CN104531749B - 一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，首先应确定欲修饰的基因数目N，然后将各个基因的CDS区分别引入pOE‑1至pOE‑N中，同时也可以将每个基因对应的shRNA序列分别引入pSH‑1至pSH‑N中。通过将pOE‑1至pOE‑N和pDV‑N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出N个基因串联过表达的最终质粒；或者将pSH‑1至pSH‑N和pDV‑N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出N个基因同时knock‑down的最终质粒；同样的，也可以选择其中几个基因的过表达质粒和另外基因的knock‑down质粒和pDV‑N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出既含有多个基因过表达，同时将另一些基因knock‑down的最终载体。与现有技术相比，本发明的构建过程一步式，过程简便，效率高，同时可对多个目的基因进行任意组合。
Description
技术领域
本发明涉及一种一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，属于真核细胞水平基因功能分析技术领域。
背景技术
真核细胞多基因修饰载体构建一般需要多步骤进行，方法繁琐。
目前商业化的相似产品主要包括Clontech公司的In-fusion试剂盒与NEB公司的Gibson组装试剂盒，两种产品仅提供连接反应体系，用户需要自己准备载体体系而且两个公司的反应体系存在下列限制：
1)需要进行长片段的PCR扩增，从而使得最终构建的多基因表达载体容易产生突变；
2)两种方法均需要额外合成多条引物，并且增加了PCR扩增、产物胶回收等步骤，既增加了额外费用，又较繁琐；
3)两种方法构建的载体需要特异的感受态细胞进行转化，不适用实验室普通感受态细胞，需要额外进行购置。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种广泛应用于真核细胞水平基因功能分析实验的一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，包括以下步骤：
1)构建过表达质粒：
1.1)确定欲过表达的基因个数为N，所述的N为大于1的正整数，下同；；
1.2)将欲过表达的N个基因的CDS区按顺序分别插入到N个质粒pOE-1、pOE-2直到pOE-N中，并转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养；
1.3)使用定点突变的方法将基因CDS中的BsaI位点进行突变，同时保证其所编码的氨基酸不变；
1.4)使用菌落PCR筛选出阳性克隆子并扩增；
1.5)分别提取N个质粒，并将质粒浓度调整到200ng/μl；
2)构建敲低质粒：
2.1)确定欲敲低的基因个数为N；
2.2)将欲敲低的N个基因的shRNA oligo按顺序分别引入到N个质粒pSH-1、pSH-2直到pSH-N中，并转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养；
2.3)挑选3个克隆子，并测序验证，并将质粒浓度调整到200ng/μl；
3)构建过表达和敲低混合质粒：
3.1)将欲过表达的基因的CDS或欲敲低的基因的shRNA oligo分别引入pOE质粒和pSH质粒中，例如，欲过表达第1、3和5号基因，而欲敲低第2、4和6号基因，则将第1、3和5号基因的CDS区域分别引入pOE-1、pOE-3和pOE-5中，而将第2、4和6号基因的shRNA oligo引入到pSH-2，pSH-4和pSH-6中；
3.2)通过测序和菌落PCR验证序列的正确性，并将BsaI位点进行突变，并将质粒浓度调整到200ng/μl；
4)按体积比，在离心管中顺序加入如下样品：
本步骤中，如果只需对第1、2、4和5号基因进行修饰，则第三号位置使用pBL-3进行填充即可，其余以此类推。
5)将步骤4)混合体系混匀后置于PCR仪中，进行加热反应，加热反应的程序为：37℃加热5min，然后20℃加热5min，进行20个循环后，再继续37℃加热5min，之后升温到80℃加热20min；
6)反应结束后，取出反应物，并加入ATP和PlasmidSafe DNase，其中，反应产物、ATP与PlasmidSafe DNase体积比为16∶2∶2；
7)步骤6)所得体系在37℃条件下孵育1小时，然后将反应产物转化入感受态细胞中，并涂布于含有IPTG和X-gal的kana平板上，37℃孵育过夜；
8)第二天，挑取3个蓝色菌落进行扩增；
9)第三天，提取质粒并鉴定。
所述的pDV-N质粒浓度为25ng/μl，所述的ATP浓度为10mM。
本发明中，N为1～10，即本发明中共包含40个质粒，其中质粒pOE-1～pOE-10(pOE质粒均包含有一个CMV启动子、一个多克隆位点、一个bGH polyA序列、一个ori复制区和一个四环素抗性基因，并且两个BsaI位点分别位于CMV启动子上游和bGH polyA序列下游；pOE-1～pOE-10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同)用于基因的过表达，pSH-1～pSH-10(pSH质粒均包含有一个U6启动子、一个多克隆位点、一个ori复制区和一个四环素抗性基因，两个BsaI位点分别位于U6启动子上游和下游；pSH-1～pSH-10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同)用于基因的敲低(knock-down)，pBL-1～pBL-10(pBL质粒均包含有一段100bp的非编码stuffer序列、一个多克隆位点、一个ori复制区和一个四环素抗性基因，两个BsaI位点分别位于非编码stuffer序列的上游和下游；pBL-1～pBL-10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同)用于填补位置空缺，pDV-1～pDV-10(pDV质粒均包含有一个CMV启动子、一个EGFP编码序列、一个SV40 polyA序列、一个SV40启动子、一个NeoR/KanaR序列、一个ori复制区和一个lacZ基因，两个BsaI位点分别位于lacZ基因的上游和下游；pDV-1～pDV-10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同)为最终目的载体。
本发明在使用时，首先应确定欲修饰的基因数目(N)，然后将各个基因的CDS区分别引入pOE-1至pOE-N中，同时也可以将每个基因对应的shRNA序列分别引入pSH-1至pSH-N中。通过将pOE-1至pOE-N和pDV-N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出N个基因串联过表达的最终质粒；或者将pSH-1至pSH-N和pDV-N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出N个基因同时knock-down的最终质粒；同样的，也可以选择其中几个基因的过表达质粒和另外基因的knock-down质粒和pDV-N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出既含有多个基因过表达，同时将另一些基因knock-down的最终载体；相应的，如果欲更改组合的数量，至需要使用pBL质粒代替掉相应序号的过表达或knock-down质粒即可。
由于本体系pDV质粒含有GFP和NeoR序列，所以最终构建好的目的载体可以使用荧光显微镜进行实时监测，同时也可以使用G418进行稳株的筛选。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)将多个基因的过表达载体或敲低载体或过表达/敲低组合载体的构建过程一步式，过程简便，效率高。
(2)可对多个目的基因进行任意组合。
(3)该载体广泛适用于实验室普通感受态细胞的转化。
(4)该载体体系包含绿色荧光蛋白和药物筛选标记，适合实时鉴别和稳定细胞株的构建。
附图说明
图1为实施例1中多基因载体酶切图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例所用材料如下：
BsaI-HF(NEB，R3535S)
NEBuffer4(NEB，B7000S)
BSA(10倍稀释，包含在NEBuffer4中)
T7 DNA ligase(NEB，M0318S)
PlasmidSafe DNase(Epicentre，E3105K)
ATP(10mM，包含在PlasmidSafe DNase中，需要2.5倍稀释)
将GATA4、Mef2c、Tbx5、Hand2、Nkx2.5的CDS引入pOE-1、pOE-2、pOE-3、pOE-4和pOE-5中，使用定点突变的方法将所有CDS中的BsaI位点进行突变，但不改变基因编码的氨基酸序列。五个构建好的质粒分别命名为pOE1-GATA4、pOE2-Mef2c、pOE3-Tbx5、pOE4-Hand2和pOE5-Nkx2.5。
提取五个质粒并使用Nanodrop测定浓度，然后将每个质粒的浓度调整为200ng/μl。
向一个0.2ml离心管中加入如下试剂：
| pOE1-GATA4 | 1μl |
| pOE2-Mef2c | 1μ1 |
| pOE3-Tbx5 | 1μl |
| pOE4-Hand2 | 1μl |
| pOE5-Nkx2.5 | 1μl |
| pDV5质粒(25ng/μl) | 2μl |
| H2O | 5μl |
| NEBuffer 4(10×) | 2μl |
| BSA(10×) | 2μl |
| ATP(10mM) | 2μl |
| BsaI-HF | 1.5μl |
| T7 DNA ligase | 0.5μl |
使用移液器将上述成分充分混匀并置于PCR仪中，进行如下循环：
上述反应结束后，从中取出16μl反应产物，并加入ATP和PlasmidSafe DNase：
| 反应产物 | 16μl |
| ATP(10mM) | 2μl |
| PlasmidSafe DNase | 2μl |
将上述成分混合均匀后，在37℃条件下孵育1h。
孵育结束后，将2μl反应产物转化入100μl感受态细胞中，并涂布于含有IPTG和X-gal的kana平板上，37℃孵育过夜。
第二天，挑取六个蓝色菌落，扩大培养。
第三天，首先对阳性克隆进行物理图谱分析，构建出的最终过表达载体使用AflII内切酶进行酶切，然后在1％琼脂糖凝胶中电泳分离。获得了预期的酶切图谱，见图1，图1中两条DNA条带分别代表引入的5个过表达基因序列(13Kb)和pDV5载体部分(2.4Kb)；六个克隆的酶切图谱与预期图谱吻合。M：DNA marker；pDV5-GMTHN：多基因过表达载体；进一步选取其中三个质粒进行测序分析。
测序结束后，经序列拼接和比对，所有五个CDS都成功引入pDV5质粒中并且顺序也与预期结果相同。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建过表达质粒：
1.1)确定欲过表达的基因个数为N；
1.2)将欲过表达的N个基因的CDS区按顺序分别插入到N个质粒pOE-1、pOE-2直到pOE-N中，并转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养；
1.3)使用定点突变的方法将基因CDS中的BsaI位点进行突变，同时保证其所编码的氨基酸不变；
1.4)使用菌落PCR筛选出阳性克隆子并扩增；
1.5)分别提取N个质粒；
2)构建敲低质粒：
2.1)确定欲敲低的基因个数为N；
2.2)将欲敲低的N个基因的shRNA oligo按顺序分别引入到N个质粒pSH-1、pSH-2直到pSH-N中，并转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养；
2.3)挑选3个克隆子，并测序验证；
3)构建过表达和敲低混合质粒：
3.1)将欲过表达的基因的CDS或欲敲低的基因的shRNA oligo分别引入pOE质粒和pSH质粒中；
3.2)通过测序和菌落PCR验证序列的正确性，并将BsaI位点进行突变；
4)按体积比，在离心管中顺序加入如下样品：
5)将步骤4)混合体系混匀后置于PCR仪中，进行加热反应；
6)反应结束后，取出反应物，并加入ATP和PlasmidSafe DNase，其中，反应产物、ATP与PlasmidSafe DNase体积比为16:2:2；
7)步骤6)所得体系在37℃条件下孵育，然后将反应产物转化入感受态细胞中，并涂布于含有IPTG和X-gal的kana平板上，37℃孵育过夜；
8)第二天，挑取3个蓝色菌落进行扩增；
9)第三天，提取质粒并鉴定；
所述的N为大于1的正整数，
pOE质粒均包含有一个CMV启动子、一个多克隆位点、一个bGH polyA序列、一个ori复制区和一个四环素抗性基因，并且两个BsaI位点分别位于CMV启动子上游和bGH polyA序列下游；pOE-1～pOE-10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同，其中质粒pOE-1～pOE-10用于基因的过表达；
pSH质粒均包含有一个U6启动子、一个多克隆位点、一个ori复制区和一个四环素抗性基因，两个BsaI位点分别位于U6启动子上游和下游；pSH-1～pSH-10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同，pSH-1～pSH-10用于基因的敲低；
pBL质粒均包含有一段100bp的非编码stuffer序列、一个多克隆位点、一个ori复制区和一个四环素抗性基因，两个BsaI位点分别位于非编码stuffer序列的上游和下游；pBL-1～pBL-10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同，pBL-1～pBL-10用于填补位置空缺；
pDV质粒均包含有一个CMV启动子、一个EGFP编码序列、一个SV40polyA序列、一个SV40启动子、一个NeoR/KanaR序列、一个ori复制区和一个lacZ基因，两个BsaI位点分别位于lacZ基因的上游和下游；pDV-1～pDV-10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同，pDV-1～pDV-10为最终目的载体。
2.根据权利要求1所述的一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，其特征在于，所述的过表达质粒、敲低质粒或过表达和敲低混合质粒提取后，将质粒浓度调整到200ng/μl。
3.根据权利要求1所述的一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，其特征在于，所述的pDV-N质粒浓度为25ng/μl，所述的ATP浓度为10mM。
4.根据权利要求1所述的一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，其特征在于，步骤5)中，进行加热反应的程序为：
37℃加热5min，然后20℃加热5min，进行20个循环后，再继续37℃加热5min，之后升温到80℃加热20min。
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| "Golden Gate"克隆法构建靶向载体;梁龙等;《中国生物工程杂志》;20131231;摘要，1.2.3节，2.2节 * |
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