CN104569261A - 烟草中β-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了烟草中β-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇的检测方法。将样品进行预处理后，采用高效液相色谱-二极管阵列检测器，采用外标法定量在210nm波长下进行检测，所述将样品进行预处理的方法为：称取适量待测烟草样品的粉末，置于具密封盖的玻璃离心管中，加入适量二氯甲烷，盖紧后进行超声萃取，取上清液离心处理再经0.45μm有机膜过滤，所得滤液转移至色谱瓶以备进样分析。本发明样品的超声提取和离心处理均在同一个离心管中完成，并进一步优化了提取条件，简化了实验操作步骤，减少了提取溶剂的挥发，测定结果的稳定性和准确性得到了良好的改善。

Description

烟草中β-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇的检测方法

技术领域

本发明涉及烟草检测技术领域，更具体地，涉及烟草中β-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇的检测方法。

背景技术

类西柏烷类化合物主要存在于烟叶的角质层中，是烟草中一类重要萜类化合物。在调制和醇化过程中，类西柏烷类化合物大部分降解，可形成多种醛、酮等多种重要香气成分，其主要降解产物茄酮及其衍生物是烟草中含量最丰富的中性香味物质之一，对于改善烟草香吃味有很重要作用。β-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇（β-CBD）是烟草表面化合物中主要的类西柏烷二萜，也是烟草表面其它类西柏烷二萜形成的主要前体物。Roberts等（1962）首先从调制后的白肋烟烟叶中分离定性了β-CBD，但在烘烤后的烟叶中含量下降。chang 等（1976）证明鲜烟叶中具有相对较高含量的西柏三烯二醇，占叶鲜重的0.7%，占叶面总脂类物质的50%。

β-CBD的绝对构型为(1S,2E,4R,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇，结构如式（Ⅰ）所示。

（Ⅰ）      。

目前西柏烷二萜醇的主要分析方法有气相色谱法和液相色谱法。行业标准方法采用气相色谱-质谱联用法测定烟草及烟草制品中的西柏烷二萜醇，该方法需要将西柏烷二萜醇衍生化为可气化的成分，衍生化过程较复杂，且未反应的衍生化试剂很可能使得质谱离子源被硅烷基覆盖，导致质谱信号发生改变，对结果的准确性具有一定影响。刘清梁等在《烟叶中重要化合物测定方法的研究》中公开采用液相色谱法、以20R人身皂苷Rh2为内标对烟叶中的西柏烷二萜醇进行相对定量，但是，该方法检测结果的稳定性和准确性还有待进一步提高。

发明内容

    本发明要解决的技术问题是针对液相色谱法、以20R人身皂苷Rh2为内标对烟叶中的西柏烷二萜醇进行相对定量检测的技术不足，提供一种烟草中β-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇（β-CBD）的检测方法，采用外标法并对样品的前处理方法进行了创造性的改进，实现了简化操作步骤、减少提取溶剂挥发的问题，并保证了较好的检测稳定性和准确性。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种烟草中β-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇（β-CBD）的检测方法，将样品进行预处理后，采用高效液相色谱-二极管阵列检测器，采用外标法定量，在210nm波长下进行检测；所述将样品进行预处理的方法为：准确称取适量待测烟草样品的粉末（精确至0.0001g），置于具密封盖的玻璃离心管中，加入适量二氯甲烷，盖紧后进行超声萃取，取上清液离心处理再经0.45μm有机膜过滤，所得滤液转移至色谱瓶以备进样分析。

优选地，所述离心管的容积为10mL。

进一步地，所述准确称取适量待测样品烟末的重量为0.5g。

进一步优选地，所述待测样品烟末过40目筛。

进一步地，所述二氯甲烷的加入量为5mL。

优选地，所述超声萃取的时间为5～20min，超声功率为320W。

优选地，所述离心处理的条件为于4000r/min离心15min。

进一步地，所述高效液相色谱-紫外检测器的条件为：Waters ACQUITY 超高效液相色谱仪，PDA检测器，Waters Symmetry 4.6mm×250mm 5μm色谱柱，检测波长为210nm，柱温为室温，进样量为10μL，流动相A为水，流动相B为乙腈；梯度洗脱条件如下：

时间(min)	流量（mL/min）	%A	%B
				0	1	80	20
25	1	0	100
				30	1	0	100

优选地，所述所得滤液转移至色谱瓶以备进样分析，优选在6～12小时内完成色谱进样分析。更为优选地，在6小时内完成色谱进样分析。

本发明的有益效果是：

本发明打破现有技术以及作为本领域长期使用的标准方法的禁锢，从提取容器着手，简单易行地解决了高效液相色谱方法-紫外检测器内标法检测西柏烷二萜醇中结果不稳定、准确性不高的技术难题。

进一步地，本发明优化了样品预处理中的提取工艺，在科学确定提取容器的基础上，对提取溶剂、提取时间等细节进行了进一步改进，保证了检测结果的稳定性和准确性。

本发明超声提取和离心均在一个容器内完成，简化了实验操作步骤，减少了提取溶剂的挥发，测定结果的稳定性和准确性得到了进一步地良好的改善。

附图说明

图1烟草样品中β-CBD色谱图及标准样品色谱图。

图2样品溶液稳定性（图中，*表示含量变化大于5%）。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明。以下实施例仅为示意性实施例，并不构成对本发明的不当限定，本发明可以由发明内容限定和覆盖的多种不同方式实施。除非特别说明，本发明采用的试剂、化合物和设备为本技术领域常规试剂、化合物和设备。

实施例1

1.仪器

Waters ACQUITY 超高效液相色谱仪、PDA检测器 (美国Waters)；Waters Symmetry 4.6mm×250mm 5μm色谱柱；检测波长：210nm；柱温：室温；进样量：10μL；流动相：A：水 B：乙腈；梯度洗脱条件如表1所示：

表1 梯度洗脱条件

时间(min)	流量（ml/min）	%A	%B
				0	1	80	20
25	1	0	100
				30	1	0	100

2.试剂

二氯甲烷（分析纯，市购）；β- 2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇（纯度>99.5%，购于美国LKT Laboratories公司，但并不因此限定本发明范围）。

3.溶液配制

β-CBD标准品为10mg/支装。

β-CBD标准溶液的配制：准确称量约10mg β-CBD，置于10mL棕色容量瓶中，加入二氯甲烷溶解并稀释至刻度，该溶液为储备液。分别准确移取50μL、100μL 、200μL、400μL、600μL、800μL、1000μL 的储备液至10mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷溶液稀释至刻度，此7个标准溶液为系列标准溶液。

标准样品与烟草样品色谱图见附图1所示。

4.样品处理

本发明通过分析总结：由于二氯甲烷等溶剂的沸点低、挥发性强，锥形瓶和容量瓶在超声时，瓶与瓶塞间的空隙较大，给溶剂挥发提供了有利条件，给检测结果带来了较大的误差和不稳定性。再结合大量实验对比，本发明创造性地采用离心管（具密封盖）作为提取用容器，并在此提供部分对比试验结果如下：

样品处理方法一：参照标准《烟草及烟草制品西柏烷二萜醇的测定 气相色谱-质谱联用法》（YC/T 470-2013）的方法进行样品处理，采用的提取容器为锥形瓶。

样品处理方法二：参照现有文献《烟叶中重要化合物测定方法的研究》中刘清梁的方法进行样品处理，采用的提取容器为容量瓶。

样品处理方法三（本发明方法）：准确称取0.5g 烟末（精确至0.0001g），置于10mL玻璃离心管中，加入5mL二氯甲烷，拧紧离心管盖，超声萃取10min，取上清夜于4000r/min离心15min，然后用0.45μm有机滤膜过滤，转移至色谱瓶，进样分析。

对比试验中进一步总结发现，在实验过程中，以二氯甲烷为溶剂进行超声提取时，发现锥形瓶和容量瓶均存在因气流过大、瓶塞冲出瓶口的现象。本申请人分别采用锥形瓶、容量瓶和玻璃离心管（具密封盖）为提取容器进行了比较（以下以二氯甲烷为溶剂举例，其他溶剂的实验结果相似，不在此一一赘述。对同一种卷烟样品平行实验5次），实验结果见表2所示：

表2 不同提取容器的提取结果

由表2可见：与锥形瓶和容量瓶作为提取容器的实验结果相比较，以离心管为提取容器时，5次平行实验的RSD显著减小（<5%），充分证明了本申请人的分析结论，说明以离心管为提取容器，实验重复性更好。

如前述分析，同时经大量实验获得证明，由于以锥形瓶和容量瓶为提取容器，得到的β-CBD含量偏高，与本申请人的“由于二氯甲烷等溶剂的沸点低、挥发性强，锥形瓶和容量瓶在超声时，瓶与瓶塞间的空隙较大，给溶剂挥发提供了有利条件，给检测结果带来了较大的误差和不稳定性”相吻合。与此同时，以锥形瓶和容量瓶为提取溶剂，后续超声时还需将样品提取液转移至离心管，在转移过程中再次造成了溶剂挥发。溶剂挥发，相当于浓缩了提取液，进一步使得结果偏高。

因此，以离心管为提取容器，有以下优势：简化实验操作步骤，超声提取和离心均在一个容器完成；提高了结果的稳定性；增加了结果的可靠性。

实施例2

仪器、试剂、溶液配制、检测条件同实施例1。

样品处理方法：准确称取0.5g 烟末（精确至0.0001g），置于10mL玻璃离心管中，加入5mL提取溶剂，拧紧离心管盖，超声萃取10min，取上清夜于4000r/min离心15min，然后用0.45μm有机滤膜过滤，转移至色谱瓶，进样分析。

本实施例分别研究分析了乙腈、二氯甲烷和甲醇三种溶剂的提取效果，结果见表3所示：

表3 不同溶剂的提取结果

目标物	乙腈	二氯甲烷	甲醇
				β-CBD含量（μg/g）	134.37	181.29	167.46

结果表明，二氯甲烷的提取效果比乙腈和甲醇更好。因此，本发明确定以二氯甲烷作为提取溶剂。

实施例3

仪器、试剂、溶液配制、检测条件同实施例1。

样品处理方法：准确称取0.5g 烟末（精确至0.0001g），置于10mL玻璃离心管中，加入5mL二氯甲烷，拧紧离心管盖，超声萃取，取上清夜于4000r/min离心15min，然后用0.45μm有机滤膜过滤，转移至色谱瓶，进样分析。

本实施例对不同的超声萃取的提取时间进行了分析研究和比较实验，以下以5min、10min、15min、20min和25min的实验结果为例，如表4所示：

表4 不同提取时间的结果比较

目标物	5min	10min	15min	20min	25min
						β-CBD含量（μg/g）	180.14	180.0389	181.29	180.61	188.62

从表4可以看出，提取时间对目标物提取效率影响不大，所提取的β-CBD量在提取时间5min以后即基本趋于稳定。综合考虑提取效率，提取时间为5～20min。

实施例4

仪器、试剂、溶液配制、检测条件同实施例1。

样品处理方法：准确称取0.5g 烟末（精确至0.0001g），置于10mL玻璃离心管中，加入5mL二氯甲烷，拧紧离心管盖，超声萃取10min，取上清夜于4000r/min离心15min，然后用0.45μm有机滤膜过滤，转移至色谱瓶，进样分析。

工作曲线：

将系列标准溶液进行UPLC分析后，β-CBD色谱峰的面积与浓度进行线性回归分析，得到回归方程及其相关参数，将最低浓度的标准溶液平行测定13次，以所得测定结果标准偏差的3倍为方法的检测限，以所得测定结果标准偏差的10倍为方法的定量限。结果如表5所示。结果表明，在测试范围内，目标物响应与其浓度线性关系良好，且检测限远低于烟草中目标物的实际含量。

表5 β-CBD的回归方程、相关系数、检测限及定量限

β-CBD的含量用工作曲线进行定量。

重复性实验：

采用上述方法对某市售卷烟样品进行方法的重复性测试。日内重复性：同一天内样品平行测定5次，计算方法相对标准偏差，结果如表6所示。日间重复性：连续5天对样品进行平行测定，计算方法相对标准偏差，结果如表7所示。从表6和表7可以看出，β-CBD日内重复性测试的相对标准偏差为3.8%，5天连续测试的相对标准偏差为4.2%，重复性良好。

表6日内重复性测试

次数	β-CBD（μg/g）
		1	162.60
2	173.12
		3	176.18
4	162.98
		5	164.31
平均值	167.84
		相对标准偏差	3.8%

表7日间重复性测试

天数	β-CBD（μg/g）
		1	162.83
2	164.62
		3	177.48
4	175.78
		5	163.83
平均值	168.91
		相对标准偏差	4.2%

加标回收率实验：

对某市售卷烟样品添加三个水平的β-CBD标样，每个水平重复测定3次，计算方法的回收率和相对标准偏差，结果见表8。β-CBD回收率的结果在104.7%～107.2%之间，表明该方法回收率较高。

表8 β-CBD在烟草样品中的加标回收率

样品溶液稳定性实验：

为了考察样品溶液的稳定性，在制备得到的样品溶液放置0h、6h、12h、18h、24h时分别进行测试，结果如附图2所示。

从附图2可以看出，样品溶液中β-CBD的浓度在放置12小时以后仍然保持稳定，在放置超过18小时后变化仅超过5%。可见，在6～12小时内β-CBD的浓度能很好地保持稳定。因此，样品溶液优选在6～12小时内小时内完成色谱进样分析，更优选在6内小时内完成色谱进样分析。

实施例5 应用实验

应用本发明方法（参照实施例4）对随机备样的20种市售卷烟样品进行分析，每个样品平行测定两次，样品预处理后在6小时内完成检测。结果见表9所示。

表9样品测定结果

Claims (8)

1.一种烟草中β-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇的检测方法，其特征在于，将样品进行预处理后，采用高效液相色谱-二极管阵列检测器，采用外标法定量，在210nm波长下进行检测；所述将样品进行预处理的方法为：称取适量待测烟草样品粉末，置于具密封盖的玻璃离心管中，加入适量二氯甲烷，盖紧后进行超声萃取，取上清液离心处理再经0.45μm有机膜过滤，所得滤液转移至色谱瓶以备进样分析。

2.根据权利要求1所述烟草中β-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇的检测方法，其特征在于，所述离心管的容积为10mL。

3.根据权利要求1所述烟草中β-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇的检测方法，其特征在于，所述称取适量待测烟草样品的粉末的重量为0.5g；精确至0.0001g。

4.根据权利要求1所述烟草中β-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇的检测方法，其特征在于，所述二氯甲烷的加入量为5mL。

5.根据权利要求1所述烟草中β-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇的检测方法，其特征在于，所述超声萃取的时间为5～20min，超声功率为320W。

6.根据权利要求1所述烟草中西柏烷二萜醇的检测方法，其特征在于，所述离心处理的条件为于4000r/min离心15min。

7.根据权利要求1所述烟草中β-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱-二极管阵列检测器的条件为：Waters ACQUITY 超高效液相色谱仪，PDA检测器，Waters Symmetry 4.6mm×250mm 5μm色谱柱，检测波长为210nm，柱温为室温，进样量为10μL，流动相A为水，流动相B为乙腈；梯度洗脱条件为：

时间（min） 流量（mL/min）      %A   %B

0     1     80     20；

25   1     0       100；

30   1     0       100。

8.根据权利要求1所述烟草中β-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇的检测方法，其特征在于，所述所得滤液转移至色谱瓶以备进样分析是在6小时内完成色谱进样分析。