CN104586882A - 亚硒酸钠在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了亚硒酸钠在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用，选用基本无毒性的药物浓度进行抗病毒实验，发现亚硒酸钠通过影响HBV RNA的转录，从而降低HBsAg和HbeAg的分泌，抑制HBV的复制。因此，通过单独使用或者与其他抗HBV药物联合使用，亚硒酸钠能够在预防或者治疗乙型肝炎病毒感染药物过程中发挥重要作用。

Description

亚硒酸钠在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及亚硒酸钠在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(英文缩写为HBV)感染及其相关疾病是一个世界性的公共健康问题，全球超过30％的人，大约20亿，都感染过HBV，而其中慢性感染和携带者超过3.5亿，这些乙肝患者也更容易进一步发展为肝硬化、肝纤维化乃至肝癌，每年全球约有80万人因此丧命。中国目前的乙肝感染情况十分严重，大约有6亿人次曾经感染过乙型肝炎病毒，约有1.3亿病毒携带者以及3千万乙肝病人。为了控制乙肝疫情的发展，目前主要从预防和治疗两个方面着手，由于疫苗的大规模接种，预防手段得到大大加强，有效降低了未成年人患病的可能，但对于已经成为慢性化乙肝患者的庞大人群还需要积极进行各种治疗。

目前对乙肝治疗的主要药物分为两大类，一类是免疫调节剂，如干扰素α，这类药物疗程短，通常为6个月到1年，疗效显著，但是应答率低，通常在20％左右，且由于遗传背景等因素使得其在亚洲病人体内应答率更低，另外较强的副作用和昂贵的价格也限制了它的临床使用。另一类药物是核苷/核苷酸类似物，如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦等，这类药物专门针对病毒的聚合酶，通过抑制病毒的复制来控制病情，因此毒性较小，但对于细胞核内的病毒基因组——共价闭合环状DNA(cccDNA)——无法去除，需要长期用药，这也产生了抗药性和停药反弹等问题。寻找新靶点药物已经成为乙肝治疗迫在眉睫的挑战。

硒作为人体必需的一种微量元素，已被证实具有多种生理功能，如抗氧化，抗炎及抗肿瘤等，因此多被作为一种保健品或营养强化剂使用，能够提高免疫力，排除体内有毒、有害物质，修复损伤。但硒对于乙肝病毒的抑制作用还没有任何报道，更缺乏实验证据。亚硒酸钠是硒存在于自然界中的一种无机形式，获得容易，成本低，已在实验和临床中作为硒的补充剂被广泛使用，本申请利用亚硒酸钠对肝癌细胞系中的乙肝病毒进行控制，发现其可以显著降低乙肝病毒相关抗原分泌，并抑制乙肝病毒在细胞内的转录和复制，表明该药在乙肝治疗方面具有极大的临床应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了亚硒酸钠在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用，亚硒酸钠在细胞和分子水平对乙肝病毒具有抑制作用，因此可进一步开发为治疗或预防乙型 肝炎病毒感染的药物，具有广泛的应用前景。

亚硒酸钠(Na₂SeO₃)在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用，包括亚硒酸钠为唯一有效成分制备成抗乙型肝炎病毒药物；或与其他例如干扰素α、拉米夫定、恩替卡韦等已有抗乙肝药物进行联合用药，用于制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物；或作为唯一有效成分制备在体外抑制肝炎病毒的药物，用于实验对照。

利用现代常用药物制剂手段，可将亚硒酸钠作为活性成分制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂等任何一种药学上可接受的剂型。

本发明通过以下实验，验证了亚硒酸钠在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物的可行性：

1)亚硒酸钠对HepG2.2.15和Huh7二种细胞系的毒性检测，计算其CC50(半数致死浓度)值：结果显示在亚硒酸钠处理3天后，10μM药物浓度还未影响到HepG2.2.15细胞的生长，但当浓度进一步增加后，细胞的生长受到迅速抑制，其中亚硒酸钠对HepG2.2.15细胞生长抑制的CC50值为36.27μM。Huh7细胞对于亚硒酸钠更为敏感，在处理3天后，2.5μM药物浓度开始对细胞的生长有微量影响，当药物浓度进一步增加后，细胞的生长逐渐被抑制，其中亚硒酸钠对细胞生长抑制的CC50值为6.63μM。

2)检测亚硒酸钠对HepG2.2.15和转染了1.1×HBV质粒(或1.3×HBV质粒)Huh7的细胞上清中HBsAg和HBeAg的影响：

结果显示亚硒酸钠(Na₂SeO₃)的加入，使得HepG2.2.15细胞分泌上清中HBsAg和HBeAg的水平明显下降，并呈一定时间和浓度的依赖性；

Na₂SeO₃能够抑制1.1xHBV质粒转染的Huh7细胞分泌HBeAg，并且具有剂量和时间依赖性，Na₂SeO₃能够影响1.1xHBV质粒转染的Huh7细胞的HBsAg分泌。

Na₂SeO₃能够抑制1.3xHBV质粒转染的Huh7细胞分泌HBeAg和HBsAg。

3)利用Northern Blot检测亚硒酸钠对HepG2.2.15和转染了1.1×HBV质粒(或1.3×HBV质粒)Huh7的细胞中HBVmRNA水平的影响，结果显示Na₂SeO₃刺激能够降低HBVRNA的转录，能同时降低pgRNA、preS/S RNA和X RNA的水平。

4)检测亚硒酸钠对HepG2.2.15和转染了1.1×HBV质粒(或1.3×HBV质粒)Huh7的细胞中病毒核衣壳内DNA水平的影响，结果显示Na₂SeO₃能够抑制HepG2.2.15细胞内HBV的复制，并呈一定时间和浓度的依赖性；Na2SeO3能够抑制瞬时转染HBV质粒的Huh7细胞中HBV复制，包括1.1xHBV质粒转染的Huh7细胞和1.3xHBV质粒转染的Huh7，且呈一定时间和浓度的依赖性。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

其一，亚硒酸钠获得容易，成本低，适合低收入病人使用，易于推广；

其二，；亚硒酸钠能从转录水平降低乙肝病毒各种mRNA表达，这不同于目前已知的任何其它药物，由于病毒DNA是从pgRNA反转录合成而来，且这几种转录本翻译病毒蛋白，从RNA水平抑制病毒能提升药物效果；

其三，因为作用机理不同，亚硒酸钠能与其它已有药物联合使用，以提高治愈率，改善现有化疗药物的耐药性；

其四，亚硒酸钠是一种已被应用于临床的药物，它不是一种新药，减少了新药前期漫长而复杂的临床实验，推广上更加方便。

附图说明

图1为亚硒酸钠对HepG2.2.15和Huh7二种细胞系生长的影响。

其中，图1中A为亚硒酸钠对HepG2.2.15生长影响；B为亚硒酸钠对Huh7生长影响。

图2为亚硒酸钠对细胞上清中HBsAg分泌的影响。

其中，图2中A为不同浓度下亚硒酸钠对HepG2.2.15上清中HBsAg影响；B为不同时间下亚硒酸钠对HepG2.2.15上清中HBsAg影响；C为不同浓度下亚硒酸钠对转染1.1×HBV质粒后Huh7上清中HBsAg影响；D为不同时间下亚硒酸钠对转染1.1×HBV质粒后Huh7上清中HBsAg影响；E为不同浓度下亚硒酸钠对转染1.3×HBV质粒后Huh7上清中HBsAg影响；F为不同时间下亚硒酸钠对转染1.3×HBV质粒后Huh7上清中HBsAg影响。

图3为亚硒酸钠对细胞上清中HBeAg分泌的影响。

其中，图3中A为不同浓度下亚硒酸钠对HepG2.2.15上清中HBeAg影响；B为不同时间下亚硒酸钠对HepG2.2.15上清中HBeAg影响；C为不同浓度下亚硒酸钠对转染1.1×HBV质粒后Huh7上清中HBeAg影响；D为不同时间下亚硒酸钠对转染1.1×HBV质粒后Huh7上清中HBeAg影响；E为不同浓度下亚硒酸钠对转染1.3×HBV质粒后Huh7上清中HBeAg影响；F为不同时间下亚硒酸钠对转染1.3×HBV质粒后Huh7上清中HBeAg影响。

图4为亚硒酸钠对细胞内病毒mRNA水平的影响。

其中，图4中A为不同浓度下亚硒酸钠对HepG2.2.15中HBV RNA影响；B为不同浓度、不同时间下亚硒酸钠对转染1.1×HBV质粒后Huh7中HBV RNA影响；C为不同浓度、不同时间下亚硒酸钠对转染1.3×HBV质粒后Huh7中HBV RNA影响。

图5为亚硒酸钠对细胞中病毒核衣壳内DNA水平的影响。

其中，图5中A为不同浓度下亚硒酸钠对HepG2.2.15中病毒核衣壳内DNA影响；B为不 同时间下亚硒酸钠对HepG2.2.15中病毒核衣壳内DNA影响；C为不同浓度下亚硒酸钠对转染1.1×HBV质粒后Huh7中病毒核衣壳内DNA影响；D为不同时间下亚硒酸钠对转染1.1×HBV质粒后Huh7中病毒核衣壳内DNA影响；E为不同浓度下亚硒酸钠对转染1.3×HBV质粒后Huh7中病毒核衣壳内DNA影响；F为不同时间下亚硒酸钠对转染1.3×HBV质粒后Huh7中病毒核衣壳内DNA影响。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

实施例1：

亚硒酸钠对HepG2.2.15和Huh7二种细胞系的毒性检测，过程如下：

(1)将细胞接种于96孔板中，每孔接种量为5000个细胞，培养基100μl。

(2)在接种1天后，开始加药刺激。培养基中依次加入终浓度为1μM、2.5μM、5μM、10μM、50μM、100μM、1mM、5mM和10mM的亚硒酸钠，处理时间为3天，每天换液。

(3)将(2)中处理3天的细胞弃去培养基上清，用磷酸盐缓冲液洗3次，重新加入含有体积比为10％CCK-8的新鲜培养基，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续孵育2小时，最后在吸光光度计上测450nm吸光值。

(4)重复(1)～(3)实验步骤两次，得到3组实验数据，实验数据导入GraphPad Prism 6软件，绘制曲线图并计算亚硒酸钠对两种细胞的CC50值。

结果如下：从图1A可看出，在亚硒酸钠处理3天后，10μM药物浓度还未影响到HepG2.2.15细胞的生长，但当浓度进一步增加后，细胞的生长受到迅速抑制，其中亚硒酸钠对细胞生长抑制的CC50值为36.27μM。

从图1B可看出，Huh7细胞对于亚硒酸钠更为敏感，在处理3天后，2.5μM药物浓度开始对细胞的生长有微量影响，当药物浓度进一步增加后，细胞的生长逐渐被抑制，其中亚硒酸钠对细胞生长抑制的CC50值为6.63μM。

综上，后续实验择的药物浓度最大值为2.5μM，此浓度对HepG2.2.15生长没有抑制作用，而对Huh7生长抑制率为8.2％，可认为该浓度对两种细胞生长影响有限。

实施例2：

亚硒酸钠对HepG2.2.15和转染了1.1/1.3×HBV质粒Huh7的细胞上清中HBsAg和HBeAg的影响，检测过程如下：

(1)将细胞接种于六孔板中，在HepG2.2.15接种1天后，或Huh7转染1.1×HBV质粒(或1.3×HBV质粒)(1.1×HBV质粒为pCH9/3091，由Nassal,M.于1992年构建^[1]，含有1.1倍长度的HBV基因组，并由CMV强启动子启动转录；1.3×HBV质粒由Gilad,D.和Yosef,S.在2003年构建^[2]，将1.3倍长度的HBV基因组插入pGEM-3Z质粒所得，无外源启动子。)1天后，开始加药刺激。培养基中依次加入终浓度为0.5μM、1.5μM、2.0μM和2.5μM亚硒酸钠，以及作为对照的终浓度为30nM的ETV，处理时间为3天，每天换液，收3天后细胞上清于-20℃待用。

(2)将步骤(1)中相同条件细胞的培养基中加入终浓度为2.5μM亚硒酸钠，以及作为对照的终浓度为30nM的ETV处理4天，每天换液并收集各天细胞上清于-20℃待用。

(3)将(1)和(2)中所收的细胞上清解冻后，10000g离心5分钟，随后将上清于37℃温箱中预热30分钟。

(4)每个样品取出500μl使用上海科华HBsAg酶联免疫试剂盒检测上清中乙肝表面抗原HBsAg含量，检测过程严格按照产品说明书进行。

(5)每个样品取出200μl使用上海科华HBeAg酶联免疫试剂盒检测上清中乙肝e抗原HBeAg含量，检测过程严格按照产品说明书进行。

(6)重复(1)～(5)实验步骤两次，得到3组实验数据，实验数据导入GraphPad Prism 6软件，绘制柱状图并计算p值，以确认用药组与未用药组间是否存在差异。

结果如下：从图2A中可以看到，不同浓度的亚硒酸钠(Na₂SeO₃)刺激3天后，HepG2.2.15细胞分泌上清中HBsAg的水平明显下降，HBsAg的下降水平随着Na₂SeO₃浓度增加而增加。其中2.5μMNa₂SeO₃刺激3天后，上清中HBsAg抗原水平只有对照组的约40％。从图2B中可以看出，在相同浓度Na₂SeO₃的刺激下，随着刺激时间的增加，HepG2.2.15上清中HBsAg水平依次下降，并表现出明显的时间依赖性。综上所述，Na₂SeO₃的刺激能够引起HepG2.2.15细胞HBsAg分泌的降低，并且表现出一定的时间和剂量依赖性。

从图3A中可以发现，1.5μM、2.0μM、2.5μM浓度的Na₂SeO₃刺激HepG2.2.15细胞3天后，上清中HBeAg的分泌降低，并且随着Na₂SeO₃浓度的递增，HBeAg降低的趋势增大。2.5μM Na₂SeO₃刺激3天后，上清中HBeAg的水平已降至阴性对照的50％左右。如图3B所示，2.5μM浓度的Na₂SeO₃刺激HepG2.2.15细胞1至4天后，上清中HBeAg的水平均降低，其降低程度随着刺激时间的增加而增大。综上所述，与Na₂SeO₃刺激引起HepG2.2.15细胞HBsAg变化相似，Na₂SeO₃刺激细胞后，造成上清中HBeAg分泌减少，并且表现出一定的时间和剂量依赖性。

由图2C中可以看出，Huh7细胞转染1.1xHBV质粒后，在Na₂SeO₃浓度大于2.0μM，刺激3天，其上清中HBsAg分泌水平明显降低，2.5μM时下降到对照组的51.7％，而其他浓度Na₂SeO₃的刺激并未引起HBsAg分泌的显著变化。如图2D所示，2.5μM Na₂SeO₃刺激1.1xHBV质粒转染的Huh7细胞后，不同时间均引起上清中HBsAg分泌不同程度减少，其中刺激4天后HBsAg下降最为明显，下降了58.8％。综上所述，2.5μM Na₂SeO₃能够影响1.1xHBV质粒转染的Huh7细胞的HBsAg分泌。

由图3C中可以看出，1.5μM、2.0μM、2.5μM Na₂SeO₃刺激3天后，细胞上清中HBeAg的分泌水平下降，其下降程度随着Na₂SeO₃浓度的增加而增大，其中2.5μM时下降到对照组的27.6％。从图3D中可以发现，1.1xHBV质粒转染的Huh7细胞在2.5μM Na₂SeO₃刺激下，随着刺激时间的递增，其上清中HBeAg的分泌水平依次降低，至第4天时，下降了70.3％。综上所述，1.5μM、2.0μM、2.5μM三种浓度Na₂SeO₃能够抑制1.1xHBV质粒转染的Huh7细胞分泌HBeAg，并且具有剂量和时间依赖性。

由图2E结果可知，Na₂SeO₃浓度大于2.0μM，刺激3天后，1.3xHBV质粒转染Huh7细胞的上清HBsAg分泌降低，而其他浓度的Na₂SeO₃刺激并没有影响HBsAg分泌，其中2.5μM时下降到对照组的58.2％。由图2F结果可知，2.5μM Na₂SeO₃刺激1.3xHBV质粒转染Huh7细胞，从第2天开始上清中HBsAg分泌水平下降，与阴性对照相比具有显著差异，至第4天时，下降了57.9％。综上结果可知，瞬时转染1.3xHBV质粒后的Huh7细胞，只有当Na₂SeO₃浓度大于2.0μM，刺激2天及以上时，其上清中的HBsAg水平才受到影响。

由图3E所示，可以看出1.3xHBV质粒转染Huh7细胞经2.0μM和2.5μM Na₂SeO₃刺激3天后，上清中HBeAg水平下降，并随浓度增加下降趋势增大，其中2.5μM时下降到对照组的47.5％。从图3F中可以看出，2.5μM Na₂SeO₃刺激1.3xHBV质粒转染Huh7细胞2天后，上清中HBeAg水平出现下降的情况，并且刺激时间越长，HBeAg下降越明显。综上所述，1.3xHBV质粒转染Huh7后，HBeAg分泌减少需要较高浓度Na₂SeO₃的刺激，并且刺激时间至少要2天。

实施例3：

亚硒酸钠对细胞内病毒mRNA水平的影响： 

(1)将实施例2中用于检测上清中HBsAg和HBeAg的各组细胞用PBS洗3次，随后在六孔板每孔中加入1ml的Trizol溶液，室温消化5分钟，轻微晃动后将Trizol连同细胞一起转移至新的离心管中，反复吹吸至无明显沉淀。

(2)加入1/5体积的氯仿，剧烈晃动至溶液呈乳白色，室温静置5分钟。

(3)4℃12000g离心15分钟，离心后混合液分为3层：含RNA的无色上清液、中间的基因组DNA及带颜色的下层有机相，将上清液小心转移至另一新的离心管中。

(4)加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温静置10分钟。

(5)4℃，12000g离心10分钟，此时离心管底部可见有RNA沉淀。

(6)小心弃去上清，加入1ml 70％乙醇后，上下颠倒离心管清洗沉淀。

(7)4℃12000g离心5分钟，弃去乙醇后，室温静置5分钟，加入43μl无RNase水溶解。

(8)每个样品按照如下配方：Total RNA 43μl，10xDNase Ⅰ Buffer 5μl，Recombinant DNase Ⅰ(RNase-free)2μl，RNase Inhibitor1μl，37℃反应30分钟。

(9)用50μlDEPC处理水定容至100μl后，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)颠倒混匀。室温，12000g离心5min，将上清转移至新的离心管。

(10)加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)颠倒混匀后，室温12000g离心5分钟，将上清转移至新的离心管。

(11)加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃静置过夜。

(12)4℃12000g离心10分钟，弃上清。70％乙醇洗两遍后，室温干燥。加入20μl无RNase水溶解。

(13)取20μg RNA样品加入等量的含溴化乙锭的RNA上样缓冲液，5℃处理10分钟后迅速至于冰上。

(14)按照《分子克隆实验指南》配置含18％的甲醛的1.2％的琼脂糖凝胶。RNA样品变性处理后上样电泳，105V 4℃电泳3h。

(15)电泳完成后，用DEPC处理水淋洗凝胶表面，在Northern凝胶处理液(NaOH0.4g，NaCl175g，溶解于1000ml无RNase水)中浸泡20min，之后转移至20×SSC(NaCl175g，二水合柠檬酸三钠88g，pH至7.0，溶解于1000ml无RNase水)浸泡10min。

(16)处理后的凝胶按照《分子克隆实验指南》中所述转膜到醋酸纤维膜上，经α-³²P同位素标记的HBV探针杂交后显影观察。

结果如下： 

从图4中Northern Blot结果可以看出，Na₂SeO₃刺激能够降低HBV RNA的转录，能同时降低pgRNA、preS/S RNA和X RNA的水平。其中在HepG2.2.15细胞中，2.5μM亚硒酸钠处理3天，HBV RNA水平下降了45％；在瞬转了1.1xHBV质粒的Huh7细胞中，2.5μM 亚硒酸钠处理4天，HBV RNA水平下降了63％；在瞬转了1.3xHBV质粒的Huh7细胞中，2.5μM亚硒酸钠处理4天，HBV RNA水平下降了52％；

pgRNA除了作为模板合成(—)-DNA外，还能翻译形成Pol蛋白和Core蛋白；preS RNA翻译形成LHBs，S RNA翻译产生MHBs和SHBs，这些产物是组成HBV HBsAg的组要成分。preS RNA和S RNA水平的降低，引起HBsAg合成减少，分泌到上清的HBsAg也随之下降。

X RNA转录形成HBx蛋白，X RNA转录本的下降会减少细胞内的病毒HBx蛋白合成。由此可知，HBV RNA水平的降低对HBV造成多方面的负面影响。

实施例4：

亚硒酸钠对细胞中核衣壳内病毒DNA水平的影响，包括以下步骤：

(1)将HepG2.2.15接种于10cm培养皿中，Huh7接种于6cm培养皿，在HepG2.2.15接种1天后，或Huh7转染1.1/1.3xHBV质粒1天后，开始加药刺激。培养基中依次加入终浓度为0.5μM、1.5μM、2.0μM和2.5μM亚硒酸钠，以及作为对照的终浓度为30nM的ETV，处理时间为3天，每天换液，将3天后细胞冻于-80℃待用；

(2)将步骤(1)中相同条件细胞的培养基中加入终浓度为2.5μM亚硒酸钠，以及作为对照的终浓度为30nM ETV处理4天，每天换液并收集各天细胞冻于-80℃待用；

(3)每一样品中加入细胞裂解液，10cm平皿的细胞加1ml裂解液，60mm平皿加500μl裂解液，4℃摇动裂解30分钟，裂解完成后4℃、12000g离心20分钟，将上清收集到新的预冷的1.5ml离心管中。

(4)取等量的样品，分别加入1M MgCl₂(终浓度8mM)、1μl DNase Ⅰ(70U/μl)、5μl RNase A，37℃消化1h，以清除细胞质中的杂质核酸。

(5)每一样品中加入10μl 0.5M EDTA，颠倒混匀，60℃处理10分钟。

(6)加入1/10体积的10％SDS(终浓度为1％)、20mg/ml Proteinase K(终浓度50μg/ml)，在55℃处理2小时，用于裂解病毒核衣壳。

(7)加入等体积的Tris-饱和酚，震荡混匀后12000g，离心10分钟，将上清移至一新的离心管中。

(8)加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，适量的糖原(终浓度0.1μg/μl)颠倒混匀后加入2.5倍体积的乙醇，-20℃静置过夜。

(9)4℃，12000g/min离心15分钟，去上清，沉淀用70％乙醇洗一次。

(10)室温干燥10分钟，加入20μl去离子水溶解DNA沉淀。

(11)纯化的样品加入DNA上样缓冲液后，在1％的琼脂糖凝胶中，105V电压4℃电泳3小时。注意当染色剂溴酚蓝泳动至凝胶底部即可，避免电压过高，否则产生的热量会使凝胶变形。

(12)电泳结束后，凝胶用双蒸水洗涤后用新鲜配置的水解液(100ml去离子水中添加2ml浓盐酸)处理5分钟，双蒸水洗涤；变性液(NaOH20g，NaCl87.6g，溶解于1000ml去离子水中)浸泡15分钟，处理2次，双蒸水洗涤；中和液(Tris60g，NaCl87.6g，加入约800ml去离子水溶解后，用浓HCl调节pH至7.5，定容至1000ml)浸泡15分钟，处理2次，双蒸水洗涤；20×SSC缓冲液(NaCl175g，二水合柠檬酸三钠88g，pH至7.0，溶解于1000ml去离子水)中浸泡10分钟。

(13)处理后的凝胶按照《分子克隆实验指南》中所述转膜到醋酸纤维膜上，用α-³²P同位素标记的HBV探针杂交后显影观察。

结果如下： 

从图5A可以看出，随着Na₂SeO₃浓度的升高，HepG2.2.15细胞病毒核衣壳内的HBV DNA水平逐渐降低，2.5μM Na₂SeO₃刺激3天后，HBV SS DNA已经明显减弱，RC DNA也减弱。图5B所示，用2.5μM Na₂SeO₃分别刺激HepG2.2.15细胞1至4天，从图中可以看出随着刺激时间增加，细胞内HBV复制水平依次降低。由上述结果可知，Na₂SeO₃能够抑制HepG2.2.15细胞内HBV的复制，且经2.5μM亚硒酸钠处理4天，HBV DNA水平下降了86％。

由图5C可以看出，在转染了1.1xHBV质粒的Huh7细胞内，与阴性对照相比，Na₂SeO₃处理组中HBV复制水平均有下降，且下降的趋势表现出一定剂量依赖性(图5C)。图5D所示，2.5μM Na₂SeO₃处理细胞，随着处理时间的增加，细胞内HBV复制水平依次降低。如图5E所示，在转染了1.3xHBV质粒的Huh7细胞内，2.0μM、2.5μM Na₂SeO₃刺激3天后，细胞内HBV复制水平有一定程度降低；而0.5μM、1.5μM Na₂SeO₃刺激时，HBV复制没有抑制作用；图5F所示，2.5μM Na₂SeO₃刺激1至4天，与阴性对照相比，细胞内HBV复制受到一定程度的抑制。综上所述，Na₂SeO₃能够抑制瞬时转染HBV的Huh7细胞中HBV复制，其中对1.1xHBV转染的Huh7细胞中，经2.5μM亚硒酸钠处理4天，HBV DNA水平下降了78％，而在1.3xHBV转染的Huh7细胞中，经2.5μM亚硒酸钠处理4天，HBV DNA水平下降了80％。

综上所述，本发明发现亚硒酸钠(Na₂SeO₃)能够从转录水平抑制HBV RNA的合成，进而影响到下游DNA及抗原分泌水平，因此亚硒酸钠可用于制备制备治疗或预防乙型肝炎 病毒感染药物，具备广阔的应用前景。

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[2].Doitsh G,Shaul Y.Enhancer I Predominance in Hepatitis B Virus Gene Expression[J].Molecular and cellular biology.2004,24(4):1799-808。

Claims (5)

1.亚硒酸钠在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：亚硒酸钠作为活性成分制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂、注射剂等任何一种药学上可接受的剂型。

3.根据权利要求1所述的应用，亚硒酸钠为唯一有效成分在制备治疗或预防乙型肝炎病毒感染药物中的应用。

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于：亚硒酸钠在制备同时降低HBeAg和HbsAg药物中的应用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：亚硒酸钠在制备抑制HBV RNA转录药物中的应用。