR产物用6×核酸上样缓冲液点样，1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120V，电泳20分钟观察结果。扩增结果如图1第3道所示得到1551bp的DNA开放阅读框片段。

将DNA片段纯化后连接到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞中，筛选阳性克隆子送南京金斯瑞公司进行测序分析。将测序所得的核苷酸序列与步骤5拼接所得的核苷酸序列比对验证其正确性。与鳞翅目其它15条ALP基因序列进行比对，具有典型的鳞翅目昆虫的碱性磷酸酶基因特征。

实施例2  ALP4基因编码的蛋白作为Bt蛋白受体的验证

1.原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的诱导表达

根据二化螟ALP4基因开放阅读框功能区序列设计表达引物：

ALP4-F＝5'-TGGAATTCATGAGGTTGCGTTTATTTTTGTTAGTTG-3'，

ALP4-R＝5'-TCCTCGAGTTTCGCTTGCATGTGGTACTGCATG-3'，上游引物加入Ecor1酶切位点，下游引物加入Xho1酶切位点。用表达引物(ALP4-F，ALP4-R)进行PCR扩增，扩增所得片段连接到pMD19-T载体上。对ALP4基因和表达载体分别双酶切，结果如图2所示(Marker左侧为ALP4基因双酶切，右侧为表达载体双酶切)，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌TOP10，构建原核重组表达质粒pET-28a-ALP4。将构建好的表达载体pET-28a-ALP4热转化至BL21(DE3)感受态细胞中，涂布平板，37℃过夜培养，挑选阳性菌落，37℃培养过夜再转接到新鲜培养基中，培养至OD600nm值约为0.6，添加IPTG进行诱导，37℃培养4h。集菌后，用PBS缓冲液悬浮菌体，进行SDS-PAGE电泳鉴定。结果见图3中1和2：第1道，未加IPTG诱导的阴性对照；第2道，添加IPTG进行诱导的表达菌液，从第2道可见明显的外源表达蛋白。

2.重组蛋白ALP4的纯化

蛋白纯化按照康为世纪的包涵体蛋白纯化试剂盒说明书进行。结果见图3中3：第3道可见纯净清晰的纯蛋白条带，其分子量大小与第2道的外源表达蛋白一致。纯蛋白按照Bradford法测定蛋白浓度。

3.配体杂交实验(western blot)

①煮沸后的ALP4样品按照常规方法进行SDS-PAGE变性凝胶电泳，电泳结束后，小心取出凝胶，切除积层胶部分，用直尺量出所需转膜部分的长和宽，将分离胶浸入转膜缓冲液中平衡20min；

②预先准备6张滤纸和一张PVDF膜，其大小与凝胶吻合；

③将滤纸在转膜缓冲液中浸润后放置在平板上，三张依次叠放，用玻璃棒挤出气泡；PVDF膜先在甲醇中浸泡10s，然后在转膜缓冲液中浸润置于滤纸上，叠放整齐并挤出气泡；将平衡好的凝胶置于PVDF膜上，挤出气泡，再将另外3张滤纸浸润后依次叠放在凝胶上，挤出气泡；放上阴极电板，15V转移20min；

④转膜结束后，用含有5％脱脂奶粉的PBST在室温条件下孵育1-2小时；

⑤在室温条件下将PVDF膜转入含有Cry1Ac的PBST毒素溶液(比例1:3500)中孵育1-2小时；

⑥孵育过后用PBST漂洗PVDF膜3次，每次10min；

⑦在室温条件下将PVDF膜转入含有一抗的PBST溶液(比例1:3500)中孵育1-2小时；

⑧孵育之后用PBST漂洗PVDF膜3次，每次10min；

⑨在室温条件下，将PVDF膜转入含有二抗的PBST溶液(比例1:3500)中孵育1小时；

⑩用PBST漂洗PVDF膜3次，每次10min。

按照ECL试剂盒说明书，将膜与ECL试剂反应，在暗室中进行曝光显影。结果见图3中4：第4道，重组蛋白ALP4与Cry1Ac结合。

实施例3  ALP4基因用于二化螟对Bt杀虫蛋白抗性的检测

1.二化螟基因组DNA的提取，步骤如下：

①直接从田间采集二化螟幼虫或采用高压汞灯诱集二化螟成虫，将得到的试虫浸泡在95％的乙醇中带回实验室，随机抽取100头二化螟幼虫或成虫个体供基因频率检测；

②采用爱思进公司的AxyPrep基因组DNA小量提取试剂盒提取基因组DNA；

③取二化螟3-4龄幼虫或成虫的腹部组织30毫克于1.5ml离心管中，加入磷酸盐缓冲液350ml和0.9μl RNaseA(50mg/ml)溶液研磨均匀。收集350μl组织匀浆液于2ml离心管；

④加入150μl裂解液和20μl蛋白酶K(15mg/ml)溶液，涡漩振荡1分钟后，短暂离心，再将其置于56℃水浴10分钟；

⑤加入350μl蛋白去除液，涡漩振荡30秒，12000g离心10分钟；

⑥将DNA制备管置于另一2ml离心管中，将⑤中的上清液移至制备管中，12000g离心10分钟；

⑦弃滤液，加入500μl洗涤液，12000g离心1分钟；

⑧弃滤液，加入500μl去盐液，12000g离心1分钟；

⑨弃滤液，空管离心2分钟；

⑩将制备管放到另一洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加100μl的去离子水，12000g离心1分钟，得到基因组DNA溶液。

2.对第一步中提取的DNA模板进行特定基因片段的PCR扩增，步骤如下：

①在0.25ml PCR管中建立总体积为25μl的PCR反应体系：2.5μl 10×PCR缓冲液，2μl的10毫摩尔每升浓度脱氧核糖核苷酸，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl DNA模板，0.5μl DNA高保真酶，17.0μl去离子水，

上游引物：ATGAGGTTGCGTTTATTTTTGTTAGTTG；

下游引物：TTCGCAGACAGTTTTGCCATCACC；

②将上述反应体系进行PCR反应，反应条件为：98℃预变性5分钟后，98℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸40秒，共反应40个循环，最后72℃延伸10分钟，然后于4℃保存样品。

3.采用快速回收试剂盒对所述PCR扩增后的产物进行回收，第一次使用试剂盒前先在漂洗液WB中加入指定量的无水乙醇，回收步骤如下：

①每5μl所述PCR扩增后的产物加1μl DNA电泳缓冲液用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件：80毫伏恒压，电泳40分钟；

②在UV灯下，观察PCR扩增结果，将目的DNA条带切下，将切下的凝胶放入合适离心管，称重；

③将3倍体积溶胶结合液加入到离心管中；

④65℃孵育10分钟(或直至胶完全溶解)，每2-3分钟涡旋振荡一次促进凝胶溶解；

⑤凝胶完全溶解后，加入吸附柱中，并将吸附柱放入收集管，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，倒掉收集柱中的废液；

⑥加入700μl漂洗液，12000rpm离心30秒，弃掉收集柱中废液；

⑦加入500μl漂洗液，12000rpm离心30秒，弃掉收集柱中废液；

⑧将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量去除漂洗液；

⑨将吸附柱放入一个干净的离心管中，加50μl洗脱缓冲液于吸附膜的中间部位(洗脱缓冲液预先在65-70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟；

⑩琼脂糖凝胶电泳检测回收效果，测定胶回收PCR产物浓度。

4.将回收得到的DNA立即进行测序。

5.根据测序结果，与ALP4基因核苷酸序列比对，检查回收得到的DNA是否出现突变位点。

6.根据测序结果，对二化螟样本对Bt杀虫蛋白的抗性进行判别，如果出现氨基酸突变，就说明二化螟样本对Bt杀虫蛋白产生了抗性。

7.多次重复第一步至第六步，根据检测的二化螟样本的个数和其中出现了氨基酸突变的样本的个数，计算出二化螟样本种群的抗性频率。

如一次检测二化螟100头，其中有3头出现了突变位点，则这个二化螟种群的抗性频率为3％(3/100*100％)。如果一个种群的抗性频率大于5％，就应该考虑进行害虫抗性防治。

综上所述，本发明公开了二化螟Bt蛋白受体ALP4基因全长cDNA序列及其用途，并提供了一种检测二化螟对Bt杀虫蛋白抗性的方法。本发明为研究ALP基因家族的功能及进化提供了新的全长基因，为研究二化螟对转基因作物的抗性机制提供了新的基因材料和方法，在害虫综合防治领域具有广泛的应用前景。

Claims (3)

1.二化螟Bt蛋白受体ALP4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的二化螟Bt蛋白受体ALP4基因在检测二化螟对Bt杀虫蛋白抗性中的应用。

3.一种检测二化螟对Bt杀虫蛋白抗性的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)二化螟总基因组DNA的提取；

2)设计特异性引物，按常规方法进行PCR扩增、纯化、测序；

3)将测序结果与二化螟Bt蛋白受体ALP4基因的序列进行对比，检查回收得到的DNA是否出现突变位点，所述二化螟Bt蛋白受体ALP4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，

所述特异性引物为：

上游引物序列为ATGAGGTTGCGTTTATTTTTGTTAGTTG；

下游引物序列为TTCGCAGACAGTTTTGCCATCACC。