CN104569068A - 一种雾霾污染物毒性评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种雾霾污染物毒性评价方法。该方法是将RTE大鼠气管上皮细胞系接种培养，接种至培养皿；将细胞培养皿置于细胞培养基中大气颗粒物采集装置中对细胞进行染毒；同时对该雾霾区域进行颗粒物收集，检测其颗粒物粒径、重金属浓度以及其他有机与无机成分，并检测空气中PM10和PM2.5浓度；把染毒好的细胞放入细胞阻抗测量仪，检测其细胞恢复能力，趋化迁移能力和抵御侵润能力；综合评价比较不同雾霾区域下不同种类雾霾颗粒物对大鼠气管上皮细胞的毒效应。本发明相比传统毒性评价方法，所使用的ECIS技术具有更大的灵活性，获得的数据是实时变化的，含义更为丰富；取材方便，可排除个体差异对实验的影响，且不涉及伦理问题。

Description

一种雾霾污染物毒性评价方法

技术领域

本发明属于环境毒理学领域,涉及一种雾霾污染物毒性评价方法。

背景技术

近年来，中国雾霾事件频发。研究表明，雾霾与呼吸道疾病呈现正相关趋势，上海PM2.5每升高10ug/m³，当天和滞后1d（lag0～1）呼吸系统疾病死亡率升高0.95%。雾霾的主要组成为二氧化硫、氮氧化物和可吸入颗粒物。其中可吸入颗粒物是粒径介于2.5和10微米的颗粒物，这些颗粒物可以进入上呼吸道，尤其是粒径小于或等于2.5微米的颗粒物大部分可通过人体支气管，直达肺部，甚至进入人体血液循环，从而导致呼吸道疾病的发生。因此严重的雾霾天气条件下，雾霾中的细颗粒物会导致严重的呼吸道疾病，甚至诱发肺炎及人体死亡。

然而目前对于雾霾中颗粒物的毒性研究缺少基础试验研究及理论支持。其主要原因雾霾成分复杂，尤其是细颗粒物难提取，目前颗粒物的提取主要采用无菌水超声法，该方法存在以下三个缺陷：1.排除了PM2.5中可溶性颗粒物；2.颗粒物提取过程中可能存在凝结，造成粒径改变；3.暴露过程为一次性暴露，与实际蓄积性暴露存在较大区别。上述缺陷造成目前对细颗粒物的毒性评价尚不全面，亟待完善的大气颗粒物毒性评价方法。

经查阅，与大气颗粒物毒性评价方法相似的专利只有“一种卷烟烟气总粒相物生物学评价的MTT细胞毒性试验方法”(专利号：201310013300.9)，该评价主要涉及MTT法，该方法虽然是传统经典毒性检测方法，但仍存在以下缺陷：1.进行MTT试验前，要确定生长曲线以保证培养终止致细胞过满；2.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数，数据含义较单一。相比之下，本发明所采用的ECIS技术的灵活性更大，而且获得的细胞动态行为的实时变化，数据含义更为丰富。

本发明根据目前雾霾污染物毒性评价的方法所存在的缺陷进行改进。采用细胞培养基中大气颗粒物采集装置对细胞进行模拟人体暴露试验，避免大气颗粒物提取过程中导致的污染物缺失，确保评价结果的真实性。采用ECIS技术，对细胞活性变化进行实时监测，获得更全面的数据信息，确保全面评价雾霾颗粒物的毒效应。此外，本方法可排除个体差异对实验的影响，且不涉及伦理问题。

发明内容

本发明的目的在于解决现有大气颗粒物细胞毒性评价方法的不足，提出一种雾霾污染物毒性评价方法，该方法可弥补现有评价方法操作难度大，大气细颗粒物提取过程存在损失，评价内容单一，准确度低等缺点。该方法具有操作简单，暴露方式跟接近实际，暴露污染物无缺失，检测内容丰富，能更准确反映大气中细颗粒物对细胞的毒效应。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明方法包括以下步骤：

步骤(1).将RTE大鼠气管上皮细胞系接种到含胎牛血清的F12培养液中，置于37℃、无菌细胞培养箱中培养3～4天；将培养好的细胞接种至培养皿中，每个培养皿接种5×10⁶～8×10⁶个大鼠气管上皮细胞；

所述的含胎牛血清的F12培养液中含有体积含量为3～7﹪的胎牛血清，优选为体积含量为5﹪；

所述的培养皿直径为5cm，高度为1cm，使用前需进行灭菌；

步骤(2).然后步骤（1）细胞培养皿置于放置在雾霾区域的细胞培养基中大气颗粒物采集装置中，在细胞正常生长所需的温度下对细胞进行染毒；

所述的染毒方式（即暴露方式）采用模拟人体呼吸，空气流量可根据试验所需的肺活量进行设定；染毒时间即为细胞在装置中的暴露时间，可根据试验要求进行设定；细胞正常生长所需的温度为35～37℃；

步骤(3).在步骤（2）进行的同时对该雾霾区域进行颗粒物收集，采用宽范围粒子谱法检测颗粒物粒径、采用原子吸收法检测重金属浓度、采用气相质谱法有机污染物浓度、采用紫外光度法检测O₃、离子色谱法检测硫化物，并采用国标重量法检测空气中PM10和PM2.5浓度，即为雾霾颗粒物检测结果；

所述的颗粒物收集时间与染毒过程中的暴露时间一致；

步骤(4).接着把步骤（2）染毒好的细胞放入细胞阻抗测量仪，该仪器采用ECIS技术，通过微电流传感器实时、定量、非介入性的测量由于细胞贴壁状态、位置、形态等方面发生的电流变化，从而检测其细胞恢复能力，趋化迁移能力和抵御侵润能力，得到此时雾霾区域的细胞活性检测结果；

步骤(5).根据步骤（4）得到细胞活性检测结果与步骤（3）得到的雾霾颗粒物检测结果进行相关性分析，综合评价比较不同雾霾区域下不同种类雾霾颗粒物对大鼠气管上皮细胞的毒效应。

本发明的有益效果体现在：

(1) 本发明避免了大气颗粒物提取过程中导致的污染物缺失，从而造成评价不全面；

(2) 本发明相比传统毒性评价方法，本方法中所使用的ECIS技术具有更大的灵活性，获得的数据是实时变化的，含义更为丰富；

(3) 本发明取材方便，可排除个体差异对实验的影响，且不涉及伦理问题。

附图说明

图1为本发明方法的流程图；

图2为本发明提及的细胞培养基中大气颗粒物采集装置的结构示意图；

图3为本发明实施例细胞恢复能力分析图；

图4为本发明实施例细胞趋化迁移能力图；

图5为本发明实施例细胞抵御侵润能力图。

具体实施方式

    下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。

如图所示，本发明方法包括以下步骤：

步骤(1).将RTE大鼠气管上皮细胞系接种到含胎牛血清的F12培养液中，置于37℃、无菌细胞培养箱中培养3～4天；将培养好的细胞接种至培养皿中，每个培养皿接种5×10⁶～8×10⁶个大鼠气管上皮细胞；

所述的含胎牛血清的F12培养液中含有体积含量为3～7﹪的胎牛血清，优选为体积含量为5﹪；

所述的培养皿直径为5cm，高度为1cm，使用前需进行灭菌；

步骤(2).然后步骤（1）细胞培养皿置于放置在雾霾区域的细胞培养基中大气颗粒物采集装置中，在细胞正常生长所需的温度下对细胞进行染毒；

所述的染毒方式（即暴露方式）采用模拟人体呼吸，染毒时间即为细胞在装置中的暴露时间，可根据试验要求进行设定；

本实施例假设选取北京作为雾霾区域，并在北京18个区各设置一个细胞染毒点。

如图2所示，所述的细胞培养基中大气颗粒物采集装置，包括筒体、颗粒物过滤系统、颗粒物除菌系统和细胞暴露系统；所述的筒体为顶部开放、底部封闭的圆筒形，内壁用两块隔板分隔成上层、中层和下层；所述的颗粒物过滤系统包括膜固定架和滤膜；所述膜固定架的底部封闭，整体嵌套在筒体的内壁上层；多张滤膜分层放置在膜固定架上；所述的颗粒物除菌系统包括铁环、紫外灭菌灯和导气软管；上部隔板的底部和下部隔板的顶部均固定有紫外灭菌灯；所述的导气软管设置在筒体中层，整体沿竖直方向呈螺旋状，并通过铁环固定；导气软管的上端穿过上部的隔板并伸入膜固定架底部，下端穿过下部的隔板；导气软管的下端设有流量计和可调泵；所述的细胞暴露系统包括温度测定控制系统、加热系统和U型管；筒体的下层侧壁开设有细胞培养皿进口，门板盖住细胞培养皿进口；所述的U型管整体设置在筒体下层，且外端伸出筒体外；导气软管的下端及U型管伸出筒体外的一端均设有单向阀；所述的温度测定控制系统和加热系统均设置在筒体下层，组成控温系统；所述的温度测定控制系统、加热系统、可调泵和紫外灭菌灯均与定时器串联后接入总电路。

所述的染毒过程如下：

先打开细胞培养基中大气颗粒物采集装置可调泵14，调节进入导气软管5的空气流量至试验所需的肺活量，并设置好每分钟呼吸次数20次，然后打开温度测定控制系统7和加热系统9，调节筒体下层的温度至细胞正常生长所需的温度35～37℃。参数调节好后，将无菌水注入U型管15中，防止外部细菌进入，影响试验结果；然后将培养有细胞的细胞培养皿通过细胞培养皿进口放于培养皿放置平台11上，导气软管5的下端和U型管15的内端均插入细胞培养皿中，在定时器13上设置好暴露时间6h。工作时，可调泵14将外界空气抽至滤膜2，筛去大粒径颗粒物，获得所需的小粒径颗粒物。外界空气经滤膜2过滤后，进入导气软管5，接受紫外灭菌灯4照射，对颗粒物进行灭菌，灭菌后的颗粒物进入无菌细胞培养液中，多余气体通过U型管15排出，进入空气。试验结束后，由于导气软管5和U型管15内无空气流动，两个单向阀6均自动闭合，取出细胞培养皿。

步骤(3).在步骤（2）进行的同时对该雾霾区域进行颗粒物收集，检测其颗粒物粒径、重金属浓度以及其他有机与无机成分，并检测空气中PM10和PM2.5浓度，即为雾霾颗粒物检测结果；

采用宽范围粒子谱法检测颗粒物粒径、采用原子吸收法检测重金属浓度、采用气相质谱法有机污染物浓度、采用紫外光度法检测O₃、离子色谱法检测硫化物，并采用国标重量法检测空气中PM10和PM2.5浓度。

颗粒物收集时间与染毒过程中的暴露时间一致；

检测后可得到粒物粒径分布：粒径小于0.5μm，x%；粒径大于0.5μm小于1μm，x%；粒径大于1μm小于1.8μm，x%；粒径大于1.8μm小于2.5μm，x%；粒径大于2.5μm小于10μm，x%。重金属Cu、Zn、Fe、Pb浓度为xμg/m³，xμg/m³，xμg/m³和xμg/m³。O₃和硫化物浓度xμg/m³和xμg/m³。PM10和PM2.5浓度为xμg/m³和xμg/m³。

步骤(4).接着把步骤（2）染毒好的细胞放入细胞阻抗测量仪，检测其细胞恢复能力，趋化迁移能力和抵御侵润能力，得到此时雾霾区域的细胞活性检测结果，见图3、图4、图5；

图3为细胞恢复能力分析图：电击单细胞层后，引起阻抗值降低，随时间的延长曲线回升至初始数值，通过恢复时间（h）评价细胞恢复能力。

图4为细胞趋化迁移能力图：当细胞从电极板一侧迁移至另一侧时，可测出细胞层电阻值变化，即上升迁入，下降迁出，根据迁入迁出时间（h）评价细胞趋化迁移能力。

图5为细胞抵御侵润能力图：分别向含RTE细胞层的电极孔中加入G细胞。当RTE细胞受损，抵御侵润能力降低，相比对照组（未受损RTE细胞），阻抗曲线下降显著，根据阻抗下降比例（%）从而评价细胞抵御侵润能力。

步骤(5).根据步骤（4）得到细胞活性检测结果与步骤（3）得到的雾霾颗粒物检测结果进行相关性分析，综合评价比较不同雾霾区域下不同种类雾霾颗粒物对大鼠气管上皮细胞的毒效应。

采用SPSS软件对细胞阻抗测量仪结果与雾霾颗粒物检测结果进行线性相关分析。例如，考察空气中重金属Zn对RTE细胞恢复能力的影响，可将每个采样点所对应的Zn浓度和RTE细胞恢复能力绘制成散点图，并根据SPSS软件和散点分布得到r值。当r≥0.8时，重金属Zn浓度越高， RTE细胞恢复能力越弱；当r≤-0.8时，重金属Zn浓度越高， RTE细胞恢复能力越强；当0.8>r>-0.8时，重金属Zn浓度与RTE细胞恢复能力无关。采用此方法可分析各雾霾颗粒物参数与RTE细胞恢复能力，趋化迁移能力和抵御侵润能力的关系，从而综合评价雾霾污染物的毒性。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1. 一种雾霾污染物毒性评价方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤(1).将RTE大鼠气管上皮细胞系接种到含胎牛血清的F12培养液中，置于37℃无菌细胞培养箱中培养3～4天；将培养好的细胞接种至培养皿中，每个培养皿接种5×10⁶～8×10⁶个大鼠气管上皮细胞；

所述的含胎牛血清的F12培养液中胎牛血清的体积含量为3～7﹪；

步骤(2).将步骤（1）细胞培养皿置于放置在雾霾区域的细胞培养基中大气颗粒物采集装置中，在细胞正常生长所需的温度下对细胞进行染毒；

步骤(3).在步骤（2）进行的同时对该雾霾区域进行颗粒物收集，检测其颗粒物粒径、重金属浓度以及其他有机与无机成分，并检测空气中PM10和PM2.5浓度，即为雾霾颗粒物检测结果；

所述的颗粒物收集时间与染毒过程中的暴露时间一致；

步骤(4).把步骤（2）染毒好的细胞放入细胞阻抗测量仪，该仪器采用ECIS技术，通过微电流传感器实时、定量、非介入性的测量由于细胞贴壁状态、位置、形态等方面发生的电流变化，从而检测其细胞恢复能力，趋化迁移能力和抵御侵润能力，得到此时雾霾区域的细胞活性检测结果；

步骤(5).根据步骤（4）得到细胞活性检测结果与步骤（3）得到的雾霾颗粒物检测结果进行相关性分析，综合评价比较不同雾霾区域下不同种类雾霾颗粒物对大鼠气管上皮细胞的毒效应。

2.    如权利要求1所述的一种雾霾污染物毒性评价方法，其特征在于步骤(1)所述的含胎牛血清的F12培养液中胎牛血清的体积含量为5﹪。

3.如权利要求1所述的一种雾霾污染物毒性评价方法，其特征在于步骤(1)所述的培养皿直径为5cm，高度为1cm，使用前需进行灭菌。

4.如权利要求1所述的一种雾霾污染物毒性评价方法，其特征在于步骤(2)所述的染毒方式采用模拟人体呼吸，空气流量可根据试验所需的肺活量进行设定；染毒时间即为细胞在装置中的暴露时间，可根据试验要求进行设定；细胞正常生长所需的温度为35～37℃。

5.如权利要求1所述的一种雾霾污染物毒性评价方法，其特征在于步骤(3)所述的检测过程具体是采用宽范围粒子谱法检测颗粒物粒径、采用原子吸收法检测重金属浓度、采用气相质谱法有机污染物浓度、采用紫外光度法检测O₃、离子色谱法检测硫化物，并采用国标重量法检测空气中PM10和PM2.5浓度。

6. 如权利要求1所述的一种雾霾污染物毒性评价方法，其特征在于步骤(5)具体是采用SPSS软件对步骤（4）得到细胞活性检测结果与步骤（3）得到的雾霾颗粒物检测结果进行线性相关分析。