CN104560898A - 一种用病毒样颗粒包被量子点的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用病毒样颗粒包被量子点的方法,以及用这种方法制备的物质。发明的方法中,CdSe/ZnS油溶性量子点修饰方法为:将商品化的CdSe/ZnS正己烷溶液,加入到的无水乙醇中,超声处理后,离心弃上清后加入氯仿进行溶解,然后加入2-巯基乙酸(MAA)或3-巯基丙酸(MPA)混匀,经离心处理弃上清,将沉淀用氯仿洗涤,再用硼酸盐溶液溶解沉淀。发明可降低量子点的生物毒性作用,并可选择性的侵染正常细胞,在侵染细胞的方式上具有特异性,能提高QD进入细胞的靶向性。
Description
技术领域
本发明涉及一种示踪物质的制备方法,确切讲本发明涉及一种用病毒样颗粒包被量子点的方法,以及用这种方法制备的物质及应用。
背景技术
病毒样颗粒(Virus-like Particles, VLPs),也称为核心样颗粒(Core-like
Particles, CLPs),是由病毒的结构蛋白组装而成的介于15nm~400nm的空心颗粒。VLPs不含病毒基因组,不能自主复制,在形态上与真正病毒粒子相似,可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,有效诱导机体产生免疫保护反应。病毒的衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力,这为病毒的基础研究及疫苗的开发提供了便利条件。其中一些VLPs允许外源抗原基因的插入或融合,产生在表面展示外源表位的嵌合病毒样粒子(cVLPs),或是通过化学方法将包括非蛋白类抗原在内的抗原偶联至粒子表面。多数VLPs具有包裹核酸或其它小分子的能力,可以用作基因或药物的运载工具。至今,已构建成功多种人类和动物病毒的VLPs。这些病毒粒子包装形成也各不相同,有的仅需要单一衣壳蛋白、多个衣壳蛋白,有的还需要病毒脂质囊膜。病毒样粒子具有的独特结构、展示表位的能力和能有效刺激产生免疫反应为研究预防多种疾病提供很好的方法。此外,VLPs也应用于研究病毒包装过程、形态以及病毒的体系结构。参见:Rodriguez-Limas, W.A., K. Sekar and K.E. Tyo,
Virus-like particles: the future of microbial factories and cell-free systems
as platforms for vaccine development.
Curr Opin Biotechnol, 2013. 24(6): p. 1089-93.
量子点(quantum
dots,简称QDs)又可称为半导体纳米微晶体(semiconductor
nanocrystal),是一种由Ⅱ-Ⅵ族和Ⅲ-Ⅴ族元素组成的纳米颗粒。目前研究较多的主要是Ⅱ-Ⅵ型量子点即由第二副族和第六主族元素组成的量子点,如CdS、CdSe、CdTe等。主要应用在光学、生物诊断和传感器等领域。由于量子点的吸收光谱宽而连续,而发射光谱则窄而对称,所以可以通过调节量子点的组成和大小达到光学性质可调性,同时光学稳定性明显优于传统的有机染料。此外,量子点表面的电子,空穴复合过程对许多外部作用非常敏感,据此可建立荧光传感系统。如何制备量子产率高、性能稳定和具有特殊功能基团的量子点一直是研究者追求的目标。目前,量子点的制备主要分为金属有机合成和水相合成两类方法。但是,由于量子点合成方法的限制以及材料自身的缺陷,使其在应用领域很受限制,所以如何将量子点合理化修饰成为近期研究的热点。为了改善量子点的单分散、水溶性以及发光稳定性,研究者做了大量的努力。聚合物材料因为在电磁光谱的可见光区对量子点的光学性质没有影响,所以成为量子点修饰的合适试剂。目前关于聚合物直接修饰量子点表面的研究主要集中在生物学和光电子组装方面,修饰后的量子点稳定性大大提高。通常聚合物包覆的量子点比有机小配体包覆的量子点稳定性要强。此外,通过采用聚合物包覆的方法,可以获得各种各样功能性的量子点表面。量子点表面直接功能化的成功关键在于量子点在功能化后依然能保持发光性质。参见Luo,
Y.H., et al., Cadmium-based quantum dot induced autophagy formation for cell
survival via oxidative stress. Chem Res Toxicol, 2013. 26(5): p. 662-73.
人们已经在细胞成像,免疫分析,DNA杂交,生物传感器,共振能量转移等方面得到了较为成功的探索与尝试。在多数研究中都涉及了量子点QDs与生物分子偶联的问题,这一步往往是进行深入研究的基础。因此,只有对生物分子修饰QDs进行较为全面的研究,才能更好地利用这一新型荧光物质。目前报道较多的量子点研究主要有
CdS, ZnS,CdSe、ZnTe、HgSe、CdS、CdTe、InAs、GaAs 等。这些量子点具有激发光谱宽、可实现多种荧光光谱、较大的斯托克斯位移和较好的生物分析等特性.。但这些量子点从应用和环保角度来看,在获得生物相容性好、无毒性影响,荧光亮度高、稳定不变、水溶性好的性能方面还有不少问题有待解决。参见:Woolley, R., et al., From particle to platelet:
optimization of a stable, high brightness fluorescent nanoparticle based cell detection platform. Nanomedicine, 2013. 9(4): p. 540-9. [2] Li
F, Zhang Z P, Peng J, et al. Imaging viral behavior in Mammalian cells with
self-assembled capsid-quantum-dot hybrid
particles[M]. 2009: 718-726.。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足,具有:生物相容性好、无毒性影响,荧光亮度高、稳定不变、水溶性好、用病毒样颗粒包被的量子点。
本发明的用病毒样颗粒包被量子点的方法是用2-巯基乙酸或3-巯基丙酸作为CdSe/ZnS油溶性量子点的表面修饰剂,用犬细小病毒重组结构蛋白溶液与经修饰后的CdSe/ZnS油溶性量子点按体积比5:1-10:1加入透析袋内,再在其中按照5%的体积比加入浓度为2 mg/ml SUMO蛋白酶,混匀后置pH=6.8的缓冲液透析,通过犬细小病毒重组结构蛋白的自组装特性将修饰后的量子点包装入病毒样颗粒内。
本发明的用病毒样颗粒包被量子点的方法中使用的犬细小病毒重组结构蛋白是犬细小病毒重组结构蛋白VP2
。
本发明的用病毒样颗粒包被量子点的方法中,CdSe/ZnS油溶性量子点修饰方法为:将275μl的商品化的CdSe/ZnS正己烷溶液,加入到1ml的无水乙醇中,超声处理后,离心弃上清后加入300μl氯仿进行溶解,然后加入1ml的2-巯基乙酸(MAA)或3-巯基丙酸(MPA)混匀,室温下剧烈震荡1h,再经离心处理弃上清,将沉淀用氯仿洗涤,再用1ml硼酸盐溶液溶解沉淀。
进一步,本发明的用病毒样颗粒包被量子点的方法,是将2 mg/ml的犬细小病毒VP2蛋白溶液和修饰后的0.2 mg/ml的量子点溶液按体积比5:1加入透析袋内,按犬细小病毒VP2蛋白溶液和修饰后的量子点溶液体积之和的100:1加入SUMO蛋白酶,混匀后放入缓冲液中进行酶切包装,得到目标病毒样颗粒包被量子点。试验中所用的缓冲液有PBS,TBS和HEPES缓冲液,pH值为6.6-7.8,其中:50 mM/L Tris-HCl、150 mM/L NaCl pH=6.8最好,可以在包装效率和生物相容性两方面达到最佳效果。
采用前述的方法可以制备出包被量子点的病毒样颗粒。
本发明的包被量子点的病毒样颗粒可在制备示踪剂方面的应用,也可在制备用于研究病毒入侵机制的试剂中的应用。
采用病毒样颗粒蛋白作为一种生物运载工具,这不仅解决了无机纳米材料量子点在生物应用中存在的无机相容性问题,同时通过在量子点外部包覆一层病毒衣壳蛋白的形式,来降低量子点的生物毒性作用。犬细小病毒能够选择性的侵染正常细胞,在侵染细胞的方式上具有特异性;由犬细小病毒的VP2蛋白组装成的VLP,具有与犬细小病毒相似的特性,VLP-QDs通过犬细小病毒侵入细胞的方式,利用宿主细胞转铁蛋白受体进入细胞,从而提高的QD进入细胞的靶向性。
附图说明
图1.琼脂糖凝胶电泳图,琼脂糖凝胶电泳检测修饰后表面电性,样品与甘油按1:1混合均匀加样,甘油起沉降样品的作用。其中:MPA-QD是用3-巯基丙酸修饰的CdSe/ZnS量子点;MAA-QD是用2-巯基乙酸修饰的CdSe/ZnS量子点;QD是CdSe/ZnS量子点,VLP是犬细小病毒样颗粒。
图2. Zetasizer检测QD修饰前后的表面所带电荷数和电性。其中:MPA-QD是用3-巯基丙酸修饰的CdSe/ZnS量子点;MAA-QD是用2-巯基乙酸修饰的CdSe/ZnS量子点。
图3.TEM 透射电镜图片,其中 (A)为 CdSe/ZnS量子点的透射电镜图;(B) 为MPA-CdSe/ZnS量子点的透射电镜;(C)为犬细小病毒样颗粒的透射电镜;(D)为犬细小病毒样颗粒包被的量子点的(VLP-QD)透射电镜图。
图4. 用Nanosizer检测不同比例的VP2蛋白与QD包覆后的粒径大小曲线。
图5. 用紫外连续光谱检测不同比例的VP2蛋白与QD包覆后的吸光率曲线。
图6. MTT法检测MPA-QD和VLP-QD的细胞毒性曲线。其中:MPA-QD是用3-巯基丙酸修饰的CdSe/ZnS量子点;CVLPQD是犬细小病毒样颗粒包被的 CdSe/ZnS量子点。
图7. CPV VLPs-QD
的细胞靶向定位。
具体实施方式
本发明以下结合实施例解说。
QD表面改性:使用2-巯基乙酸(MAA)、3-巯基丙酸(MPA)进行表面修饰。QD修饰方法:取275μl(2mg)商品化的CdSe/ZnS油溶性量子点正己烷溶液,加入到1ml的无水乙醇中,超声20 min后,12000 rpm离心5 min,弃上清加入300 μl氯仿溶解QD,之后加入1ml的2-巯基乙酸MAA或3-巯基丙酸MPA混匀,室温下剧烈震荡1h。12000 rpm离心20 min,弃上清,用氯仿洗涤沉淀两次。用1ml 4mg/ml的硼酸钠溶液溶解沉淀。将修饰好的MPA-QD,MAA-QD溶液存入4℃冰箱内。
实验显示,使用过量的MAA修饰QD时,修饰效率可达到100%,形成的复合物MAA-QD能够被完全溶解于pH=8.4的硼酸盐溶液中,4℃下贮存长达6个月之久不会再出现结晶现象;使用过阿量MPA修饰QD时,修饰效率最多可达48%左右,离心可得橙色上清和橙红色沉淀,沉淀溶解于pH=8.3的硼酸盐溶液中,形成的复合物MPA-QD只能够在4℃下正常存在60 天左右,之后就会在溶液中形成橙红色结晶,剧烈震荡不溶解。修饰不完全的橙色上清贮存在4℃静置30 天以上,会在试管底部结晶出橙红色沉淀,离心后沉淀可溶解于硼酸盐缓冲液中形成MPA-QD复合物,4℃下可稳定存在60 天以上。
本研究中所用的QD不带电荷,经琼脂糖凝胶电泳和Zetasizer检测显示,经MAA或MPA修饰后的MAA-QD、MPA-QD的表面带负电荷,参见图1和图2。
不同包覆比例包覆的结果及表征;
VLP-QDs的包覆,主要是利用CPV衣壳蛋白VP2自组装特性,在VP2组装成VLPs的同时将带有负电的经修饰的QDs作为核心包覆,形成VLP-QD复合物。将2
mg/ml的犬细小病毒VP2融合蛋白溶液和修饰后的0.2 mg/ml的量子点溶液按体积比1:1-10:1加入透析袋内,同时按当前体积比100:1加入SUMO蛋白酶混匀后放入缓冲液中进行酶切包装,4℃ 12 h后,用Nanosizer检测粒子直径大小,用紫外连续光谱检测吸光率。本发明的VP2融合蛋白溶液为使用His标签镍柱纯化蛋白后的溶液,主要成分有: 500mM NaCl、20mM Tris-HCl、300mM Imidazole、1mM DTT,pH=8.0。有关这方面的内容还可见中国发明专利申请201310381323.5(犬细小病毒病毒样颗粒的制备及用途)相关内容。
通过电镜观察发现,包覆QD后的VLPs电镜下形态类似CPV VLP,QD在VLP衣壳内成暗色,直径小于10nm,VLPs颗粒直径为25nm左右,参见图3。
Nanosize检测结果表明,在体积比为5:1时所包覆得到的VLP-QD复合物与自组装形成的VLPs具有相似大小的粒子直径,且包装数量最高,说明此包覆比例为本试验的最优比。其他包覆比例下形成的复合物VLP-QD粒子直径明显大于VLPs粒子直径,说明QDs浓度大小影响VLP-QDs的形成,高浓度QDs环境可使VLPs形成聚集现象,参见图4。
紫外连续光谱检测表明,5:1反应体系下形成的VLP-QD复合物溶液的吸光峰值最接近VLPs溶液,参见图5。
使用MPA或MAA修饰QD的目的是在QD分子基团表面添加亲水基团,使QD从油溶性转为水溶性,增加QD的水溶性并有利于连接其他功能蛋白。
用MTT试验检测VLP包被的QD和未包被的QD对细胞的毒性, 将F81细胞接种到96孔板中,每孔的数量约为5×103个,培养24小时后,用CPV VLPs-QDs和MPA-QD或MAA-QD处理,使CPV VLPs-QDs中QD的浓度和MPA-QD或MAA-QD的浓度一致,继续培养24小时后,弃去孔里的培养基,用PBS洗3次,加入无血清的培养基维持,然后每孔加入100微升MTT (0.5 mg/ml),继续培养2-3小时后,用酶标仪测495nm处的吸光值。结果发现在相同QD浓度下,水溶性MPA-QD的细胞毒性大于包被后VLP-QD对细胞的毒性。这说明使用VLP对QD进行包被有助于降低QD对细胞的毒性作用,参见图6,MAA-QD与VLP包被QD的结果与MPA-QD的结果一致。
选用F81细胞、BHK细胞、Hela细胞三种细胞系检测VLP包被的QD的靶向性。每种细胞都接种到35mm有玻片的培养皿中,接种密度为5×104个/well,24小时后,每个培养皿中分别加入相同体积的CPV VLP-QDs和MPA-QD或MAA-QD,确保CPV VLP-QDs中QDs的量和MPA-QD或MAA-QD的量一致,在不同的时间点(1小时、3小时)收集细胞, 弃去上清,用PBS洗三次,4%多聚甲醛固定15 min,用PBS洗3次,1‰的triton-100穿透15min,用PBS洗3次,之后用CPV的鼠源单抗(1:200)孵育1小时,PBS洗三次,用FITC标记的山羊抗鼠二抗(1:500)37℃孵育1小时,PBS洗三次,然后用DAPI染核15min,PBS洗3次。处理好的玻片放在载玻片上置于100倍物镜下观察,DAPI用350nm波长激发,QDs用488nm激发, FITC用561nm激发。如图7所示,CPV VLPs-QDs处理1小时的F81细胞的细胞核周围出现荧光信号,3个小时就有明显的大量积累,而相同的时间点,BHK细胞核周围看不到明显的荧光信号。MPA-QDs处理的两种细胞,只能在细胞核周围看到零星的荧光信号,说明CPV VLP包被的量子点具有明显的靶向性,增加了QDs在靶细胞中的吸收,减少了在非肿瘤细胞中的非特异性积累。同时为了验证CPV VLPs-QDs能够用于癌细胞成像,我们选用转铁素受体阳性的Hela细胞,经过和F81细胞相同的处理后,在相同的时间点进行共聚焦显微镜观测,可以看到在Hela细胞核周围有明显的荧光信号,说明CPV VLPs作为一种载体,能够有效地将量子点运输到靶细胞内。
Claims (7)
1.一种用病毒样颗粒包被量子点的方法,其特征在于用2-巯基乙酸或3-巯基丙酸作为CdSe/ZnS油溶性量子点的表面修饰剂,用犬细小病毒重组结构蛋白溶液与经修饰后的CdSe/ZnS油溶性量子点按体积比5:1-10:1加入透析袋内,再在其中按照5%的体积比加入浓度为2 mg/ml SUMO蛋白酶,混匀后置pH=6.8的缓冲液透析,通过犬细小病毒重组结构蛋白的自组装特性将修饰后的量子点包装入病毒样颗粒内。
2.根据权利要求1所述的用病毒样颗粒包被量子点的方法,其特征在于所使用的犬细小病毒重组结构蛋白是犬细小病毒重组结构蛋白VP2 。
3.根据权利要求1或2所述的用病毒样颗粒包被量子点的方法,其特征在于CdSe/ZnS油溶性量子点修饰方法为:将275μl的商品化的CdSe/ZnS正己烷溶液,加入到1ml的无水乙醇中,超声处理后,离心弃上清后加入300μl氯仿进行溶解,然后加入1ml的2-巯基乙酸或3-巯基丙酸混匀,室温下剧烈震荡1h,再经离心处理弃上清,将沉淀用氯仿洗涤,再用1ml 4mg/ml的硼酸盐溶液溶解沉淀。
4.根据权利要求3所述的用病毒样颗粒包被量子点的方法,其特征在于将2 mg/ml的犬细小病毒VP2蛋白溶液和修饰后的0.2 mg/ml的量子点溶液按体积比5:1加入透析袋内,按犬细小病毒VP2蛋白溶液和修饰后的量子点溶液体积之和的100:1加入SUMO蛋白酶,混匀后放入缓冲液中进行酶切包装,得到目标病毒样颗粒包被量子点。
5.权利要求1至4所述的任一方法制备的包被量子点的病毒样颗粒。
6.权利要求5所述的包被量子点的病毒样颗粒在制备示踪剂方面的应用。
7.权利要求5所述的包被量子点的病毒样颗粒在制备用于研究病毒入侵机制的试剂中的应用。
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