CN104535711B - 一种尿素快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿素快速检测试剂盒，其包括试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ和试剂Ⅳ，其中：试剂Ⅰ包括EDTA二钠和海藻糖；试剂Ⅱ为脲酶；试剂Ⅲ包括无水柠檬酸、水杨酸钠和硝普钠；试剂Ⅳ包括氢氧化锂、二氯异氰尿酸钠和无水硫酸钠。本发明的试剂盒和检测方法能够有效屏蔽游泳池水中的铜离子和余氯对检测结果的干扰，量程为0.5~8.0mg/L，测试时间约20min，试剂在室温下保质期长，准确率高、特异性强、稳定性好，方便快捷，适用于游泳池的现场快速检测，测试结果与国标检测方法相近，因此该试剂盒具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种尿素快速检测试剂盒及检测方法，具体涉及一种快速检测游泳池水中尿素浓度的试剂盒及检测方法。
背景技术
相关研究表明，游泳池中的尿素主要来源是人排出的尿液，其中近87%的成分为尿素。除此以外，汗液中也会含有少量尿素。由此可见，正是由于泳池水中尿素的特殊来源渠道，在泳客集中的夏季，泳池负荷大大增加，泳池水中尿素超标的情况频发；而水中尿素含量的多少，也可以作为反应泳池水受污染程度的一项客观指标。至于尿素的危害，实际上，作为人体正常的代谢产物，泳池水中极低浓度的尿素并不会对人体造成直接的致病危害。此外，尿素与消毒剂余氯的直接反应较难以发生，也不会影响消毒剂的消毒效率。但是考虑到尿素依然能够通过反应转化为氨氮，并进一步生成影响消毒效果的氯胺，同时考虑泳客的健康用水心理，也为了避免尿素成为泳池中滋生藻类与细菌的营养氮源，应当对泳池中的尿素浓度进行严格控制，因此，建立一种简单快速的公共场所，特别是游泳池水尿素浓度测定的方法显得尤为重要。
已有一些测定游泳池水中尿素的方法，如：二乙酰一肟-安替比林法，邻苯二甲醛法，OPA法，脲酶-Berthlot法等。其中脲酶-Berthlot法有选择性好、灵敏度高等优点，但该法实际应用时常因游泳池水中加入的抑藻剂硫酸铜和消毒剂余氯导致脲酶变性而严重干扰测定。发明人通过实验证明，余氯对脲酶活性的影响很大，当余氯浓度大于0.1mg/L时即会使脲酶失活。迄今尚未见该法中有效消除Cu2+和余氯干扰的报道。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种尿素快速检测试剂盒及检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种尿素快速检测试剂盒，其包括试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ和试剂Ⅳ，其中：
所述试剂Ⅰ包括EDTA二钠和海藻糖；
所述试剂Ⅱ为脲酶；
所述试剂Ⅲ包括无水柠檬酸、水杨酸钠和硝普钠；
所述试剂Ⅳ包括氢氧化锂、二氯异氰尿酸钠和无水硫酸钠。
作为优选的，所述试剂Ⅰ中，EDTA二钠和海藻糖溶于pH=7.4～7.6的磷酸缓冲溶液中，EDTA二钠的浓度为0.03～0.05g/mL，海藻糖的浓度为0.015～0.025g/mL。
作为优选的，所述试剂Ⅱ中，脲酶用水溶解后，加入丙三醇，配制成浓度为100-150
U/mL的脲酶溶液。
进一步优选的，所述脲酶溶液的浓度优选为100U/mL。
作为优选的，所述试剂Ⅲ中，无水柠檬酸、水杨酸钠和硝普钠的质量比为85：10：5。
作为优选的，所述试剂Ⅳ中，氢氧化锂、二氯异氰尿酸钠和无水硫酸钠的质量比为50：10：40。
作为优选的，所述试剂盒中还包括一标准比色卡。所述标准比色卡的制备方法如下：
1）用纯水配制浓度分别为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.5mg/L、5.0mg/L、8.0mg/L的尿素标准溶液；
2）分别取各浓度的标准溶液10mL至比色瓶中，滴加2滴试剂Ⅰ摇匀；
3）滴加2滴试剂Ⅱ，摇匀，静置5分钟；
4）加入试剂Ⅲ，摇匀，静置2分钟；
5）加入试剂Ⅳ，摇匀，静置15分钟；
6）反应完毕，获得各浓度的尿素标准溶液显色时所呈现的标准色，根据得到的各潘通标准色所列色值采用电脑调色和印制，得到标准比色卡。
以上所述的尿素快速检测试剂盒在检测游泳池水尿素浓度中的应用。
一种快速检测游泳池水中尿素浓度的方法，包括如下步骤：
1）取10mL待检溶液于比色瓶中，加入2～3滴试剂Ⅰ，摇匀；所述试剂Ⅰ是由EDTA二钠和海藻糖溶于pH=7.0～8.0的磷酸缓冲溶液中，，EDTA二钠的浓度为0.03～0.05g/mL，海藻糖的浓度为0.015～0.025g/mL；
2）往步骤1）所得的溶液中加入2～3滴试剂Ⅱ，摇匀，静置1～10分钟；所述试剂Ⅱ是浓度为100-150
U/mL的脲酶溶液；
3）加入试剂Ⅲ，摇匀，静置1～5分钟；所述试剂Ⅲ由质量比为85：10：5的无水柠檬酸、水杨酸钠和硝普钠组成；
4）加入试剂Ⅳ，摇匀，静置10～20分钟，所述试剂由质量比为50：10：40的氢氧化锂、二氯异氰尿酸钠和无水硫酸钠组成；
5）反应完毕后，将反应液置于比色计中测OD值结合标准曲线计算待测溶液中尿素含量，又或者，将比色瓶与比色卡颜色进行比对即可得所测水样尿素浓度mg/L。
本发明的有益效果是：
本发明的试剂盒和检测方法能够有效屏蔽铜离子和余氯对检测结果的干扰，准确率高、特异性强、稳定性好，方便快捷，适用于游泳池的现场快速检测。
附图说明
图1为尿素快速测定试剂盒的标准色卡；
图2为脲酶浓度及酶解时间对吸光度的影响；
图3为EDTA二钠浓度对吸光度的影响；
图4为海藻糖浓度对吸光度的影响；
图5为体系pH对吸光度的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例
1
试剂盒组分
（1）试剂Ⅰ：称取4.0g乙二胺四乙酸二钠与2.0g海藻糖，用pH=7.5的磷酸缓冲液溶解后定容到100mL容量瓶中，摇匀后分装在滴瓶中。
（2）试剂Ⅱ：称取脲酶用去离子水溶解后，再加入丙三醇，配制成100U/mL的脲酶溶液，摇匀后分装在滴瓶中。
（3）试剂Ⅲ：称取34.0g无水柠檬酸、4.0g水杨酸钠、2.0g硝普钠，充分混合后分装成0.10g/包。
（4）试剂Ⅳ：称取20.0g氢氧化锂、4.0g二氯异氰尿酸钠、16.0g无水硫酸钠，充分混合后分装成0.10g/包。
实施例
2
标准比色卡的制备
1）用纯水配制浓度分别为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.5mg/L、5.0mg/L、8.0mg/L的尿素标准溶液；
2）分别取各浓度的标准溶液10mL至比色瓶中，滴加2滴试剂Ⅰ摇匀；
3）滴加2滴试剂Ⅱ，摇匀，静置5分钟；
4）加入1包试剂Ⅲ，摇匀，静置2分钟；
5）加入1包试剂Ⅳ，摇匀，静置15分钟；
6）反应完毕，获得各浓度的尿素标准溶液显色时所呈现的标准色，根据得到的各潘通标准色所列色值采用电脑调色和印制，得到标准比色卡，如图1所示。
实施例
3
试剂盒操作方法
利用本发明试剂盒检测游泳池水尿素浓度的方法，步骤如下：
1）取待检水样10mL至比色瓶中，滴加2滴试剂Ⅰ，摇匀；
2）滴加2滴试剂Ⅱ，轻轻摇匀，静置5分钟；
3）加入1包试剂Ⅲ，轻轻摇匀，静置2分钟；
4）加入1包试剂Ⅳ，轻轻摇匀，静置15分钟；
5）将比色瓶置于比色卡上方1cm空白处，与比色卡颜色进行比对即可得所测水样尿素浓度mg/L。
实施例
4
试剂盒优化
1、脲酶使用浓度与酶解时间的优化
实验条件：C尿素=5.0mg/L；试剂Ⅰ用量0.5mL；试剂Ⅱ用量0.5mL；试剂Ⅲ用量0.1g；试剂Ⅳ用量0.1g。案子试剂盒操作方法进行实验，改变试剂Ⅱ中脲酶的浓度与酶解时间，测定溶液吸光度变化。
如图2所示，脲酶浓度在100-150U/mL之间时，体系吸光度差异不大，之后吸光度又缓慢上升，另外酶解时间在5-15min之间差异也不大，综合考虑，脲酶的最佳浓度为100U/mL，酶解最佳时间为5min。
2、EDTA二钠浓度的优化
实验条件：C尿素=3.5mg/L；CCu 2+=1.0mg/L；试剂Ⅰ用量0.5mL；试剂Ⅱ用量0.5mL；试剂Ⅲ用量0.1g；试剂Ⅳ用量0.1g。按照试剂盒操作方法进行实验，检测不同EDTA二钠浓度对吸光度的影响。
如图3所示，当EDTA二钠浓度3.0%-5.0%之间时，吸光度趋于稳定，同时能够掩蔽Cu2+所造成的干扰，因此EDTA二钠的最佳使用浓度为4.0%。
3、海藻糖使用浓度的优化
实验条件：C尿素=3.5mg/L；C余氯=1.0mg/L；试剂Ⅰ用量0.5mL；试剂Ⅱ用量0.5mL；试剂Ⅲ用量0.1g；试剂Ⅳ用量0.1g。按照试剂盒操作方法进行实验，测定同一尿素浓度下不同海藻糖浓度对吸光度的影响。
如图4所示：当海藻糖浓度在1.5%-2.5%时，吸光度趋于稳定，同时能够掩蔽余氯的干扰，因此海藻糖的最佳使用浓度为2.0%。
4、反应体系pH值的优化
图5为体系pH对吸光度的影响。如图所示，当pH在6.5-7.0之间时，该反应存在最大吸收峰，但是吸光度变化大，不稳定，而pH在7.0-8.0之间的吸光度较稳定，当pH继续升高时，体系吸光度急速下降，所以选用缓冲液pH为7.5。
实施例
5
本试剂盒的稳定性实验
将尿素测定试剂盒置于密实袋中，放置37℃烘箱中，每隔30天观察各试剂外观及进行显色效果测试。测试方法：配制0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.5mg/L、5.0mg/L、8.0mg/L系列尿素标准溶液，按照操作方法依次进行显色，显色完全后观察显色效果，与标准色卡比对。测试结果如表1所示。
表1尿素测定试剂的稳定性
实施例
6
样品加标回收实验
收集不同的样品，采用该方法进行尿素的测试，与国标法进行比对并进行加标回收实验，回收率在97.0~112.0%之间，测试结果如表2所示。
表2实际样品测试与加标回收率实验
注：样品1为小区1游泳池水；样品2为小区2游泳池水；样品3为某学校游泳池水；样品4为某体育馆游泳池水。
以上实验表明，本发明的试剂盒和检测方法能够有效屏蔽铜离子和余氯对检测结果的干扰，准确率高、特异性强、稳定性好，方便快捷，适用于游泳池的现场快速检测。
Claims (9)
1.一种尿素快速检测试剂盒，其包括试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ和试剂Ⅳ，其中：
所述试剂Ⅰ包括EDTA二钠和海藻糖；
所述试剂Ⅱ为脲酶；
所述试剂Ⅲ包括无水柠檬酸、水杨酸钠和硝普钠；
所述试剂Ⅳ包括氢氧化锂、二氯异氰尿酸钠和无水硫酸钠；
其特征在于，所述试剂Ⅰ中，EDTA二钠和海藻糖溶于pH=7.4～7.6的磷酸缓冲溶液中，EDTA二钠的浓度为0.03～0.05g/mL，海藻糖的浓度为0.015～0.025g/mL。
2.根据权利要求1所述的尿素快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂Ⅱ中，脲酶用水溶解后，加入丙三醇，配制成浓度为100-150 U/mL的脲酶溶液。
3.根据权利要求2所述的尿素快速检测试剂盒，其特征在于，所述脲酶溶液的浓度优选为100U/mL。
4.根据权利要求1所述的尿素快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂Ⅲ中，无水柠檬酸、水杨酸钠和硝普钠的质量比为85：10：5。
5.根据权利要求1所述的尿素快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂Ⅳ中，氢氧化锂、二氯异氰尿酸钠和无水硫酸钠的质量比为50：10：40。
6.根据权利要求1-5任一项所述的尿素快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括一标准比色卡。
7.根据权利要求6所述的尿素快速检测试剂盒，其特征在于，所述标准比色卡的制备方法如下：
1）用纯水配制浓度分别为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.5mg/L、5.0mg/L、8.0mg/L的尿素标准溶液；
2）分别取各浓度的标准溶液10mL至比色瓶中，滴加2滴试剂Ⅰ摇匀；
3）滴加2滴试剂Ⅱ，摇匀，静置5分钟；
4）加入试剂Ⅲ，摇匀，静置2分钟；
5）加入试剂Ⅳ，摇匀，静置15分钟；
6）反应完毕，获得各浓度的尿素标准溶液显色时所呈现的标准色，根据得到的各潘通标准色所列色值采用电脑调色和印制，得到标准比色卡。
8.权利要求1-7任一项所述的尿素快速检测试剂盒在检测游泳池水尿素浓度中的应用。
9.一种快速检测游泳池水中尿素浓度的方法，包括如下步骤：
1）取10mL待检溶液于比色瓶中，加入2～3滴试剂Ⅰ，摇匀；所述试剂Ⅰ是由EDTA二钠和海藻糖溶于pH=7.0～8.0的磷酸缓冲溶液中，EDTA二钠的浓度为0.03～0.05g/mL，海藻糖的浓度为0.015～0.025g/mL；
2）往步骤1）所得的溶液中加入2～3滴试剂Ⅱ，摇匀，静置1～10分钟；所述试剂Ⅱ是浓度为100-150 U/mL的脲酶溶液；
3）加入试剂Ⅲ，摇匀，静置1～5分钟；所述试剂Ⅲ由质量比为85：10：5的无水柠檬酸、水杨酸钠和硝普钠组成；
4）加入试剂Ⅳ，摇匀，静置10～20分钟，所述试剂由质量比为50：10：40的氢氧化锂、二氯异氰尿酸钠和无水硫酸钠组成；
5）反应完毕后，将反应液置于比色计中测OD值结合标准曲线计算待测溶液中尿素含量，又或者，将比色瓶与标准比色卡颜色进行比对即可得所测水样尿素浓度mg/L。
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