CN104546835A - 3-(苯甲酰苯基)丙酸衍生物在治疗连接蛋白cx31介导的皮肤病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了3-{[2-[3-氧-(1，2-苯并异恶唑-6-基)甲氧基]-5-[(2-羟基-4-环戊氧基苯甲酰基)]苯基}丙酸（化合物I）在制备用于治疗连接蛋白CX31介导的皮肤病中的应用，其中，连接蛋白CX31介导的皮肤病包括可变性红斑皮肤角化病或银屑病。药理实验表明：化合物I的低剂量组、高剂量组均能明显减轻银屑病样小鼠皮肤的皮损程度；低剂量的化合物I可以抑制小鼠血清中TNF-α的含量，进而抑制炎症细胞浸润，减轻炎症反应，具有很好地治疗银屑病的效果，从而可以用于连接蛋白CX31介导的皮肤病中。

Description

3-(苯甲酰苯基)丙酸衍生物在治疗连接蛋白CX31介导的皮肤病中的应用

技术领域

本发明涉及药学领域，具体而言，涉及3-{[2-[3-氧-(1，2-苯并异恶唑-6-基)甲氧基]-5-[(2-羟基-4-环戊氧基苯甲酰基)]苯基}丙酸化合物在制备用于治疗连接蛋白CX31介导的皮肤病中的应用。 

背景技术

银屑病俗称“牛皮癣”，是常见的以鳞屑性红斑为临床特征的慢性炎症性皮肤病，发病年龄以青壮年居多，男性略多于女性。具有特征性的红色丘疹、斑块及银白色鳞屑，好发于头皮、四肢伸侧，发病有明显季节性春冬季节易复发或加重，而夏秋季节多缓解。临床上分为寻常型银屑病和非寻常型银屑病两大类型。非寻常型银屑病包括脓疙型、关节型及红皮病型，较为少见，约占银屑病的5%左右。银屑病在自然人群中的患病率为0.1-3%。欧美国家为1%-2%。中国1984年进行大规模调查的结果为0.12%，其中北方高于南方，城市高于农村，男性高于女性。据此估计，中国银屑病患者达150万人以上，约60%的患者皮损少于10%体表面积。该病顽固难治，频繁复发，催患终身，给社会、个人都带来了沉重的精神压力和经济负担。 

从中医辨证角度分析是由于营血亏损，生风生燥，肌肤失养而成。初起多因风寒风热之邪侵犯肌肤，气机不畅，营血失和，气血阻滞肌肤而成；也有因湿热蕴积，外不能宣泄，内不能利导，阻于肌表而成；病久风寒、风热、湿热之邪已化，气血耗伤，血虚风燥，肌肤更失气血之养；或因营血不足，气血循行受阻，以致瘀阻肌表而成；或因肝肾不足，冲任失调，致使营血亏损，而使皮损复发或更加严重。从西医角度分析，银屑病皮损处由于角质层细胞堆积异常导致产生氧化皮和表皮颗粒层的减少。表皮膜 被拉长，内皮血管也被扩张。其病理特征主要是以皮肤表皮超级增殖和不完全分化，可由多种因素诱发的疾病。通常认为银屑病与免疫，遗传，环境有很密切的关系，其病因和发病机制至今仍未完全阐明。 

目前，银屑病多归为免疫介导的炎症性皮肤疾病。研究发现在银屑病皮损处有非常丰富的IL-23和IL-17细胞，IL-23和IL-17通路的过度表达解释了银屑素和其他一些先天性防御分子的过度生产。IL-23是结合在受体复合物上的异质二聚体的细胞因子，主要由树突细胞和吞噬细胞产生。IL-23是Th17细胞的生长，生存和效应区所必需的。Th17细胞能够分泌IL-17和其他的细胞因子包括IL-22。与Th1和Th2细胞相似，Th17细胞被认为参与获得性免疫抵抗抗原。Th17联合细胞因子IL-17和IL-22能够诱导角化细胞抗菌β-防御素2、β-防御素-3、脂质运载蛋白和S100蛋白的表达。这些蛋白作为重要的炎症诱导物能够在表皮屏障功能失调时发挥作用减少皮肤感染。此外，银屑病皮损处含有过多的Th1T细胞。Th1T细胞是由IFNγ产生并激活的，并且在角质细胞里IFNγ能够诱导产生大量的炎症分子。有文献报道IFNγ能够通过刺激DCs产生Th17和Th22促细胞因子IL-1和IL-23。这些细胞因子能够负反馈调节角质细胞里由TNF，Th1细胞因子，IFNγ诱导的通路。 

可变性红斑角化病(EKV，OMIM133200)，又称为Mendes da Costa型红斑角化病，由Mendes daCosta于1925年首次报道，是一种少见的遗传性皮肤病，以可变的片状红斑和固定的角化过度性斑块为特征，片状红斑边界清楚，呈地图样，短时间内(数小时或数天)形状大小可发生改变或完全消退。皮损可发生在身体任何部位，但以四肢伸侧、臀部、腋窝、腹股沟和面部多见，约0%伴掌跖角化。大多数患者于出生后不久发病，皮疹随年龄增长而改善，特别是在绝经后，妊娠期皮疹加重，过热、过冷、风吹以及情绪波动均可导致皮疹加重。组织病理为非特异性改变，常有角化过度，中度乳头瘤样增殖，棘层增厚，电镜显示表皮角质小体数目明显减少。该病主要呈常染色体显性遗传模式，但也有散发病例、常染色体隐性遗传模式的报道。 

间隙连接蛋白31（CX31）是β属间隙连接蛋白，根据分组和发现顺序还可称为GJB3。编码连接蛋白家族的基因组成connexin基因家族，Connexin32基因是第一个被克隆出来的，目前人类基因组中已发现21种 编码connexin的基因且均已成功克隆，小鼠基因组中已发现20种，根据序列的相似程度可将Connexin家族分为α、β和γ三类，Connexin31(CX31)属于β类。Connexin31的基因首次在1991年由Hoh等人从大鼠中克隆出来并证实（Hoh J H，John SA，Revel J P.Molecular cloning and characterization of a new member of the gap junction gene family，connexin-31.J Biol Chem，1991，266(10):6524-6531），该基因以一个单个的拷贝基因形式存在。Connexin31的蛋白结构与Connexin相似，是一种结构相对保守的跨膜蛋白，包含有四个跨膜结构域的α-螺旋肽链(M1-M4)，两个胞外环(E1和E2)和1个胞内环(CL)，位于胞质区的氨基端和羧基端。Connexin的不同导致其表达在的时间和空间上存在着一定的差异，研究证明CX31的表达在人和啮齿类动物的胚胎发育早期就有，成熟后的CX31的分布相对其他Connexin而言要局限，主要在内耳、皮肤组织和肾脏、胎盘、中枢神经和坐骨神经、耳蜗等周围神经系统等（Butterweck A，Elfgang C，Willecke K.Differential expression of the gap junction proteins connexin-45，-43，-40，-31and-26in mouse skin.Eur J Cell Biol，1994，65(1):152-163）。 

CX31能特异性的表达于皮肤组织中，研究发现CX31基因突变中G12R、G12D、R42P、C86S、F137L、L34P、652del12和L209F可导致可变性红斑皮肤角化病（erythrokeratodermia variabilis，EKV）、银屑病。也进一步证实EKV四个家族中与间隙连接蛋白CX31和CX30.3分别编码的GJB3、GJB4致病的突变（Richard G，Smith L E，Bailey R A，et a1.Mutations in the human connexin gene GJB3cause erythrokeratodermia variabilis.Nat Genet，1998，20(4):366-369），即突变改变间隙连接通讯或体外诱导细胞坏死。进一步研究显示，GJB3和GJB4的表达都在表皮棘层和颗粒层，其能影响表皮的分化（Plum A，Winterhager E，Pesch J，et al.Connexin31-deficiency in mice causes transient placental dysmorphogenesis but does not impair hearing and skin differentiation.Dev Biol，2001，231:334-347）。共同发明人张灼华通过多年来对遗传性红斑角化病的研究，发现红斑角化病和银屑病共同的病理机制，即与CX31关联的连接蛋白缺陷和表皮过度增生或风化受阻使其功能异常从而蛋白代谢周期发生改变所致 (Di W L，Monypenny J，Common J E，et al.Defective trafficking and cell death is characteristic of skin disease-associated connexin 31 mutations.Hum Mol Genet，2002，11:2005-2014)。 

银屑病的治疗方案依赖于许多因素。这包括患者疾病的严重程度，疾病对患者生活影响程度以及病人对自己病情的认知。目前对于银屑病的的各种治疗方法大都是缓解或控制病情的进一步发展，但不能根治。由于银屑病有不同类型，而且即便同一类型不同患者的表现也会有很大差别，所以决定治疗方案时必须结合具体情况。根据银屑病的主要发病机制，市场上出现了(1)调节机体免疫药物：糖皮质激素类药物、环孢素A、他克莫司和甲氨蝶呤等；(2)抑制细胞分裂药物：维生素D的衍生物如钙泊三醇、维甲酸类药物如阿维A酯；(3)生物制剂：阿来西普和依发珠单抗、阿达目单抗、依他西普和英芙昔单抗等。 

目前银屑病的治疗目标主要是除去皮肤损害并且防止再次复发。对于轻度银屑病患者一般使用非处方类局部用药物即可。例如糖皮质激素类药物氯倍他索、倍地米松、类维生素A类物质钙泊三醇、他扎罗汀常作为轻度和中度银屑病患者的基础治疗药物。对于银屑病皮损较多的患者需要用全身用药物，例如维生素A类物质、环孢素、甲氨蝶呤等，这些药物仅能够缓解或控制病情的进一步发展，并不能根治；同时，对于可变性红斑角化病，目前临床尚无特效药。可见，现有技术中用于治疗连接蛋白CX31介导的皮肤病的药物疗效不佳。 

发明内容

因此，针对现有技术中用于治疗连接蛋白CX31介导的皮肤病的药物疗效不佳的问题，本发明提供了3-{[2-[3-氧-(1，2-苯并异恶唑-6-基)甲氧基]-5-[(2-羟基-4-环戊氧基苯甲酰基)]苯基}丙酸（I）在制备用于治疗连接蛋白CX31介导的皮肤病的药物中的应用，尤其是在制备用于治疗可变性红斑皮肤角化病或银屑病的药物中的应用。其中，所述化合物I具有下列结构式： 

在上述应用中，所述化合物I的分子式为C₂₉H₂₇NO₈，分子量为517.5266。 

在上述应用中，所述化合物I可以通过参考文献合成的方法制备得到（米泽健治等，CN200780006183.6）。 

本发明还提供了一种用于治疗接蛋白CX31介导的皮肤病，特别是用于治疗可变性红斑皮肤角化病、银屑病的药物组合物，所述药物组合物中包含作为活性成分的化合物I，以及药学上可接受的载体或赋形剂。 

将作为活性成分的化合物I与药学上可接受的载体或赋形剂混合后，按相应的常规药物制剂方法，可以制备可变性红斑皮肤角化病、银屑病的药物。例如，与在口服制剂中可以被接受的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用辅助添加成分混合后，按常规的操作方法和过程，可以制成为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂或多种相应的缓释剂、控释剂等固体口服制剂形式的药物；与常规的增溶剂、乳化剂、润饰剂、起泡或消泡剂等表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等混合后，按相应的常规方法，可以制备成为合剂、糖浆、口服液等液体制剂形式的口服药物；与常规的悬浮剂、稳定剂、分散剂或调节溶液渗透压剂混合，按相应的常规方法，配置成注射剂。上述药物组合物的给药方式包括：口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。 

在上述药物组合物中，作为活性成分的化合物I的有效治疗量为30mg/kg～300mg/kg。 

本发明提供的3-{[2-[3-氧-(1，2-苯并异恶唑-6-基)甲氧基]-5-[(2-羟基-4-环戊氧基苯甲酰基)]苯基}丙酸，可通过抑制与可变性红斑皮肤角化病和银屑病相关的连接蛋白CX31途径来调控银屑病细胞的繁殖与分化，来缓解可变性红斑皮肤角化病、银屑病的临床症状，从而达到治疗连接蛋白CX31介导的皮肤病，以及治疗可变性红斑皮肤角化病、银屑病的目的。 

附图说明

图1为银屑病模型小鼠体重与施药时间、施药种类之间的关系曲线图。 

图2银屑病模型小鼠施药后的表皮示意图。 

图3小鼠血清中细胞因子TNF-α水平与施药种类的关系柱状图。 

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 

1、化学合成部分

1.16-[（2，4-甲氧基苯基）羰基]-香豆素的合成 

将25g6-甲基香豆素和氯代苯（25mL）加入62.5%硫酸（150mL）中，搅拌，升温。在70～90℃下，分8次，加入活性二氧化锰30g，70～90℃滴加62.5%硫酸（19mL）。控制温度在80～90℃，搅拌1h。冷却至室温。加水约150mL，滴加20%氨水43mL，乙酸乙酯100mL，丁酮300mL，滤除固体后，分液，保留有机层。丁酮约200mL洗滤饼，合并有机相，水洗有机相。有机相约350mL，滴加二甲基亚砜15mL，加盐酸8mL，15～40℃下滴加25%的亚氯酸钠溶液，搅拌40min后，加热至65～75℃，热分液，留有机相。加水125mL，滴氨水25mL（常温），分液，留有机相，滴加二甲基亚砜70mL，30～40℃滴加盐酸15mL，升温到65～75℃，滴加盐酸16mL，该温度下搅拌约30min，冷却，静置。析出灰棕色固体，干燥得香豆素-6-甲酸（11.3g，产率38.1%）。 

将2.32g五氧化二磷加入到甲磺酸中（15.7mL），搅拌，加热至75℃，1h后，加入香豆素-6-甲酸（6.1g），氯代苯（6mL），滴加1，3-二甲氧基苯（15.67mL），3h后，冷却，加入乙酸乙酯（150mL）和水（70mL），滴氨水，调节至pH约8。萃取后分液，保留有机层。水层用乙酸乙酯（50mL×2）反萃后，合并有机层，水（30mL）洗，饱和食盐水洗（30mL）。无水硫酸镁干燥溶液，旋蒸除去溶剂。干燥粗重8.5g。加入20mL甲醇， 搅拌，混浊液，加热回流后，热过滤，得到白色固体6-[（2，4-甲氧基苯基）羰基]-香豆素（5.81g，产率57.2%）。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃):δ7.99-7.98(d，1H，J=1.2Hz)，7.96-7.95(d，1H，J=1.2Hz)，7.94-7.93(d，1H，J=1.2Hz)，7.77-7.76(d，1H，J=6.4Hz)，7.49-7.48(d，1H，J=5.6Hz)，7.38-7.37(d，1H，J=2.4Hz)，7.30(s，1H)，6.63-6.61(m，1H)，6.56-6.55(d，1H，J=1.2Hz)，6.51-6.49(d，1H，J=6.4Hz)，3.92(s，3H)，3.73(s，3H)。 

1.23-[2-羟基-5-(2-羟基-4-环戊烷基苯基羰基)-苯基]丙酸甲酯的合成 

吡啶盐酸盐（8.533g），6-（2，4-二甲氧基苯基）香豆素（5.728g），快速加热至回流，2h。冷却，加入乙酸乙酯（100mL），水（50mL），搅拌后，过滤除去沉淀，萃取分液后，留有机相。加入乙酸乙酯（50mL×2），反萃水相。合并有机相，水洗后，饱和食盐水（30mL）洗，无水亚硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂后，得到粗品。硅胶柱纯化，石油醚/乙酸乙酯=3:1，真空干燥后，得到黄色针状晶体6-（2，4-二羟基苯基-羰基）香豆素（7.260g，产率95.2%）。 

向4.6g6-（2，4-二羟基苯基-羰基）香豆素中加入DMF（10mL），碳酸钾（3.153g），溴代环戊烷（3.5mL，4.858g），加热至80℃，装上干燥管，4h后，冷却。加水40mL，乙酸乙酯40mL，萃取分液，保留有机相。乙酸乙酯15mL×2，反萃水相，合并有机相后，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥。旋蒸除去溶剂。硅胶柱纯化，淡黄色针状固体6-(2-羟基-4-环戊基苯基)香豆素（4.4g，产率77.5%）。 

在1.0072g6-(2-羟基-4-环戊基苯基-羰基)香豆素中加入无水甲醇（5mL），30%NaOMe/MeOH(1.38g)，氮气保护，55～65℃，搅拌3h。冷却至室温后，倒入冰过的乙酸乙酯（20mL）中，6M盐酸调节pH至6～7，加入冰水(15mL)，萃取分液。水洗，盐洗，无水硫酸镁干燥。硅胶柱纯化，石油醚/乙酸乙酯=4:1，得到浅黄色长针状固体3-[2-羟基-5-(2-羟基-4-环戊烷基苯基)-苯基]丙烯酸甲酯（1.7365g，产率79.6%）。 

3-[2-羟基-5-(2-羟基-4-环戊烷基苯基)-苯基]丙烯酸甲酯2.82g中加入异丙醇（15mL），醋酸钠（2.8g），醋酸（2.8g），10%Pb/C（0.45g，H2O3mL）（文献产率91.23%），气球封口。45℃搅拌过夜。室温下， 加入硅藻土0.5g，过滤，乙酸乙酯洗洗滤饼。乙酸乙酯/水萃取，盐洗，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去溶剂，得到浅黄色油状物3-[2-羟基-5-(2-羟基-4-环戊烷基苯基)-苯基]丙酸甲酯（2.53g，产率89.3%）。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃):δ12.07(s，1H)，10.4(m，1H)，7.49-7.42(m，3H)，6.92-6.90(d，1H，J=8.0Hz)，4.95-4.85(m，1H)，3.58(s，3H)，2.83(m，2H)，2.61(m，2H)，2.00-1.85(m，2H)，1.80-1.50(m，6H)。 

1.33-{[2-[3-氧-(1，2-苯并异恶唑-6-基)甲氧基]-5-[(2-羟基-4-环戊氧基苯甲酰基)]苯基}丙酸（I）的合成 

2-三苯基甲基-6-溴甲基-1，2-苯并异恶唑-3(2H)-酮(1.5g)，3-[2-羟基-5-(2-羟基-4-环戊烷基苯基)-苯基]丙酸甲酯(1.2g)，碳酸钾(0.431g)，加入丙酮12mL后，加热至回流，5h。冷却至室温后，加水3mL，滴加盐酸溶液约0.3mL，pH调节至6～7，旋蒸除去丙酮溶剂后，加入乙酸乙酯5mL萃取，留有机相；乙酸乙酯3mL×2，萃水相后，合并有机相。有机相用水洗，盐洗，无水硫酸镁干燥。旋蒸除去溶剂。硅胶柱纯化（石油醚/乙酸乙酯=6:1），浅黄色固体，产品质量1.0457g，产率48.3%。 

上步所得产品取0.62g，加入4-甲基-2-戊酮2.5mL，甲醇1.2mL，搅拌成悬浊液，冰浴下滴加0.09mL浓硫酸（用溶剂稍稀释），冰浴下搅拌1h，加水5mL，20%NaOH溶液调pH至7左右，搅拌30min，过滤沉淀。得到浅黄近白色固体，3mL丁酮重结晶，真空干燥箱干燥，产品称重为0.3423g，产率为70.9%。 

上步产物(0.34g)中加入甲醇3mL，室温下滴加12%NaOH溶液1mL，室温下搅拌30min。倒入冰水（3mL）中，6M HCl调节pH到1.5，抽滤得到固体。约0.5mL水洗后，干燥。产品称重0.204g，产率60.0%。1H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ12.04(s，1H)，7.81-7.79(m，1H)，7.68(s，1H)，7.56-7.55(m，2H)，7.47-7.43(m，2H)，7.21-7.19(m，1H)，6.51-6.48(m，2H)，5.42(s，2H)，4.93-4.90(m，1H)，3.34(s，4H)，2.95-2.92(m，2H)，2.61-2.52(m，2H)，1.96-1.95(m，2H)，1.74-1.72(m，4H)，1.62-1.60(m，2H) 

2、细胞药效实验部分

2.1检测原理 

根据特定的信号转导通路建立相应的双荧光素酶报告基因检测细胞模型来进行高通量的药物筛选。报告基因质粒（pAP-1-Luc）上含有萤火虫荧光素酶报告基因（firefly luciferase gene），报告基因由前面的TATA元素和不同顺式作用元素（cis-acting elements）即转录因子的重复转录识别序列（response element）响应元件增强子来控制。针对AP-1重复的转录识别序列为7×(TGACTAA)。 

细胞外的刺激（AP-1的信号转导系统一般采用PMA佛波酯来进行刺激），会激活细胞内的信号分子比如蛋白激酶和磷酸酶。很多信号转导途径在转录因子处汇聚，这些转录因子与不同基因的特殊的增强子结合，并且调节这些基因的转录。信号通路转导的激活可以引起由这些增强子控制的luciferase报告基因的表达水平的变化，从而可以通过报告基因的表达水平的变化来检测信号通路的激活。 

用于进行药物筛选时，主要是将报告质粒进行转染后，用备选化合物对细胞进行处理，通过检测报告基因的表达水平的变化来检测化合物对AP-1信号通路的抑制作用。 

2.2实验步骤： 

（1）复苏并培养HEK293细胞。 

（2）取对数生长期的293细胞进行铺板（1×10⁴细胞/孔），37℃培养箱过夜培养，是细胞贴壁。准备第二天进行转染。 

（3）第二天准备转染的用的DNA混合物，进行细胞转染，过夜孵育。 

（4）弃旧培养基，用含有待筛药物的培养基孵育细胞1h，然后用PMA(10ng/ml)激活细胞，孵育3h。 

（5）然后用双荧光素酶检测系统（promega）进行检测。 

（6）进行实验数据分析。 

2.3实验结果 

所用PMA激活剂浓度为10ng/mL；化合物I药物浓度为50μM时抑制率达90%以上。 

3、动物药效实验

3.1化合物I对Tgcx31小鼠的药效实验 

3.1.1实验材料与方法： 

（1）供试品名称：化合物I(自制，纯度>95%) 

（2）溶剂：PVP K30（Polyvinylpyrrolidone，购自ACROS ORCANICS，批号：227541000，平均分子量58000） 

将200mg聚乙烯吡咯啉酮PVP K30，加水溶解，定容至10ml；然后将15mg化合物I溶解于250μl上述PVP K30水溶液中；再加入250μl蒸馏水，最终得到化合物I含量为30mg/ml的1%PVP K30水溶液。 

（3）Tgcx31小鼠 

实验所使用的Tgcx31小鼠是用FVB/N小鼠通过转基因所获得的CX31转基因小鼠。主要序列变化为#866g CX313’:CTT ATC GTC GTC ATC CTTGTA ATC和#867g CX315’:CCG AGA AGA AAA TCT TCA CC。 

采用雌性Tgcx31小鼠进行药效实验，小鼠饲养在屏障环境中，1笼，其中每笼为1只，12小时/12小时交替光照，温度控制在20～26℃，湿度在40～70%之间。试验前对小鼠进行称重，试验过程中观察每只小鼠的精神状况、耳、尾、指/趾以及体重变化等情况。并按照试验方案要求（给药第0天、7天、14天、28天）分别检测小鼠血常规和部分生化指标以及血清中TNF-α、IL-β、MMP-3三种细胞因子含量的变化。 

3.1.2实验结果： 

表1血常规检测结果表 

表2部分生化指标记录表 

表1和表2的结果表明：与正常小鼠相比，CX31转基因小鼠的白细胞、红细胞、血红蛋白等指标远远低于正常值，用药两周后，Tgcx31小鼠的各项 血常规和部分生化指标接近于正常小鼠，说明化合物I对CX31转基因小鼠有明显的治疗效果。 

3.2化合物I对咪哇莫特诱导银屑病样小鼠模型免疫异常的干预作用 

3.2.1实验材料与方法： 

a)所需药品 

（1）供试品名称：化合物I(自制，纯度>95%) 

（2）溶剂：PVP30（Polyvinylpyrrolidone，购自ACROS ORCANICS，批号：227541000，average M.W58.000，K29～32） 

（3）阳性对照品：阿维A胶囊（重庆华邦制药有限公司生产，商品名称：方希；批准文号：国药准字H20010126；产品批号：2012028；规格：10mg，3×10粒/板/盒） 

（4）咪喹莫特乳膏(湖北科益药业股份有限公司生产，商品名称：丽科杰；批准文号：国药准字H20040285；规格：3g:0.15g；理化性质：白色乳膏) 

b）配制方法：将化合物I溶于2%的PVP30溶液[Yukihiko Aikawa，et al.Treatment of arthritis with a selective inhibitor of c-Fos/activator protein-1，Nature Biotechnology，2008，26(7)，817-823]，后加等体积的蒸馏水充分溶解。分别配制得到30mg/ml、3mg/ml的化合物I高、低浓度溶液。将阿维A胶囊溶于蒸馏水，配制得到1mg/ml溶液。 

c）动物 

48只8-11周龄Balb/c小鼠雌性，由北京军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号：0006548。 

小鼠饲养在屏障环境中，12笼，其中每笼为4只，12小时/12小时交替光照，温度控制在20～26℃，湿度在40～70%之间。小鼠饲料购自北京军事医学科学院实验动物中心；灭菌水，自由饮用。参照《实验动物检疫标准操作规程》(SOP-SY-075)执行，检疫期间观察动物的摄食、饮水和健康状况。健康小鼠的毛色光亮，被毛整洁密实贴身，活泼，眼鼻无分泌物等。 

3.2.2给药途径和剂量 

给药途径：灌胃给药 

给药频率：每天1次 

给药周期：8天 

正常对照组：给予生理盐水，0.01ml/kg小鼠体重；背部均匀涂抹62.5mg凡士林。 

阴性对照组：给予生理盐水，0.01ml/kg小鼠体重；背部均匀涂抹62.5mg5%咪喹莫特乳膏。 

阳性药物组：阿维A溶液，0.01ml/kg小鼠体重；背部均匀涂抹62.5mg5%咪喹莫特乳膏。 

溶剂组：1%PVP30溶液，0.01ml/kg小鼠体重；背部均匀涂抹62.5mg5%咪喹莫特乳膏。 

受试物低剂量组：3mg/ml化合物I溶液，0.01ml/kg小鼠体重；背部均匀涂抹62.5mg5%咪喹莫特乳膏。 

受试物高剂量组：30mg/ml化合物I溶液，0.01ml/kg小鼠体重；背部均匀涂抹62.5mg5%咪喹莫特乳膏。 

3.2.3实验结果 

a）体重监测 

每天定时监测小鼠体重变化。持续给药期间，小鼠体重变化情况，详见图1。由图1可知，阳性药物组小鼠的体重在1-8天之内逐渐下降，与阳性药物组小鼠的体重相比，受试物低剂量组和受试物高剂量组小鼠的体重在1-8天之内下降趋势较为缓慢。 

b)银屑病模型小鼠施药后的表皮对照图 

如图2所示，与阴性对照组、溶剂组、及阳性药物组相比，受试药物化合物I低剂量组、高剂量组小鼠皮肤皮损程度明显减轻。但是与化合物I低剂量组小鼠相比，高剂量组小鼠皮肤略有变薄、易起褶皱等症状。 

C）血清中细胞因子TNF-α水平 

如图3所示，阴性对照组及溶剂组与正常对照组血清中TNF-α含量相比有明显统计学差异（P<0.05）；低剂量组与阴性对照组血清中TNF-α含 量相比也有明显统计学差异（P<0.05）；正常组、低剂量组、阳性药物组血清中TNF-α含量相比无统计学差异（P>0.05）。低剂量的化合物I可以抑制小鼠血清中TNF-α的含量，进而抑制炎症细胞浸润，减轻炎症反应而发挥治疗作用。 

根据上述实施例中的化合物I对Tgcx31小鼠的药效实验，表明：与用药之前相比，用药两周后，Tgcx31小鼠的各项血常规和部分生化指标接近于正常小鼠。同时，化合物I对咪哇莫特诱导银屑病样小鼠模型免疫异常的干预实验可知：化合物I的低剂量组、高剂量组均能明显减轻银屑病样小鼠皮肤的皮损程度；并且，低剂量的化合物I可以抑制小鼠血清中TNF-α的含量，进而抑制炎症细胞浸润，减轻炎症反应，具有很好地治疗银屑病的效果。鉴于此，化合物I可以用于连接蛋白CX31介导的皮肤病中以治疗银屑病。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (6)

1.3-{[2-[3-氧-(1，2-苯并异恶唑-6-基)甲氧基]-5-[(2-羟基-4-环戊氧基苯甲酰基)]苯基}丙酸在制备用于治疗连接蛋白CX31介导的皮肤病的药物中的应用。

2.根据权利要去1所述的应用，其特征在于，所述连接蛋白CX31介导的皮肤病包括可变性红斑皮肤角化病或银屑病。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物包含：3-{[2-[3-氧-(1，2-苯并异恶唑-6-基)甲氧基]-5-[(2-羟基-4-环戊氧基苯甲酰基)]苯基}丙酸、药学上可接受的载体或赋形剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物中3-{[2-[3-氧-(1，2-苯并异恶唑-6-基)甲氧基]-5-[(2-羟基-4-环戊氧基苯甲酰基)]苯基}丙酸的有效治疗量为30mg/kg～300mg/kg。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、合剂、糖浆、口服液、注射剂或它们的组合。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式包括：口服、注射、植入、外用、喷雾、吸入或它们的组合。