CN104560945A - 四氢嘧啶作为增效剂在pcr中的应用 - Google Patents

四氢嘧啶作为增效剂在pcr中的应用 Download PDF

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朱道辰
陈焱
洪好
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Abstract

本发明的目的是提供一种PCR增效添加剂四氢嘧啶。本发明的利用四氢嘧啶提高PCR扩增效果，特别是对超长DNA片段的扩增有显著效果。

Description

四氢嘧啶作为增效剂在PCR中的应用
技术领域
本发明涉及一种PCR增效剂，尤其是一种四氢嘧啶增强PCR扩增效率的方法。 
背景技术
聚合酶链式反应（简称PCR），又称无细胞分子克隆，是一种分子生物学技术，用于生物体外酶促合成DNA，由高温变性、低温退火及适度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，在短时间内能使目的DNA迅速扩增。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病诊断或任何有DNA、RNA的地方。由美国科学家Dr.Mullis发明，由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。 
近年来，人们发现，向PCR反应体系中加入一定量的添加剂可以提高PCR扩增效率和专一性，减少或消除副反应的产生。常见的添加剂有：DMSO、牛血清蛋白（BSA）、甘油、聚乙二醇、吐温-20等。但是，这些添加剂各有其局限性，如DMSO会抑制二级结构的形成，因此鸟嘌呤G、胞嘧啶C含量高而腺嘌呤A、胸腺嘧啶T含量较低时加入适量DMSO能提高PCR扩增效率，G、C含量较低时则反而抑制PCR扩增；吐温-20可以使聚合酶更稳定，但是也因此增加了非特异性扩增。开发新的PCR扩增添加剂是一项非常重要的工作，以适用于多种复杂环境的片段扩增。 
发明内容
本发明的目的是提供一种PCR添加剂，以提高PCR扩增效果，效果显著，用量少，成本低，操作方便。 
实现本发明目的的一种四氢嘧啶PCR添加剂，在PCR反应体系中加入四氢嘧啶。 
所述四氢嘧啶在PCR反应体系中的终浓度为为6-10mg/ml。 
本发明的一种PCR增产剂的有益效果如下： 
四氢嘧啶是嗜盐微生物体内合成的类种相容性溶质，分子量为142.16，属于亲水性、兼性离子的生物小分子。从结构上来说它们是环化的氨基酸衍生物，，胞内高耐受性（１Ｍ），对热稳定、不易分解。四氢嘧啶及其衍生物能够在高温、冷冻、干燥、射线、自由基等不利条件下保护酶、核酸等生物大分子的生物活性。
利用四氢嘧啶作为PCR添加剂有如下功能：（1）用四氢嘧啶作为增效剂添加到PCR反应体系中，确实提高了PCR特异性，且成本低；（2）加入四氢嘧啶对后续电泳检测等操作无影响；（3）本发明提供的四氢嘧啶提高PCR扩增效果的方法操作简单，易于实行。 
  
具体实施方式
本发明结合附图通过以下实施例进行详述，但不限于下述实施例。 
本发明涉及PCR优化的方法是向PCR反应体系中添加四氢嘧啶来实现，具体步骤如下： 
1.四氢嘧啶添加剂的制备：称取市售四氢嘧啶15mg，置于已灭菌的1.5ml离心管中，加入灭菌水使其溶解，最后定容至1ml，所得溶液进行121℃，20min灭菌。
2.PCR反应体系的配置：待扩增的DNA片段不同，PCR反应体系中dNTP、Mg2+、模板的加入量不同；在上述反应体系中加入适量的四氢嘧啶溶液,双蒸水的添加量应根据四氢嘧啶溶液的加入作相应扣减。 
3.PCR反应运行：预变性、变性、退火温度及时间应根据模板来选择，延伸时间根据所要扩增的目的片段的长度来选择。 
4.PCR扩增产物的检测：用琼脂糖凝胶电泳检测。 
实施例1：四氢嘧啶对23kb的DNA片段的优化扩增 
1.配置15mg/ml四氢嘧啶水溶液。
    2.PCR反应体系的配置： 
10×PCR Buffer              2.5ul
dNTP（2.5mM）                5ul
引物1（2.0uM）              1ul
引物2（2.0uM）              1ul
Mg2+（25mM）                 1.5ul
配置好上述反应体系后，加入适量四氢嘧啶添加剂，附图中1表示加入10ul四氢嘧啶溶液，并加灭菌双蒸水补足25ul体系，图中2表示加入14ul四氢嘧啶溶液，这样的话，四氢嘧啶溶液在PCR反应体系中的终浓度分别为6mg/ml和8.4mg/ml。对照组将四氢嘧啶溶液换成14ul灭菌双蒸水。
3.PCR反应运行： 
4.PCR下反应后用琼脂糖凝胶电泳检测：结果如图所示，所用Maker为入DNA，从图中可以看出加入四氢嘧啶的两组明显比对照组条带亮，且2泳道比1泳道亮些，说明四氢嘧啶浓度稍高能提高PCR效果。 
附图说明
附图中1，2分别表示加入四氢嘧啶的在PCR反应体系中终浓度为6mg／ml和8.4mg／ml的优化组扩增23kb左右的DNA片段，3表示未加四氢嘧啶的对照组，所用Maker为入DNA。 
  

Claims (4)

1.一种四氢嘧啶作为PCR增效添加剂提高扩增效果的方法，其特征在于，先将四氢嘧啶溶于无菌水制备四氢嘧啶溶液。
2.根据权利要求1所述的PCR添加剂，其特征在于：所述四氢嘧啶溶液的浓度为15mg/ml的四氢嘧啶水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的PCR增效剂，其特征在于：向PCR反应体系中加入四氢嘧啶水溶液后四氢嘧啶的终浓度为6-10mg/ml。
4. 根据权利要求1所述的四氢嘧啶提高PCR扩增效果的方法，其特征在于，所述的PCR扩增包括：常规PCR，超长片段PCR、含有较多重复序列的PCR。
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