CN104585169B - 小麦种衣剂安全添加剂、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦种衣剂安全添加剂、制备方法及应用，该添加剂由γ‑聚谷氨酸(γ‑PGA)、壳寡糖和鞘氨醇单胞菌组成，以质量比计，γ‑聚谷氨酸:壳寡糖:鞘氨醇单胞菌菌液＝(1～30):(0.0001～1):(1～10)。其中，γ‑聚谷氨酸能有效防止种衣剂抑制种子萌发、降低发芽势及活力指数等副作用的发生，使小麦增产增收；壳寡糖具有诱导植物产生抗病虫害能力、抑菌以及提高杀虫剂杀虫效果等功能，还能有效防止小麦种衣剂抑制小麦生长发育、降低单株鲜重从而影响小麦抗逆性等副作用的发生；鞘氨醇单胞菌能有效防止种衣剂影响土壤微生物、破坏土壤环境等副作用的发生，起到增产作用。

Description

小麦种衣剂安全添加剂、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种小麦种衣剂安全添加剂，以及该添加剂的制备方法和应用，属于农作物种肥技术领域。

背景技术

小麦种衣剂是一类用于小麦种子包衣处理的农药性新剂，主要由成膜剂、复合肥料、杀虫剂、微量元素、杀菌剂、植物生长调节剂以及分散剂、乳化剂等助剂加工制成，可直接或经稀释后包覆在种子表面，形成具有一定强度和通透性的保护层膜。种衣剂处理以小麦种子为载体，种子表面被成膜剂粘附后，很快固化成为一层均匀的药膜，此药膜不易脱落，播种后会对种子形成一道保护屏障。种衣剂在吸水膨胀后不会马上溶解，随着种子的萌动、发芽、出苗和成长，根系逐渐吸收种衣剂中有效成分，并传送到幼苗各部位，同时对土壤中的植物病原及地下害虫起到防病杀虫的作用，表现为种子发芽率增加、幼苗健康生长、作物产量提高等。然而，小麦种衣剂中含有的杀虫剂(如吡虫啉、辛硫磷)和杀菌剂(如福美双、三唑类)等会对小麦种子及植株产生一定的毒副作用，表现在：1、抑制小麦种子萌发和出芽，降低小麦的发芽势、发芽指数和活力指数，种子只长须根、芽根小；2、抑制小麦幼苗的生长发育，降低小麦的出苗率，抑制麦苗的伸长生长；3、在营养生长和生殖生长期降低小麦的抗逆性，造成小麦减产；4、破坏土壤微生态平衡等。

目前，尚未有专门的功能性助剂用于防治小麦种衣剂的副作用，虽有研究报道采用低毒性生物型种衣剂能在一定程度上减轻其对小麦植株及环境的危害，但生物型种衣剂药效持续期较短，防虫防病作用谱窄，并且易造成土壤微生态失衡。因此，急需一种用于防治小麦种衣剂副作用的功能性助剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦种衣剂安全添加剂，避免种衣剂副作用的发生，降低其对小麦种子及植株的危害，同时增强小麦的抗逆性，达到增产增收的目的。

同时，本发明还提供一种小麦种衣剂安全添加剂的制备方法。

最后，本发明提供一种小麦种衣剂安全添加剂的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

小麦种衣剂安全添加剂，主要由γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、壳寡糖和鞘氨醇单胞菌组成，以质量比计，γ-聚谷氨酸:壳寡糖:鞘氨醇单胞菌菌液＝(1～30):(0.0001～1):(1～10)。

优选的，以质量比计，γ-聚谷氨酸:壳寡糖:鞘氨醇单胞菌菌液＝(1～2):(0.0001～0.5):1。

所述小麦种衣剂安全添加剂的pH值为4.5～7.5。

所述γ-聚谷氨酸、壳寡糖均为市售商品，其中γ-聚谷氨酸能有效防止种衣剂抑制种子萌发、降低发芽势及活力指数等副作用的发生，使小麦在一定程度上增产增收。而壳聚糖具有诱导植物产生抗病虫害能力、抑菌以及提高杀虫剂杀虫效果等功能，还能有效防止小麦种衣剂抑制小麦生长发育、降低单株鲜重从而影响小麦抗逆性等副作用的发生。

所述鞘氨醇单胞菌由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供，菌种材料如下：编号：ACCC10187，菌种名称：Sphingobium xenophagum，菌种中文名称：鞘氨醇单胞菌。

鞘氨醇单胞菌具有高代谢能力；同时，鞘氨醇单胞菌能够在广泛的环境中存在，因为它能够耐受高度贫营养和恶劣环境，有着特殊的代谢调控机制以适应多变的环境，能够高效调整自身的生长来抵抗许多不利的环境变化，如：饥饿、高温、紫外线、严寒等；能够利用的底物广泛，从多环芳烃类化合物、聚乙烯醇等高聚物到简单无机物N₂都能利用。另外，鞘氨醇单胞菌的细胞膜是用含糖醛酸的鞘脂糖代替脂多糖，而鞘脂糖一般只存在于植物细胞膜内，这种化学组成可能使它们能与植物高效地结合，可通过引起植物根部的感染的方式入侵植物体内(类似根瘤菌)；还可促进植物抵抗多种植物病原菌，比如对引起黄萎病的真菌(Verticillium dahliae)有拮抗作用；能够降解多种农药化合物，在农田土壤农药残留处理方面具有巨大的应用潜力。另外，鞘氨醇单胞菌还是小麦的一种内生固氮菌。鞘氨醇单胞菌能有效防止种衣剂影响土壤微生物、破坏土壤环境等副作用的发生，起到增产作用。

所述鞘氨醇单胞菌菌液中，鞘氨醇单胞菌的浓度为1×10⁷～4×10⁷个/ml。

所述鞘氨醇单胞菌菌液是由以下方法制备的：将鞘氨醇单胞菌单菌落接种到液体培养基中，在28～35℃下培养至OD₆₀₀为0.5～0.7，离心、洗涤后，再用无菌水悬浮，即得。

液体培养基：蛋白胨5g、NaCl 5g、蒸馏水1000mL、肉膏3g，pH为7.0。培养芽孢杆菌时加入5mg MnSO₄·H₂O。

所述离心是在4℃条件下、以8000r/min的转速离心10min。

1)按比例将壳寡糖溶液加入奈安大力士中，调节pH为4.5～7.5，灭菌，得混合液；

2)将鞘氨醇单胞菌菌液加入步骤1)所得混合液中，用灭菌后的蒸馏水定容，至体系中γ-聚谷氨酸的质量浓度为1％～30％、壳寡糖的质量浓度为0.0001％～1％、鞘氨醇单胞菌菌液所占的质量百分比为1％～10％，即得。

步骤1)中，所述壳寡糖溶液中壳寡糖的质量浓度为10％。

步骤1)中，调节pH的方法是用质量浓度为10％的醋酸或浓度为5mol/L的KOH溶液调节。

步骤2)中，所述奈安大力士是市售商品。所述奈安大力士是由河南奈安生物科技股份有限公司生产的一种肥料促进剂，其主要成分为γ-聚谷氨酸。

一种上述的小麦种衣剂安全添加剂的应用，将小麦种衣剂安全添加剂与小麦种衣剂按照体积比为1:1的比例混合后，按照小麦种衣剂与小麦种子的药种比，对小麦种子进行包衣，晾干后即可播种。

一种上述的小麦种衣剂安全添加剂的应用，按照药种比为1:200的比例，将小麦种衣剂安全添加剂对小麦种子进行包衣，晾干后即可播种。

一种上述的小麦种衣剂安全添加剂的应用，将小麦种衣剂安全添加剂兑水后对小麦进行喷施使用；每1亩小麦田使用小麦种衣剂安全添加剂250ml，兑水30kg。

本发明的有益效果：

本发明中小麦种衣剂安全添加剂能较好防治小麦种衣剂的毒副作用，如抑制种子萌发和出苗，种子只长须根不长芽或芽很小、弯曲不出土，抑制小麦生长发育，降低单株鲜重或干重，降低小麦自身抗逆性，影响土壤微生物等。

本发明中小麦种衣剂安全添加剂与种衣剂配合使用具有以下优点：有效避免种衣剂副作用的发生，降低种衣剂对小麦的危害，以利于小麦种衣剂的推广和应用；有效提高杀虫剂的杀虫效果；增强小麦抗逆性，使小麦增产增收。

附图说明

图1为试验例中小麦种衣剂安全添加剂对小麦活力指数、发芽势和发芽率的影响结果示意图；

图2为试验例中小麦种衣剂安全添加剂对麦苗生长的影响结果示意图；

图3为试验例中小麦种衣剂安全添加剂对小麦POD的影响结果示意图；

图4为试验例中小麦种衣剂安全添加剂对小麦叶绿素含量的影响结果示意图；

图5为试验例中鞘氨醇单胞菌在不同温度下存放一段时间的OD₆₀₀变化结果示意图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例的小麦种衣剂安全添加剂，主要由γ-聚谷氨酸、壳寡糖和鞘氨醇单胞菌组成，以质量比计，γ-聚谷氨酸:壳寡糖:鞘氨醇单胞菌菌液＝2:0.02:1；所述鞘氨醇单胞菌菌液中，鞘氨醇单胞菌的浓度为3×10⁷。该小麦种衣剂安全添加剂的pH值为6。

所述鞘氨醇单胞菌菌液是由以下方法制备的：将鞘氨醇单胞菌单菌落接种到20ml液体培养基中，在30℃、200r/min条件下摇菌培养至DO₆₀₀为0.6，再于8000r/min、4℃离心10min，无菌水洗涤3次，最后用5ml无菌水悬浮，即得。

其中，所述液体培养基的配方为：蛋白胨5g、NaCl 5g、蒸馏水1000mL、肉膏3g，pH为7.0。

本实施例的小麦种衣剂安全添加剂的制备方法，包括以下步骤：

1)制备质量浓度为10％的壳寡糖溶液；

2)将质量浓度为10％的壳寡糖溶液按比例加入到奈安大力士中，然后用质量浓度为10％的醋酸、5M的KOH溶液调节体系的pH为6后，高压蒸汽灭菌20min，得混合液；

3)在超净工作台中，向步骤2)所得混合液中加入鞘氨醇单胞菌菌液，然后用灭菌后的蒸馏水定容，至体系中γ-聚谷氨酸的质量浓度为2％、壳寡糖的质量浓度为0.02％、鞘氨醇单胞菌菌液所占的质量百分比为1％(所述鞘氨醇单胞菌菌液中，鞘氨醇单胞菌的浓度为3×10⁷)；最后密封保存，即得小麦种衣剂安全添加剂。

本实施例的小麦种衣剂安全添加剂的应用，将小麦种衣剂安全添加剂与小麦种衣剂按照体积比为1:1的比例混合后，按照小麦种衣剂与小麦种子的药种比(即2ml小麦种衣剂对应400g小麦种子)，对小麦种子进行包衣，晾干后即可进行播种。

实施例2

本实施例的小麦种衣剂安全添加剂，主要由γ-聚谷氨酸、壳寡糖和鞘氨醇单胞菌组成，以质量比计，γ-聚谷氨酸:壳寡糖:鞘氨醇单胞菌菌液＝2:0.02:1；所述鞘氨醇单胞菌菌液中，鞘氨醇单胞菌的浓度为4×10⁷。该小麦种衣剂安全添加剂的pH值为6。

所述鞘氨醇单胞菌菌液是由以下方法制备的：将鞘氨醇单胞菌单菌落接种到20ml液体培养基中，在28℃、200r/min条件下摇菌培养至DO₆₀₀为0.5，再于8000r/min、4℃离心10min，无菌水洗涤3次，最后用5ml无菌水悬浮，即得。

其中，所述液体培养基的配方为：蛋白胨5g、NaCl 5g、蒸馏水1000mL、肉膏3g，pH为7.0。

本实施例的小麦种衣剂安全添加剂的制备方法，包括以下步骤：

1)制备质量浓度为10％的壳寡糖溶液；

2)将质量浓度为10％的壳寡糖溶液按比例加入到奈安大力士中，然后用质量浓度为10％的醋酸、5M的KOH溶液调节体系的pH为6后，高压蒸汽灭菌20min，得混合液；

3)在超净工作台中，向步骤2)所得混合液中加入鞘氨醇单胞菌菌液，然后用灭菌后的蒸馏水定容l，使体系中γ-PGA最终质量浓度为2％，壳寡糖质量浓度为0.02％，鞘氨醇单胞菌菌液所占的质量百分比为1％(所述鞘氨醇单胞菌菌液中，鞘氨醇单胞菌的浓度为4×10⁷)；最后密封保存，即得小麦种衣剂安全添加剂。

本实施例的小麦种衣剂安全添加剂的应用，将小麦种衣剂安全添加剂与小麦种衣剂按照体积比为1:1的比例混合后，按照小麦种衣剂与小麦种子的药种比(即2ml小麦种衣剂对应400g小麦种子)，对小麦种子进行包衣，晾干后即可进行播种。

实施例3

本实施例中小麦种衣剂安全添加剂，主要由γ-聚谷氨酸、壳寡糖和鞘氨醇单胞菌组成，以质量比计，γ-聚谷氨酸:壳寡糖:鞘氨醇单胞菌菌液＝2:0.02:1；所述鞘氨醇单胞菌菌液中，鞘氨醇单胞菌的浓度为2×10⁷。该小麦种衣剂安全添加剂的pH值为6。

所述鞘氨醇单胞菌菌液是由以下方法制备的：将鞘氨醇单胞菌单菌落接种到20ml液体培养基中，在35℃、200r/min条件下摇菌培养至DO₆₀₀为0.7，再于8000r/min、4℃离心10min，无菌水洗涤3次，最后用5ml无菌水悬浮，即得。

其中，所述液体培养基的配方为：蛋白胨5g、NaCl 5g、蒸馏水1000mL、肉膏3g，pH为7.0。

本实施例的小麦种衣剂安全添加剂的制备方法，包括以下步骤：

1)制备质量浓度为10％的壳寡糖溶液；

2)将质量浓度为10％的壳寡糖溶液按比例加入到奈安大力士中，然后用质量浓度为10％的醋酸、5M的KOH溶液调节体系的pH为6后，高压蒸汽灭菌20min，得混合液；

3)在超净工作台中，向步骤2)所得混合液中加入鞘氨醇单胞菌菌液，然后用灭菌后的蒸馏水定容，使体系中γ-PGA最终质量浓度为2％，壳寡糖质量浓度为0.02％，鞘氨醇单胞菌菌液所占的质量百分比为1％(所述鞘氨醇单胞菌菌液中，鞘氨醇单胞菌的浓度为2×10⁷)；最后密封保存，即得小麦种衣剂安全添加剂。

本实施例的小麦种衣剂安全添加剂的应用，将小麦种衣剂安全添加剂与小麦种衣剂按照体积比为1:1的比例混合后，按照小麦种衣剂与小麦种子的药种比(即2ml小麦种衣剂对应400g小麦种子)，对小麦种子进行包衣，晾干后即可进行播种。

实施例4

本实施例的小麦种衣剂安全添加剂，主要由γ-聚谷氨酸、壳寡糖和鞘氨醇单胞菌组成，以质量比计，γ-聚谷氨酸:壳寡糖:鞘氨醇单胞菌菌液＝1:0.0001:1；所述鞘氨醇单胞菌菌液中，鞘氨醇单胞菌的浓度为1×10⁷。该小麦种衣剂安全添加剂的pH值为6.5。

所述鞘氨醇单胞菌菌液是由以下方法制备的：将鞘氨醇单胞菌单菌落接种到20ml液体培养基中，在35℃、200r/min条件下摇菌培养至DO₆₀₀为0.7，再于8000r/min、4℃离心10min，无菌水洗涤3次，最后用5ml无菌水悬浮，即得。

其中，所述液体培养基的配方为：蛋白胨5g、NaCl 5g、蒸馏水1000mL、肉膏3g，pH为7.0。

本实施例的小麦种衣剂安全添加剂的制备方法，包括以下步骤：

1)制备质量浓度为10％的壳寡糖溶液；

2)将质量浓度为10％的壳寡糖溶液按比例加入到奈安大力士中，然后用质量浓度为10％的醋酸、5M的KOH溶液调节体系的pH为6.5后，高压蒸汽灭菌20min，得混合液；

3)在超净工作台中，向步骤2)所得混合液中加入鞘氨醇单胞菌菌液，然后用灭菌后的蒸馏水定容，至体系中γ-PGA最终质量浓度为1％，壳寡糖质量浓度为0.0001％，鞘氨醇单胞菌菌液所占的质量百分比为1％(所述鞘氨醇单胞菌菌液中，鞘氨醇单胞菌的浓度为1×10⁷)；最后密封保存，即得小麦种衣剂安全添加剂。

本实施例的小麦种衣剂安全添加剂的应用，将小麦种衣剂安全添加剂与小麦种衣剂按照体积比为1:1的比例混合后，按照小麦种衣剂与小麦种子的药种比(即2ml小麦种衣剂对应400g小麦种子)，对小麦种子进行包衣，晾干后即可进行播种。

实施例5

本实施例的小麦种衣剂安全添加剂，主要由γ-聚谷氨酸、壳寡糖和鞘氨醇单胞菌组成，以质量比计，γ-聚谷氨酸:壳寡糖:鞘氨醇单胞菌菌液＝1:0.5:1；所述鞘氨醇单胞菌菌液中，鞘氨醇单胞菌的浓度为1×10⁷。该小麦种衣剂安全添加剂的pH值为6.5。

所述鞘氨醇单胞菌菌液是由以下方法制备的：将鞘氨醇单胞菌单菌落接种到20ml液体培养基中，在35℃、200r/min条件下摇菌培养至DO₆₀₀为0.7，再于8000r/min、4℃离心10min，无菌水洗涤3次，最后用5ml无菌水悬浮，即得。

其中，所述液体培养基的配方为：蛋白胨5g、NaCl 5g、蒸馏水1000mL、肉膏3g，pH为7.0。

本实施例的小麦种衣剂安全添加剂的制备方法，包括以下步骤：

1)制备质量浓度为10％的壳寡糖溶液；

2)将质量浓度为10％的壳寡糖溶液按比例加入到奈安大力士中，然后用质量浓度为10％的醋酸、5M的KOH溶液调节体系的pH为6.5后，高压蒸汽灭菌20min，得混合液；

3)在超净工作台中，向步骤2)所得混合液中加入鞘氨醇单胞菌菌液，然后用灭菌后的蒸馏水定容，至体系中γ-PGA最终质量浓度为1％，壳寡糖质量浓度为0.5％，鞘氨醇单胞菌菌液所占的质量百分比为1％(所述鞘氨醇单胞菌菌液中，鞘氨醇单胞菌的浓度为1×10⁷)；最后密封保存，即得小麦种衣剂安全添加剂。

本实施例的小麦种衣剂安全添加剂的应用，将小麦种衣剂安全添加剂与小麦种衣剂按照体积比为1:1的比例混合后，按照小麦种衣剂与小麦种子的药种比(即2ml小麦种衣剂对应400g小麦种子)，对小麦种子进行包衣，晾干后即可进行播种。

试验例

(1)小麦种衣剂安全添加剂对小麦活力指数、发芽势和发芽率的影响

试验方法：用4ml实施例1所得的小麦种衣剂安全添加剂和小麦种衣剂等体积复配的混合液，对400g小麦种子进行包衣，然后晾干后进行播种，即为NA-MY2的处理方法；用2ml小麦种衣剂，对400g小麦种子进行包衣，然后晾干后进行播种，即为CK-1的处理方法；不对小麦种子进行任何处理，直接播种，即为CK-2空白对照。

其中，发芽势：小麦播种后第三天的发芽个数占小麦种植总数的比率；发芽率：小麦播种后第7天的发芽个数占小麦种植总数的比率；活力指数：发芽指数*苗高；发芽指数(GI)＝∑Gt/Dt，Gt―在不同时间(7d)的发芽数，Dt―发芽日数。

试验结果见图1，图中NA-MY2：采用小麦种衣剂安全添加剂和种衣剂混合后包衣；CK-1：仅采用种衣剂包衣；CK-2：空白对照，未做任何处理。

从图1可以看出，NA-MY2处理组中小麦的活力指数、发芽势及发芽率均较CK-1、CK-2处理组高，说明小麦种衣剂安全添加剂不仅能解除种衣剂副作用的发生，还能在一定程度上提高种子活力，使其发芽整齐、出苗一致。

(2)小麦种衣剂添加剂对麦苗生长的影响

试验方法：用4ml实施例1所得的小麦种衣剂安全添加剂和小麦种衣剂等体积复配的混合液，对400g小麦种子进行包衣，然后晾干后进行播种，即为NA-MY2的处理方法；用2ml小麦种衣剂，对400g小麦种子进行包衣，然后晾干后进行播种，即为CK-1的处理方法；不对小麦种子进行任何处理，直接播种，即为CK-2空白对照。

在小麦播种20d后，对每个处理分别采用五点取样法，调查统计每个处理的总根数、次生根数、须根数，分蘖数用钢尺量取苗高，用游标卡尺量取苗基宽，用电子天平量取单株鲜重和干重，单株干重：将幼苗在70℃恒温条件下，直至恒重，然后再测定其干重。以上各个指标的数据采用Statistix9.0软件分析其差异显著性。

POD测定：分别在小麦幼苗期、越冬期、返青期、孕穗期、籽粒形成期，采用五点取样法对每个处理采样，然后按照POD的测定方法进行采样。POD具体测定方法：

1.称取小麦材料0.1g，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用5ml磷酸缓冲液提取一次，以4000rpm低温离心15min，上清液即为粗酶液，定容至10ml刻度，贮于低温下备用。

2.取2支试管，于1只中加入反应混合液3ml和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1支中加入反应混合液3ml和上述酶液1ml(如酶活性过高可稀释之)。迅速将两支试管中溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470nm处测定吸光度(OD)值，每隔10S读数一次。

3.结果计算：以每分钟OD变化值(ΔA470/gFW·min)表示酶活性大小，也可以用每min OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位(U)表示。

过氧化物酶活性(U/gFW·min)＝ΔA470×VT/W×VS×0.01×t；

式中：

ΔA470——反应时间内OD变化值；

VT——提取酶液总体积(ml)；

W——植物鲜重(g)；

Vs——测定时取用酶液体积(ml)；

t——反应时间(min)。

试验结果见下表1和图2。

表1 小麦种衣剂安全添加剂对麦苗生长的影响

注：表中同一列中带有相同字母经Statistix9.0软件分析在0.05水平上差异不显著(P>0.05)，不同字母差异显著(P<0.05)。

从表1可知，NA-MY2处理组中小麦各项生长指标均显著高于CK-1、CK-2处理组(P＜0.05)，尤其是单株干重和鲜重大幅增加，说明经小麦种衣剂安全添加剂处理的小麦茎秆粗壮、充实度高。

从图2可以看出，NA-MY2处理组中小麦的POD活性在生育期的各个阶段均高于CK-1、CK-2处理组，且CK-2处理组高于CK-1处理组，说明种衣剂对小麦幼苗的生长发育产生一定的副作用，从而降低小麦的抗逆性，而小麦种衣剂安全添加剂能在一定程度上防止这种副作用的发生，促进小麦生长，提高小麦茎秆充实度，增强防御酶活性，提高小麦的抗逆性。

(3)小麦种衣剂添加剂对小麦POD的影响

试验方法：用4ml小麦种衣剂安全添加剂和小麦种衣剂等体积复配的混合液，对400g小麦种子进行包衣，然后晾干后进行播种，即为NA-MY2的处理方法；用2ml小麦种衣剂，对400g小麦种子进行包衣，然后晾干后进行播种，即为CK-1的处理方法；不对小麦种子进行任何处理，直接播种，即为CK-2空白对照。POD测定：分别在小麦幼苗期、越冬期、返青期、孕穗期、籽粒形成期，采用五点取样法对每个处理采样，然后按照POD的测定方法进行采样。POD具体测定方法：

1.称取小麦材料0.1g，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用5ml磷酸缓冲液提取一次，以4000rpm低温离心15min，上清液即为粗酶液，定容至10ml刻度，贮于低温下备用。

2.取2支试管，于1只中加入反应混合液3ml和磷酸缓冲液1ml，作为对照，另1支中加入反应混合液3ml和上述酶液1ml(如酶活性过高可稀释之)；迅速将两支试管中溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470nm处测定吸光度(OD)值，每隔10S读数一次。

3.结果计算：以每分钟OD变化值(ΔA470/gFW·min)表示酶活性大小，也可以用每min OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位(U)表示。

过氧化物酶活性(U/gFW·min)＝ΔA470×VT/W×VS×0.01×t；

式中：

ΔA470——反应时间内OD变化值；

VT——提取酶液总体积(mL)；

W——植物鲜重(g)；

Vs——测定时取用酶液体积(mL)；

t——反应时间(min)。

试验结果见图3。

从图3可以看出，NA-MY2处理组中小麦的POD活性在生育期内总体上高于CK-1、CK-2处理组，且CK-2处理组高于CK-1处理组，说明种衣剂对小麦幼苗的生长发育产生一定的副作用，从而降低小麦的抗逆性，而小麦种衣剂安全添加剂能在一定程度上防止这种副作用的发生，促进小麦生长，提高小麦茎秆充实度，增强防御酶活性，提高小麦的抗逆性。

(4)小麦种衣剂添加剂对小麦叶绿素含量的影响

试验方法：用4ml实施例1所得小麦种衣剂安全添加剂和小麦种衣剂等体积复配的混合液，对400g小麦种子进行包衣，然后晾干后进行播种，即为NA-MY2的处理方法；用2ml小麦种衣剂，对400g小麦种子进行包衣，然后晾干后进行播种，即为CK-1的处理方法；不对小麦种子进行任何处理，直接播种，即为CK-2空白对照。

POD测定：分别在小麦幼苗期、越冬期、返青期、孕穗期、籽粒形成期，采用五点取样法对每个处理采样，然后按照POD的测定方法进行采样。叶绿素含量的具体测定方法：

1.取新鲜叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，剪碎(去掉中脉)，混匀。

2.称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml 95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白，静置3～5min。

3.取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

4.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣中无绿色为止，最后用乙醇定容至25ml，摇匀。

把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。

试验结果见图4。

从图4可以看出，NA-MY2处理组中小麦的叶绿素含量在生育期的各个阶段均高于CK-1、CK-2处理组，且CK-2处理组高于CK-1处理组，说明种衣剂对小麦幼苗的生长发育产生一定的副作用，从而降低了小麦的叶绿素含量，显著抑制了小麦叶片的叶绿素的合成，，而小麦种衣剂安全添加剂能在一定程度上防止这种副作用的发生，显著提高了叶绿素的含量，消除了这种对叶绿素合成的抑制作用。

(5)温度对鞘氨醇单胞菌浓度的影响

试验方法：鞘氨醇单胞菌单菌落接种到三个三角瓶中，每个三角瓶装有20ml液体培养基中，在30℃，200r/min下，摇菌使OD600为0.6，于8000r/min，4℃下离心10min，用无菌水洗涤3次，用8ml无菌水悬浮沉淀，再分别转移到三个灭菌后的离心管中，然后用封口膜密封，分别置于20℃、25℃、35℃恒温条件下保存。测定菌液浓度：每隔1h，2h，4h，8h，1d，2d，5d，11d，26d，52d，78d，88d，98d，120d，分别取置于20℃、25℃、35℃条件下的菌液0.5ml，分别接种到10ml液体培养基中，在30℃，200r/min下，摇菌22h，然后用分度光度计测定OD600。试验结果见图5。

从图5可以看出，鞘氨醇单胞菌在不同温度下存放一段时间仍具有较高的浓度，说明该菌种能够适应20～35℃的温度范围，且存放时间对菌液浓度影响较小，说明该菌种稳定性较强，可用于制备小麦种衣剂安全添加剂。

另外，通过向鞘氨醇单胞菌培养液中添加种衣剂农药成分(0.5％)，再摇菌培养22h，测定OD₆₀₀为0.542，说明该菌种对种衣剂具有较好的耐药性。

Claims (10)

1.小麦种衣剂安全添加剂，其特征在于：主要由γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、壳寡糖和鞘氨醇单胞菌组成，以质量比计，γ-聚谷氨酸:壳寡糖:鞘氨醇单胞菌菌液＝(1～30):(0.0001～1):(1～10)；

该小麦种衣剂安全添加剂是由以下方法制备的：

1)按比例将壳寡糖溶液加入奈安大力士中，调节pH为4.5～7.5，灭菌，得混合液；

2)将鞘氨醇单胞菌菌液加入步骤1)所得混合液中，用灭菌后的蒸馏水定容，至体系中γ-聚谷氨酸的质量浓度为1％～30％、壳寡糖的质量浓度为0.0001％～1％、鞘氨醇单胞菌菌液所占的质量百分比为1％～10％，即得。

2.根据权利要求1所述的小麦种衣剂安全添加剂，其特征在于：所述鞘氨醇单胞菌菌液中，鞘氨醇单胞菌的浓度为1×10⁷～4×10⁷个/ml。

3.根据权利要求2所述的小麦种衣剂安全添加剂，其特征在于：所述鞘氨醇单胞菌菌液是由以下方法制备的：将鞘氨醇单胞菌单菌落接种到液体培养基中，在28～35℃下培养至OD₆₀₀为0.5～0.7，离心、洗涤后，再用无菌水悬浮，即得。

4.根据权利要求3所述的小麦种衣剂安全添加剂，其特征在于：所述离心是在4℃条件下、以8000r/min的转速离心10min。

5.一种如权利要求1所述的小麦种衣剂安全添加剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)按比例将壳寡糖溶液加入奈安大力士中，调节pH为4.5～7.5，灭菌，得混合液；

2)将鞘氨醇单胞菌菌液加入步骤1)所得混合液中，用灭菌后的蒸馏水定容，至体系中γ-聚谷氨酸的质量浓度为1％～30％、壳寡糖的质量浓度为0.0001％～1％、鞘氨醇单胞菌菌液所占的质量百分比为1％～10％，即得。

6.根据权利要求5所述的小麦种衣剂安全添加剂的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述壳寡糖溶液中壳寡糖的质量浓度为10％。

7.根据权利要求5所述的小麦种衣剂安全添加剂的制备方法，其特征在于：步骤1)中，调节pH的方法是用质量浓度为10％的醋酸或浓度为5mol/L的KOH溶液调节。

8.一种如权利要求1所述的小麦种衣剂安全添加剂的应用，其特征在于：将小麦种衣剂安全添加剂与小麦种衣剂按照体积比为1:1的比例混合后，按照小麦种衣剂与小麦种子的药种比，对小麦种子进行包衣，晾干后即可播种。

9.一种如权利要求1所述的小麦种衣剂安全添加剂的应用，其特征在于：按照药种比为1:200的比例，将小麦种衣剂安全添加剂对小麦种子进行包衣，晾干后即可播种。

10.一种如权利要求1所述的小麦种衣剂安全添加剂的应用，其特征在于：将小麦种衣剂安全添加剂兑水后对小麦进行喷施使用；每1亩小麦田使用小麦种衣剂安全添加剂250ml，兑水30kg。