CN104534979B - 一种多波长相移显微成像系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多波长相移显微成像系统及方法，包括米劳干涉装置，所述米劳干涉装置进一步包括至上而下依次设置的第一显微物镜、第二显微镜、反射镜和平面分光镜，所述准直透镜将白色光源的光扩束，送入分光平板中，所述分光平板一侧设置有米劳干涉装置，另一侧设置有成像透镜，所述成像透镜的后端设置图像接收装置，所述图像接收装置连接图像处理终端，所述图像处理终端连接压电陶瓷控制器，所述压电陶瓷控制器连接压电陶瓷，所述压电陶瓷设置在米劳干涉装置上，所述图像处理终端通过压电陶瓷控制器控制设置在米劳干涉装置上的压电陶瓷发生位移运动，实现获取多波长的干涉条纹信息，所述样品台设置在米劳干涉装置下方。采用本发明能够在紧凑的光路结构中，快速获取并分析物体的表面形貌和结构，获得物体更大范围，更高精度的结构形态。

Description

一种多波长相移显微成像系统及方法

技术领域

本发明涉及光学成像领域，尤其涉及的是一种多波长相移显微成像系统及方法。

背景技术

传统的光学显微镜，只能对微小物体进行二维成像，不能测量生物细胞等微结构的三维形貌；而共焦显微镜虽然分辨率高，但由于要对生物样品做标定，会对其产生影响，不利于无损观测的需要。

全息相位显微测量作为一种显微成像技术，具有无损、同时获取物体强度和相位分布的特点，而活体生物细胞一般为透明结构，因此其相位图像方能提供更多独特的信息。不同于已有的显微成像方法，全息相位测量技术不需要对活体生物样品进行标记、固定等处理就可获得观察对象定量的振幅和相位分布，从而实现对透明生物样品的成像并进行定量分析。此技术还可以实现对生物样品形态的动态监测，继而可能用于获取细胞动态特性、细胞间的相互作用以及细胞对药物的反应等信息，可以为早期医学诊断和药物设计等提供一定的分析评价依据。也可以用于定量测量微光机电系统的表面结构(如：区域轮廓、缺陷孔、突起、裂缝、面形误差等)，为生产加工提供高精度、无损快捷的测量手段，具有广阔的应用前景。

然而这种全息相位测量技术仍然有其局限性，由于该技术光源使用的是单一波长的相干光源，单波长干涉全息图再现的复振幅光场中的解调相位信息是通过计算反正切函数得到的，即所得到的相位都折叠在(-π，π]之间，使得测量范围限制在光源波长的范围内，当光经过物体后产生的光程差大于所用的记录光波波长时，其真实的相位将超出此范围，引起包裹相位的混叠；当物体存在较大形变或者表面形貌复杂时，现有的一些解包裹方法不能很好的求解出包裹相位，将不能得到物体真实的相位信息。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多波长相移显微成像系统及方法，旨在解决现有的全息显微镜结构复杂，采用单波长光源导致包裹相位的混叠，不能得到物体真实的相位信息的问题。

本发明的技术方案如下：

一种多波长相移显微成像方法，其利用米劳干涉装置采集样品信息的全息干涉条纹，并通过彩色图像传感器转换为数字图像；再通过图像处理终端控制压电陶瓷发生位移，使得米劳干涉装置内部两光束的光程差发生变化，从而使光波间发生相移干涉；然后，在短时间里采集多幅干涉全息图，通过计算获取只含有物体信息的重构像。

所述的方法，其中，所述光波间相位干涉具体为包含物体三维信息的物光波与经过米劳干涉装置内的反射镜的参考光波之间发生的干涉。

所述的方法，其中，发生干涉的干涉强度分布计算方法为：

其中，a(x,y)表示干涉全息图的背景强度，b(x,y)为干涉图对比度分布，为待测物光波的相位，为参考相位。

所述的方法，其中，采集四幅全息图，通过计算获取只含有物体信息的重构像的具体方法为：

$\mathrm{\Φ}(x,y)=\arctan \frac{I_4(x,y)-I_2(x,y)}{I_1(x,y)-I_3(x,y)}$

其中，I1,I2,I3,I4分别表示相移量为0，π/2，π，3π/2的4幅全息图。

一种多波长相移显微成像系统，其包括米劳干涉装置、白光光源、准直透镜、分光平板、成像透镜、图像接收装置、图像处理终端、压电陶瓷、压电陶瓷控制器和样品台，所述米劳干涉装置包括至上而下依次设置的第一显微物镜、第二显微镜、反射镜和平面分光镜，所述准直透镜将白色光源的光扩束，送入分光平板中，所述分光平板一侧设置有米劳干涉装置，另一侧设置有成像透镜，所述成像透镜的后端设置图像接收装置，所述图像接收装置连接图像处理终端，所述图像处理终端连接压电陶瓷控制器，所述压电陶瓷控制器连接压电陶瓷，所述压电陶瓷设置在米劳干涉装置上，所述图像处理终端通过压电陶瓷控制器控制设置在米劳干涉装置上的压电陶瓷发生位移运动，实现获取多波长的干涉条纹信息，所述样品台设置在米劳干涉装置下方。

所述的系统，其中，所述图像接收装置为彩色图像传感器。

所述的系统，其中，所述白光光源可替换为多个单色光源组成，所述多个单色光源的光束通过分光棱镜后耦合成多波长光源。

所述的系统，其中，所述白光光源为白光LED光源。

本发明的有益效果：本发明通过多波长干涉测量可以克服单一波长干涉测量中的相位混叠问题，其实质是通过两个单波长下的包裹相位图合成新的相位图，而新相位图相当于一个更大的等效波长所得到的，因此当光经过物体产生跳变的最大光程差小于这个等效合成波长时，将不会出现混叠的包裹相位。

附图说明

图1是本发明中多波长相移显微成像系统示意图。

图2是本发明提供的成像系统另一种实施方式示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。

现有的基于同轴干涉的多波长测量方法结构简单，通常需要对多个波长下的干涉全息图进行分别记录，也就是必须采集多次单波长的干涉条纹图，但是这种方法需要多次采图，每次采图的条件不一样的话必然会对测量的结果带来误差，因此不太实用，市面上没有基于此结构的显微镜产品；基于离轴干涉的测量方法通常要对全息图进行频域分解运算，然后再分别提取、计算出单波长下的包裹相位信息，来得到等效合成波长的相位信息，此离轴干涉系统可以同时采集多波长干涉全息图，但是系统结构、算法较为复杂，典型的产品如瑞士Lyncee Tec公司的R2100和R2200系列。

本发明结合上述两种系统结构的特点，提供了一种基于同轴干涉的多波长相移显微成像方法及系统，对于降低测量系统的复杂性、提高测量精度效果明显。

如图1所示，本发明提供的多波长相移显微成像系统包括米劳干涉显微装置9、白光光源1、准直透镜2、分光平板3、成像透镜10、图像接收装置11、图像处理终端14、压电陶瓷12、压电陶瓷控制器13和样品台8；所述米劳干涉装置包括至上而下依次设置的第一显微物镜4、第二显微镜5、反射镜6和平面分光镜7。所述准直透镜2将白色光源1的光扩束，送入分光平板3中，所述分光平板3一侧设置有米劳干涉显微装置9，另一侧设置有成像透镜10，所述成像透镜10的后端设置图像接收装置11，所述图像接收装置11连接图像处理终端14，所述图像处理终端连接压电陶瓷控制器13，所述压电陶瓷控制器13连接压电陶瓷12，所述压电陶瓷12设置在米劳干涉装置9上，所述样品台8设置在米劳干涉显微装置9下方。

其工作原理为：白光光源1发出的光束经过准直透镜2后，光束得到扩束准直后经过分光平板3进行分光，然后光束进入米劳干涉显微装置9一直经过样品台8反射回来，并携带样品信息的全息干涉条纹经成像透镜10传入图像接收装置11中记录为数字图像，最后通过图像处理终端14进行数值运算和图像处理。其中，所述图像接收装置为彩色图像传感器。

当接收到的图像需要调整时，图像处理终端14驱动压电陶瓷控制器13对压电陶瓷12进行控制，通过控制压电陶瓷12的微小位移，使米劳干涉显微装置9内部透镜的距离发生变化，从而引起两光束的光程差变化，最终产生相移干涉。所述样品台8还可进行三维调节，用于控制聚焦位置。由于米劳干涉显微装置9的使用，使得多波长干涉光路结构更加紧凑，小巧。

对于此同轴干涉全息光路，具体是包含物体三维信息的物光波与经过米劳干涉装置9内的反射镜6的参考光波之间发生的干涉，干涉强度分布可以表示为：

公式1可简写为:

其中(xH,yH)、(x,y)为位置坐标，OR*为物光像(实像)，O*R与其共轭(虚像)，a(x,y)表示干涉全息图的背景强度，也称为零级项，b(x,y)为干涉图对比度分布，为待测物光波的相位，为参考相位。

本发明采用相移的方法来提取待测物光波的相位，通过改变相位构造多个函数方程，从方程组可解出式中各未知量，其中就包含待测相位相移算法有很多种，以本发明中用到的四步相移算法为例，通过压电陶瓷调节参考光相位并在一个周期内采集四幅干涉全息图，每幅图中的参考光相位相差π/2，可消除零级项和共轭项，得到只含有物体信息的重构物光像，从而求得物光场相位，即物体包裹相位：

$\mathrm{\Φ}(x,y)=\arctan \frac{I_4(x,y)-I_2(x,y)}{I_1(x,y)-I_3(x,y)}$ …………公式3

其中，I₁,I₂,I₃,I₄分别表示相移量为0，π/2，π，3π/2的4幅干涉全息图。

同轴光路结合相移技术从多幅相移全息图中提取物光，能很好的消除零级衍射像和共轭像(虚像)部分，解决离轴全息技术中再现像的分离与满足采样条件之间矛盾，而且同轴光路可以记录更大数值孔径全息图，充分利用CCD的空间带宽积，分辨率较离轴高。

结合上述同轴相移技术，针对两个波长干涉图像传感元件采集的光强分布可以表示为：

其中，A1，A2为零级项，B1，B2为调制项。设两波长分别为λ₁，λ₂，对于反射型光路，两单波长相位相减可得合成相位分布：

${\mathrm{\Φ}}_{12}={\mathrm{\Φ}}_1-{\mathrm{\Φ}}_2=4\mathrm{\π}(\frac{1}{{\mathrm{\λ}}_1}-\frac{1}{{\mathrm{\λ}}_2})\·d=\frac{4\mathrm{\π}}{{\mathrm{\λ}}_1{\mathrm{\λ}}_2/|{\mathrm{\λ}}_1-{\mathrm{\λ}}_2|}\·d$ …………公式5

其中等效波长为：d为经过物体的光程，一般情况下为高度信息，显然，等效波长要比任一单波长大，而且两波长的差值越小，等效波长越大。

经过相减后，对于其中的相位跳变进行相位补偿，以得到等效波长下的正确合成相位：

Φ₁₂＝Φ₁₂+2π(Φ₁₂＜0)………公式6

由于等效波长的倒数等于两个单波长的倒数差，通过选取彩色图像传感器CCD记录的三色波长中的两个，使得等效波长大于光经过物体产生的最大光程差，相位图将不再出现包裹，即可得到物体正确的相位分布。通过相位我们可以得知物体的三维形貌等信息，如反射式光路物体的高度：

$d=\frac{{\mathrm{\Φ}}_{12}{\mathrm{\λ}}_{\mathrm{eq}}}{4\mathrm{\π}}$ ………公式7

该系统的关键在于多波长光源，高性能彩色图像传感器与压电陶瓷的结合使用，使得压电陶瓷运动一次，即可由彩色图像传感器采集多波长的干涉条纹信息，经过电脑主机分离出RGB三色波长的干涉图信息，再结合多波长相移测量技术，在简化结构的同时能实现多波长相移干涉全息的测量。我们从中提取出多个波长的相位即可恢复出等效波长下的物体三维形貌，实现强度与相位的同时测量。

参见图2，本发明提供的多波长相移显微成像系统技术可采用另一种实施方案为：所述白光光源可替换为多个单色光源，第一单色光源1-1，第二单色光源1-2……，准直透镜更换为第一准直透镜2-1，第二准直透镜2-2……，多个光源的光束经过第二分光平板15和分光棱镜16后耦合在一起。实现多波长测量。

本发明提供的方法及系统适用对象不仅为生物细胞、微光机电系统的测量，也适用于其他微小结构的物体显微测量。

结构简便的多波长相移显微成像系统及方法，使之能够快速分析物体的表面形貌和结构，更加精确地获得物体的结构形态。本发明通过多波长干涉测量可以克服单一波长干涉测量中的相位混叠问题，其实质是通过两个单波长下的包裹相位图合成新的相位图，而新相位图相当于一个更大的等效波长所得到的，因此当光经过物体产生跳变的最大光程差小于这个合成波长时，将不会出现混叠的包裹相位。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种多波长相移显微成像方法，其特征在于，利用米劳干涉装置采集样品信息的全息干涉条纹，并通过彩色图像传感器转换为数字图像；再通过图像处理终端控制压电陶瓷发生位移，使得米劳干涉装置内部两光束的光程差发生变化，从而使光波间发生相移干涉；然后，在短时间里采集多幅干涉全息图，通过计算获取只含有物体信息的重构像；所述光波间相位干涉具体为包含物体三维信息的物光波与经过米劳干涉装置内的反射镜的参考光波之间发生的干涉，具体方法步骤如下：

使用彩色图像传感器采集的两个单波长的光强分布可以表示为：

其中，A1，A2为零级项，B1，B2为调制项；设两单波长分别为λ₁，λ₂，对于反射型光路，两单波长相位相减可得合成相位分布：

其中等效波长为：d为经过物体的光程，为高度信息，等效波长比任一单波长大，而且两单波长的差值越小，等效波长越大；

经过相减后，对于其中的相位跳变进行相位补偿，以得到等效波长下的正确合成相位：

Φ₁₂＝Φ₁₂+2π(Φ₁₂＜0)………公式3

由于等效波长的倒数等于两个单波长的倒数差，通过选取彩色图像传感器记录的三色单波长中的两个，使得等效波长大于光经过物体产生的最大光程差，相位图将不再出现包裹，即可得到物体正确的相位分布。

2.一种多波长相移显微成像系统，其特征在于，包括米劳干涉装置、白光光源、准直透镜、分光平板、成像透镜、图像接收装置、图像处理终端、压电陶瓷、压电陶瓷控制器和样品台，所述米劳干涉装置包括至上而下依次设置的第一显微物镜、第二显微镜、反射镜和平面分光镜，所述准直透镜将白色光源的光扩束，送入分光平板中，所述分光平板一侧设置有米劳干涉装置，另一侧设置有成像透镜，所述成像透镜的后端设置图像接收装置，所述图像接收装置连接图像处理终端，所述图像处理终端连接压电陶瓷控制器，所述压电陶瓷控制器连接压电陶瓷，所述压电陶瓷设置在米劳干涉装置上，所述图像处理终端通过压电陶瓷控制器控制设置在米劳干涉装置上的压电陶瓷发生位移运动，实现获取多波长的干涉条纹信息，所述样品台设置在米劳干涉装置下方；所述图像接收装置为彩色图像传感器：利用米劳干涉装置采集样品信息的全息干涉条纹，并通过彩色图像传感器转换为数字图像；再通过图像处理终端控制压电陶瓷发生位移，使得米劳干涉装置内部两光束的光程差发生变化，从而使光波间发生相移干涉；然后，在短时间里采集多幅干涉全息图，通过计算获取只含有物体信息的重构像；所述光波间相位干涉具体为包含物体三维信息的物光波与经过米劳干涉装置内的反射镜的参考光波之间发生的干涉，具体方法步骤如下：

使用彩色图像传感器采集的两个单波长的光强分布可以表示为：

其中，A1，A2为零级项，B1，B2为调制项；设两单波长分别为λ₁，λ₂，对于反射型光路，两单波长相位相减可得合成相位分布：

其中等效波长为：d为经过物体的光程，为高度信息，等效波长比任一单波长大，而且两单波长的差值越小，等效波长越大；

经过相减后，对于其中的相位跳变进行相位补偿，以得到等效波长下的正确合成相位：

Φ₁₂＝Φ₁₂+2π(Φ₁₂＜0)………公式3

由于等效波长的倒数等于两个单波长的倒数差，通过选取彩色图像传感器记录的三色单波长中的两个，使得等效波长大于光经过物体产生的最大光程差，相位图将不再出现包裹，即可得到物体正确的相位分布。

3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于，所述白光光源可替换为多个单色光源组成，所述多个单色光源的光束通过分光棱镜后耦合成多波长光源；所述白光光源为白光LED光源。